Способ получения полипептидов

Способ получения полипептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

„„SU;„, 997298 A

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСтичЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ

С:

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2786602/28-13 (22),06 ° 07,79 (46) 07.12.84. Вюл. Р 45 (72) Ю.И.Лопухин, P.Â.Петров, В.Я,Арион, ft).Н.Бреусов, Т.В.Гладышева, И.В.Савина, В.B,Ëåáåäåâ, С.С.Кирзон и Е.Ф.Иванушкин (71) 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова (53) 615.45.611.438 (088.8) (56) 1. Нсорег S.À. et al. "Purification апй properties of bovine thymosin", Am. N.З.Асаа. Sci., 249, 125, 1975. (54)(57". СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИ,ЦОВ путем гомогенизации измельчейнои ткани железы тимуса в растворе хлористого натрия, центрифугирования, нагревания, удаления осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, растворения ацетонового осадка в фосфатном буфере, высаливания сернокислым аммонием с последующей- ультрафильтрацией,.обессоливанием на сефадексе и лиофилизацией, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью получения целевого продукта, обладающего противоопухолевой активностью, гомогенат выдерживают в течение 12-.

16 ч, после высаливания ультрафильтрацию осуществляют через мембрану с номинальным удержанием по глобулярным белкам 12,000-30,000 дальтон,. затем проводят гельхроматографию на сефадексе при рН 6,8-8,2 и перед лио-щ филизацией выделяют продукт с молекулярной массой 1,500-6,000 дальтон.

997298

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности, а именно к технологии получения веществ иэ животного сырья.

Известен способ получения полипептидов путем гомогениэации измельченной ткани железы тимуса в растворе хлористого натрия, центрифугирования, нагревания, удаления осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, растворения ацетонового осадка в фосфатном буфере, высаливания сернокислым аммонием с последующей ультрафильтрацией, обессоливанием на сефадексе и лиофилизацией. Полученное вещество не попучило широкого практического применения ввиду недостаточной выраженности терапевтического эффекта (1 3.

Отсутствие постоянного терапевти» ческого эффекта связано с малой биологической активностью полипептидов и неоднородностью по физико-химическим свойствам.

Молекулярная масса данного вещества, определенная методом гельхроматографии, составляет.1,20017 000 дальтон, что указывает на присутствие большого количества примесных соединений.

Целью изобретения является получение полипептидов, обладающих противоопухолевой активностью.

Эта цель достигается тем, что измельченное сырье железы гомогенизируют в растворе хлористого натрия, выдерживают в течение 12-16 ч, riocле высаливания ультрафильтруют через мембрану с номинальным пределом удержания по глобулярным белкам 12,000-30,000 дальтон, гель-хроматографируют на сефадексе в буфере, рН 6)8-8,2 с ионной силой 0,1-.0,4 М натрий хлор или калий хлор и выделяют целевой продукт с молекулярной массой 6,000-1,500 дальтон.

Пример. 500 г свежезамороженного тимуса телят (-20 С! очищают от капсулы и измельчают с помощью размельчителя тканей PT-1 при

8000,об/мин в .течение 3 мин. Гомогенизируют в 0,14 М растворе хлористого натрия в соотношении 1:3 и выдерживают в течение 16 ч при 4 С. Водонерастворимый материал удаляют цент рифугированием при 20000 в течение 2 ч. Полученный супернатант в объеме около 1,5 л нагревают при

80 С в течение 15 мин на водяной ба не. Денатурированные термолабильные компоненты удаляют после охлаждения центрифугированием при 2000 в течение 1 ч. Супернатант (объем около 1,35 л ) обрабатывают пятикратным объемом ацетона,,охлажденным до

-20 С. Выпавший осадок промывают ацетоном, декантируют и сушат в вакууме.

Сухой ацетоновнй осадок растворя ют в 100 мл 10 мм натрийфосфатного буфера рН 7,0 при непрерывном перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием при

16 000 в течение 40 мин. В получен,ном супернатанте определяют концентрацию белка по биуретовому методу, доводят концентрацию белка до

10 25 мг/мл, причем конечный объем смеси составляет 119 мл. К этому раствору добавляют 39,6 мл раствора сульфата аммония, насыщенного при 4 С и рН 7,0. Смесь перемешивают в течение

15 1 ч при 4 С. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием при

16000 . Супернатант подкисляют уксусной (10%-ной) кислотой до рН 4,7, Объем смеси составляет 170 мл. К смеси при непрерывном помешивании добавляют 24,82 г сульфата аммония, перемешивание продолжают в течение

1 ч при 4 С. Осадок собирают центрифугированием при 16000, растворяют .в 80 мл 10 мМ Трис- НСЕ, рН 8,0 и повторно осаждают добавлением 80 мл насыщенного при 4 C раствора сульфата аммония. Осадок вновь собирают центрифугированием, растворяют в

10 мМ Трис- НС0, рН 8,0. Полученный раствор (объем — 140 мл, конц. бел ка 10 мг/мл уподвергают ультрафильтрованию через мембрану "Pellicon

PSED (Millipore)" на аппарате "СНстема-90 мм" при 4 С под давлением азота 3,5-4 атм. Дополнительную промывку осуществляют 10 мМ Трис- НОВ, рН 8,0 (3 порции по 150 мл). Объем и концентрация белка для фильтрата и фракции, задержанной фильтром, 40 составляет соответственно 510 мл, )0,7 мг/мл и 86 мл, 12 мг/мл, Фракции обессоливают и лиофилизируют.

Минимальная активная доза препарата составляет 75 мкг на 3.10 лимфоци45 тов для фильтрата, а фракция, задержанная фильтром, неактивна даже в дозе 800 мкг, Часть Фракции Фильтрата — 30 мг — растворяют в 0,2 М

KB на 0,601 М Трис-НИ, рН 8,0.и наносят, на колонку 1 100 см с сефадексом G-50, уравновешенную тем же буфером. Материал собирают с молекулярной массой 6000-1500 дальтон, обессоливают, лиофилиэируют. МинИмальная активная доза препарата составляет 1-2 мкг на 3 млн. лимфоцитов.

Общий выход целевого продукта составляет 110 мг/кг тимуса. Активность по тесту ингибирования спон60 танного розеткообразования азатиоприном не более 1 мкг на 3.10е лимфоцитов.

Полученные полипептиды имеют максимум поглощения в ультрафиолето65 вом свете при 208 и 275 нм, содержат, 997298

Редактор П,Горькова Техред М.Кузьма Корректор)1.Пилипенко

Заказ 9191/1 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, У(-35, Раушская наб,, д. 4/5

Филиал. ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 фракции с электрофрретической подвижностью в полиакриламидном геле по отношению к бромфеноловому синему: 0,082+0,002; 0,169+0,004, 0,364+

i0 004, 0,402+0,002,.0,452+0,004, 0,515+0,005; 0,890+0,004. Кроме того, не обладают антигенностью и не вызывают побочных явлений, Полипептиды вводили больным с

*лимфогрануломатозом в дозе 50 мкг/м ежедневно в течение 10 дней, затем через день в той-же дозе. После окончания курса размер опухоли уменьшается в 2-2,5 раза.

Полипептиды вводили также больным в дозе 50 мкг/м . Определяли количество Т-РОК в периферической крови.

Нормализация Т-иммунной системы

Ъ Т-POK не менее 60%) достигается на

7 день после введения.

Предложенный способ позволяет получить-полипептиды, обладающие высо10 кой чистотой и проявляющие противо- . опухолевое действие.