Способ получения иммобилизованного трипсина

Способ получения иммобилизованного трипсина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

И. Янкевич, Л. В. Пономарева, В. Г. шмелева" .". .! 33 " Д„ 2:. и В. И. Яковлев П °

1 " " --::.-.-::=,.;.--.

r, °

Ленинградский ордена Октябрьской Революции„ и общи,;.»„;;.„:

Трудового Красного Знамени технологический -мыалахух.. им. Ленсовета (72) Авторы нзобретеии я (7l) Заявитель (4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИОБИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИНА

Изобретение относится к ферментной технологии и может быть использовано. для получения ферментных производных на основе трипсина.

В медицинской практике широко используется трипсин, выделяемый из поджелудочной, железы крупного рогатого скота, для лечения ран и ожогов заболеваний кишечно-желудочного тракю та. Действие . этого препарата крат": ковременно, так как он в организме человека сразу подвергается действию литических и протеолитических ферментов.

Пролонгация действия фермента возможна при использовании иммобилизованных форм.

Известен способ получения иммоби-: лизованного трипсина связыванием фер-щ мента с поликремниевой кислотой, взятой в форме золя с дальнейшей коагу-ляцией золя до стадии гидрогеля и грануляцией (1 3.

Недостатком данного способа, ограничивающим практическое применение, полученного иммобилизованного фермента, является то, что целевой продукт получают в форме сильно оводнейных гидросиликагелей, имеющих малую твердость и большой объем. Активность препарата по низкомолекулярному син" тетическому субстрату - бензол- аргининэтиловому эфиру (ВАЕЕ}.составляет 65 ..

Наиболее близким к изобретению по технической сущностй является способ . получения иммобилизованного трипсина путем введения фермента в золь поли-. кремниевой кислоты с последующей быстрой коагуляцией золя в гидрогель и дегидратацией полученного продукта до ксеросиликагеля. В указанном способе отмечается сохранение активнос" ти по низкомолекулярному субстрату (ВАЕЕ) до 343 от активности нативного фермента и полная потеря актив99455 ности по высокомолекулярному субстра" ту (2 g.

Это является следствием стеричес" ких затруднений диффузии высокомолекулярных субстратов в геле.

Недостатком известного способа являются отсутствие активности по высокомолекулярному субстрату получаемого данным способом иммобилизованного трипсина и невозможность использова- 1g ния его в конкретных технологических процессах.

Цель изобретения - сохранение активности иммобилизованного трипсина по высокомолекулярному субстрату. д

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованного трипсина, заключающемуся в связывании фермента с поликремниевой кислотой с последующей дегидратацией продукта, поликремниевую кислоту используют в форме гидрогеля, процесс ведут в присутствии ионов кальция, а дегидратацию осуществляют в течение 6-8 ч до остаточ- ной влажности 12-15/.

Проведение процесса в присутствии ионов кальция стабилизирует активность получаемого продукта, а spew дегидратации 6-8 ч, обеспечивает именно такую скорость обезвоживания препарата, которая приводит к медленному структурированию гидрогеля и прочному закреплению фермента в нем.

Предлагаемый способ позволяет

35 получить ферментный,препарат, сохраняющий активность до 20/, по высокомолекулярному субстрату (казеину) от активности нативного фермента, стабильный при хранении за 90 сут . хранения при +4 С он потерял 153 своей первоначальной активности, время его полужизни (время, характеризующее активное действие фермента на субстрат)С 2 = 34 ч.

Синтез гидрогеля силикагеля осуществляется нейтрализацией водного раствора силиката натрия смесью минеральных кислот до величины рН 4,0 с последующей коагуляцией золя в гидрогель в течение 2 ч и промывкой

50 полученного носителя дистиллированной водой до отсутствия хлор-ионов в промывных водах.

6 ф

Получение ферментного препарата осуществляется при контакте раствора .энзима и гидрогеля в течение 14-16 ч в присутствии ионов кальция с последующим высушиванием полученного препарата до влажности 12-154.

Пример 1. 25 r гранулированного гидрогеля силикагеля заливают

25 мл раствора трипсина концентрацией 5 10 г/мл в фосфатном буфере

0,05 м рН 7,6,содержащем 10 М раствор хлорида кальция. Фиксирование осу ществляется при g. С в течение 14 ч при легком перемешивании. Далее кон тактный раствор сливают, препарат денатрируют при 37 С в течение 6 ч при вентиляции до остаточной влажности 153, промывают фосфатным буферным раствором и сушат. Хранят полученные препараты в холодильнике. Активность по казеину полученных образцов составляет 203 от активности фермента, взятого для иммобилизации, и колеблется

s пределах 10-15 ПЕ/г сухого .носителя.

Пример 2. Аналогично примеру

1 получают гидрогель силикагеля с фиксированным ферментом. Полученный препарат дегидратируют при 37 С в течение 8 ч при вентиляции до остаточной влажности 123. Промывают фосфатным буферным раствором и сушат. Хранят в холодильнике.

Для исследования пролонгирующих свойств иммобилизованного трипсина

2 r полученного сухого препарата обрабатывают в течение 1 ч моделью желудочного сока раствор пепсина при рН 2,4 ). Далее определяется остаточная протеолитическая активность на носителе, она составляет 533 от активности необработанного препарата.

Эти данные свидетельствуют о том, что трипсин лишь частично разрушается под действием желудочного сока.

Стабильность полученного препарата в процессе гидролиза субстрата при

30 С на порядок выше стабильности нативного фермента. Она составляет

34 ч, что соответствует периоду действия при его использовании.

В таблице приведены свойства ферментного препарата в сравнении с прототипом и нативным ферментом.

-. 994556

Стабильность при протеол (Г1/2 ) Активность,3 от нативного

Фермента (по казеину) Стабильность при хранении

Пролонгация, от исходной активности

Препарат

Нативный фермент

100

3,1

Не стабилен

Фермент включенный в золь (прототип) Стабилен

Фермент, включенный в гидрогель

34

Стабилен

Формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Техред С.Мигунова Корректор И ° 10улла

Редактор M. Дылын

Заказ 565/7 Тираж. 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, И-35, Раушская наб., д.. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Из данных таблицы. видно, что включение трипсина в структуру гидрогеля силикагеля позволяет получить активные препараты прологниро ванного действия. Условия процесса иммобилизации исключают применение химических реагентов и тем самым какое-либо модифицирование белка.

Предлагаемый метод позволяет. получить препараты, сохранение активности которых по высокомолекулярному субстрату достигает 203, что является высоким показателем для препара тов, полученных методом включения в гель. Включение в структуру предохраняет препарат от действия других литических энзимов и микроорганизмов.

Инертность и нетоксичность носителя делает возможным использование препарата в медицине.

Препараты, полученные методом включения в структуру геля являются дешевыми и удобными в обращении. Дешевизна полученных препаратов определяется стоимостью исходных реагентов.

Способ получения иммобилизованного трипсина путем связывания Фермента с поликремниевой кислотой с последующей дегидратацией продукта, отличающийся тем, что, с целью сохранения активности иммобилизованного трипсина по высокомолекулярному субстрату, поликремниевую кислоту используют в форме гидрогеля, процесс ведут в присутствии ионов кальция, а дегидратацию осуществляют в течение 6-8 ч до остаточной влажности 12- 1 /.

Источники информации, принятые во внимание, при экспертизе.

1. Патент Великобритайии

11 1267685,кл. С H 3, опублик. 1972.

2. P. Johnson, Т.L.Mhateley "Оп

the Use of Polymeriging Silica Уе) зузйешз for the Immobilization of

Trypsln" J. of Colland interface

Science, 1971, vol. 37. :N 3 557-563 °