Способ получения гетеровакцины для лечения синдрома трихомонада

Способ получения гетеровакцины для лечения синдрома трихомонада

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (bt) Дополнительнъ и к патенту(22) Заявлено 221278 (21) 2699947/28-13 (23) Приоритет — (32) 23 12.77

Союз Советскии

Социалистическиа республик

< 997599 (51)М. Кл.з

A 61 К 39/116

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (3t) 16012/77 (33) Швейцария

Опубликовано.150283. еноллетень ЙР б; (53) УДК615.. 372 (688. 8) Дата опубликования описания 150283

Иностранец

Любинко Стойкович (72) Автор изобретения (СФРЮ) Иностранная фирма

"Золько Базель АГ" (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ETEPOBAKUHÍÛ

ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ТРИХОИОНАДА

Изобретение относится к медицине.и касается способа получения Ъетеровакцины для лечения синд рома трихомонада. S

Известен способ получения гетеро вакцины, заключающийся в том, что на

-питательных средах отдельно выращивают культуры микроорганизмов (коклюшные, дифтерийные, столбнячные), затем смешивают в определенных пропорциях убитые коклюшные микроорга-, низмы и анатоксины 1 ).

Цель изобретения — получение гетеровакцины для лечения синдрома трихомонада.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения гетеровакцины для лечения синдрома трихомонада Lactobacterium acidophiium штаммы CBS 465.77, CBS 466.77,, CBS 467.77, СВ$ 468.77, CBS 469.77, CBS 470.77, CBS 471.77.и/или

CBS 472.77 порознь выращивают в жидкой питательной среде в аэробных условиях, отделяют полученную биомассу, инактивируют ее и смешивают

3-8 штаммов микроорганизмов в равных количествах в физиологическом растворе или в объемах, обратно пропорциональных .концентрациям микроорганизмов, При этом выращивание осуществляют при рН 6, 1-6,8 и 32-45оС.

Инактивацию проводят 0,3%-ным раствором формальдегида и 0,5%-ным раствором фенола.

Кроме того, с целью повышения устойчивости гетеровакцины, после смешения микроорганизмов добавляют формальдегид, фенол или натрий-этилртутьтиосалицилат.

Штаммы взяты в 1976 г.из влагалища женщин, страдающих синдромом трихомонада.

Штаммы внесены 17.10.77 в лиофи-.. лизированном состоянии в Ceпtrea1

bureau voor Schimmel - cultures (Baopa, Нидерланды ) под обозначением от

CBS 465.77 до CBS 472.77 (восемь отдельных штаммов).

Все восемь штаммов являются грамположительными, имеют форму цепей или палисада.

Штаммы различны по морфологии и величине образующихся колоний, отдельные колонии очень малы и имеют форму круга, другие колонии больше и

997599

Таблица 1

Источник углевода

46577

Арабинда целлобиоэа +

Лактоза

Мальтоэа +

Маннитол

Мелибиоза +

Рафиноза +

Рамноза.+

Салицин

Сукроэа

Трег поза +

Ксилоэа

Рибоэа

Крахмал

10 имеют форму розетки с бороздками на поверхности.

Штампы СВ5 466.77, 467.77 и

489.77 обладают одинаковыми биохимическими и ферментативными свойствами. 5

Штаммы подобраны таким образом, что при применении всех восьми штаммов получают вакцину, эффективную для каждого пациента, с помощью которых независимо от происхождения ин- 60 фекции успешно вылечивают от синдрома трихомонада.

Для культивирования штаммов применяют жидкие питательные среды, наи-65

Биохимические свойства штаммов представлены в табл. 1.,более целесообразная из них имеет следующий состав °

Триптоэо-пептон, r 5

Гидр оли з ат казеина, r, 8

Мясной экстракт, r

Диалиэат дрожже,вой, мл 100 . K4HPO4 г

Три аммоний цитрат, 2

997599

Ацетат натрия, r 5

Солевая смесь, мл 5

Твин-80, мл 1

Глюкоз а, r 10, Лактоза, г 10

Дистиллированная вода, мл До 1000

Солевая смесь состоит из, г:

Мд504 7 К О 11,5

М.П504 2 Н2.0

FeS04 . 7 И О . 0,68

Дистиллированная вода, мл До 100 рН жидкой питательной среды до- 15 водят до 6,1-6,8, предпочтительно

6,5, среду.стерилиэуют в актоклаве при 115 С 20 мин, затем разливают по колбам Эленмейера, куда вносят образцы каждого штамма. 20

Культивирование проводят при

32-45оС, предпочтительно при 37 С

48 ч. По истечении этого времени материал собирают в стерильных условиях и центрифугируют 1.ч при 3000 д.

Осадок, образовавшийся из биологического материала, переводят в суспензию, предпочтительно в физиологическом растворе, и затем инаытивируют обработкой формальдегида и фенолом, предпочтительна концентрация суспензии О,ЗЪ в расчете на формальдегид и 0,5Ъ в расчете на фенол при длительности обработки

3-5 дн.

3S

После инактивирования суспензию снова центрифугируют 1 ч при 3000 д, чтобы освободить инактивированный материал от избытка формальдегида и фенола.

1Î

Материал, полученный от каждого отдельногб штамма, снова переводят в суспензию, предпочтительно в физиологическом растворе и проводят 45 испытание на стерильность и на наличйе жизнеспособных лактобактерий..

При отрицательных результатах этих испытаний определяют плотность культуры для. каждого штамма или число микроорганизмов на 1 мл культуральной жидкости.

При невозможности смешивания отдельных суспенэий непосредственно после инактивации их хранят при 4 С, либо каждый штамм лиофилизируют и в этом состоянии хранят при 4 С не менее 3-х лет. В качестве защитного коллоида для лиофилиэации пригодна . среда, состоящая из, Ъ! желатин 5,5; сахароза 37,5 и лактобионат кальция 60

О, 5. Лиофилизацию проводят 24 ч.

Инактивированный материал иэ от.дельных штаммов смешивают в равных количествах. Полученную вакцину разбавляют физиологическим раствором так, что она содержит в 1 мл 14 ° 10 микроорганизмов.

Общее содержание азота в вакцине составляет 3,68% сухого вещества.

Для повышения устойчивости к вакцине добавляют консервирующее средство, например формальдегид или фенол, в концентрации 0,25% или этил-ртутьтиосалицилат натрия и оставляют вакцину при 4 С 30 дн, прежде чем заполнить ею ампулы емкостью 0,5 мл.

Заполнение апирогенных ампул производят в стерильных условиях, ампулы лиофилиэируют и хранят при 4 С.

При 2-8 С вакцина сохраняется три года, при 20 С вЂ” 6 мес.

Вакцину испытывают на стерильность, токсичность, антигенное действие-и наличие жизнеспособных лактобактерий.

Для испытания на стерильность по

1 мл вакцины помещают в пробирки с тиогликолевой питательной средой и с бульоном Сабуро,пробирки инкубируют 10 дн при 37 С и соответствующий ряд обработанных пробирок инку-. бируют в течение того же времени при 25оС. Все пробирки в обойх рядах .оказались стерильными.

Испытание на токсичность производят на морских свинках и белых мышах. Пяти морским свинкам со средним живым весом 300 г внутримышечно вводят по 5 мл вакцины <по 2,5 мл в каждую заднюю конечность). После наблюдейия в.течение 14 дн все животные остались здоровы, в обработанных конечностях не обнаружено никаких реакций. Вакцину в дозе 0,5 мл вводят также в заднюю конечность десяти белым мышам со средним живым весом 20 г. После На» блюдения в течение 14 дн все оказа-. лись здоровыми.

Испытание на антигенное действие проводят сначала на трех морских свинках, которым через 14 дн вводят внутрисердечно по 5 мл вакцины, при этом никакой анафилактической реакции не наблюдается. ЗатЕм вакцину испытывают in vitro в реакции им мунодиффузии по Оухтерлони с нормальной человеческой сывороткой, при этом положительная реакция отсутствует.

Для испытания на наличие жизнеспособных лактобактерий пробы вакцины культивируют на плотной питательной среде следующего состава:

Вода, мл 800

Трипкаэеин, г 16

Раствор 1, мл 50

Раствор 2, мл 10

Раствор 3, мл 10

Раствор 4, мл 10

Свежие дрожжи, r 10

Пептон серебряный, г 10

997599

Таблица 2

Через

3 мес.

Перед вакцинацией

Титр б мес

12 мес

2 нед после начала вакцинации после 3-ей инъекции

1:10

1:20. Крахмал растворимый 0,5%-.ный, r 5

Вода, мл До 1000

Раствор 1 состоит и- 10%-ного раствора NаС1, раствор 2 состоит иэ

2%-ного раствора КС1 и 5%-ного раствора Ма СО, раствор 3 состоит иэ

2%-ного раствора СаС1 . и 1%-ного раствора МдС1 и раствор 4 состоит из 2,5%-ного, раствора К НРО .

К полученным растворам добавляют. 10

25 г агар-агара, доводят рН до значения 5,5-6,7, предпочтительно б, и стерилизуют 20 мин в автоклаве при.

115 С. Затем добавляют 100 мл водного раствора, содержащего 3 r мальтозы, 15 10 г глюкозы и 10 r лактозы, после чего добавляют 30 мл 1%-ного раствора цистеингидрохлорида, причем каждый из этих растворов предварительно стерилизуют через стеклянный 20 фильтр 66.

В последнюю очередь в среду вносят 10% дефибринированной человеческой крови. Питательную среду засевают пробами вакцины и посевы инкубируют при 37 С. В качестве контроля о среду засевают Lactobacterigm acidophi1um,и культивирование осуществляют при тех же условиях.

В вакцине не обнаружено ни одного жизнеспособного микроорганизма, т.е. она является убитой, при этом она оказывает действие против инфекций, вызываемых микроорганизмами вида Trichomonas vaginalis, т.е.от ; носится к классу гетеровакцин. 35

Вакцина вызывает образование спе-. цифических антител против Lactobacter1um асidophi1um, в частности против полиморфных форм, ответственных за патологические изменения ве- 4О личины рН влагалища при трихомонадном синдроме.

Иммунизирующее действие вакцины доказано на следующих опытах с животными и клинических испытаниях. 45

Двум кроликам с живым весом

2950 г и 3200 г делают внутривенное вливание с интервалом в 2 нед. Через месяц после второго вливания берут кровь и выделяют сыворотку.

В случае образования антител дают сыворотке агглютинироваться в разведении 1:50 лактобактериями тех штаммов, иэ которых готовится вакцина, при этом сыворотка в исследуемом разведении имеет положительный титр агглютинина.

У обоих кроликов титр агглютинина перед вливанием был отрицательный при разведении 1;10, через. месяц после второго вливания титр стал положительным при разведении 1:160 или 1:180.

Вакцина позволяет проводить лечебную и профилактическую обработку синдрома трихомонада (острого> хронического и асимптоматического).

Для лечебных и профилактических делей рекомендуется дозировка 0,5 мл (7 1 0 микроорганизмов) внутримышечно, три раза с интервалом в две недели с последующим введением той же дозы инъекцйей Раннеля через год после начала лечения.

Клинические исследования проводят на. 97 пациентках, которые подвергаются серологическим исследованиям.

У пациенток согласно временному графику отбирают кровь и полученную сыворотку крови испытывают на присутствие лактобактериальных антител.

Для этого сыворотку в возрастающем разведении (от 1:10 до 1:1280) обрабатывают вакциной из соответствующих антигенов или агглютининов и наблюдают происходящую агглютинацию.

В качестве агглютининов используют свежеприготовленную суспензию инактивированных микроорганизмов

Lactobacterium ас 10орЫ Ium тех же штаммов в том же весовом соотношении и,,в той же концентрации (14 ° 109 микроорганизмов на 1 мл), что и сама вакцина.

Появление в сыворотке агглютинина и нарастание его титров показано в .табл. 2.

=:, .997599

: Продолжение табл 2

Перед вак= цинацией

Титр

1:40

О

1:80

16

1:160

13

40

1:320

15

1:640.О

2О

1-:128о О

"Общий

97

92

1:293

1:56,4

1:356

1:120

1:257

Учитывая повышение титра агглюти- 4О забором крови, пациенток можно раснина в период между первым и вторым пределить, как указано в табл. 3.

Т а б л и ц а 3

32Х

-64Х и более

16Х

8Х

4Х, Повышение титра 2Х

Число пациенток

13

Доля пациенток от общего, Ъ

13,4 13,4 21,6 10,3

7,2

6,2

Геометрическое среднее, значение титра

Пример. 200 женщин в возрасте 15-59 лет, страдающих синдромом трихомонада, амбулаторно лечились вакциной, изготовленной из 8 штаммов.60

Контроль осуществлялся на протяжении.

2-х лет. 138 пациенток (69% от общего количества ) прежде безуспешно лечились метронидаэолом. Перед начачом лечения наряду.с-исследованием 65 крови и мочи проводилось гинекологическое исследование, включая колпоскопию и исследование по Рар-$веаг, параллельно были взяты. мазки из влагалища, вульвы, шейки матки и уретры для приготовления нативных препаратов и препаратов, окрашенных по .

Граму и Гимзу. Культура была нанесе- на на Trichomonas vaginalis. Иссле997599

Таблица 4

Т

Время исследования класс

Число

III V

Перед началом вакцинации

194 (97%) 6 (3 о) 200

Через 2 нед после 3-ей инъекции

139 47 . 14 (69,5%) (23,5%) (7%) 200

Через 3 мес после 3-ей инъекции

9. (4,5%) 27 (13, 5%) 164 (82%) 198

Через 12 мес после начала вакцинации

32 9 (16,2%) (4,5%) 157 (79,3%) 198 дования были повторно проведены через 6 нед 4 и 12 мес после начала лечения.

Перед началом лечения у 145 паци« енток (72,5%) была установлена выраженная симптоматика синдрома триI хомонада с сильным кольпитом, зудом, обильными зелено-желтоватыми дурно пахнущими белями, диспареунией и . дизигией, при колпоскопии выявлены отек и эритема эпителия и влагалищ- lÎ ной части шейки матки и влагалища.

Кроме того, у 61 пациентки была ус-, тановлена эритроплакия влагалищной. части шейки матки, у 13 - хронический цервицит. У остальных 55 пациен- f5 ток (27,5%) обнаружен только легкий кольпит °

Лечение прс>водилось согласно приведенной дозировке. В случаях легДевять пациенток, у которых при втором контроле (через три месяца после вакцинации) микроскопически еще определялась Tr.ichomonas vaginalis, остались невосприимчивыми далее к лечению, пероральное введение трихомонацида также ничего не 60 изменило.

Через 12 мес также остались изменения шейки матки в форме хронического цервицита или значительной эритроплакии, что объясняется тем, что эти 65

:кого кольпита дополнительная терапия

he применялась, йри острых симптомах; назначали антибиотики, а при тяжелых состояниях - дополнительно локальное применение препарата иэ штаммов

Lactobacterium acidophilum, эффективного против Noniliasis. Метронидазол или подобные ему нитроимидазольные производные не назначали ни в одном случае. Если выделения из влагалища. классифицировать по girovec, то успешность лечения можно проследить по табл. 4, где класс I означает отсутствие заболевания, класс негнойные бактериальные бели, класс

III — гнойные бактериальные бели, класс IV — гонорея (исследованию та кие случаи не подвергались), класс трихомонад (положительный нативный препарат), класс YI — микоз влагалища (Candida а1Ыcans). женщины способны к образованию антител. 198 (95,5%) пациенток, подвергшихся лечению, через 12 мес были вылечены от трихомоноэа(до лечения у них выделялись вагинальные бели по классу II и III).

Тот же результат был получен у

55 пациенток с легкими кольпитами без дополнительной терапии. Пациентки через два года снова подвергались наблюдению, за это время не выявилось ни одного случая реинфекции.

997599

13Формула изобретения

Составитель Г. Смирнова ..

Техред A.Ач, Корректор И. Шулла

Редактор Н. Швыдкая

Тираж 711 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 963/78

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Во время лечения и после него не было установлено никаких аллерги ческих и ..токсических- реакций, однако следует воздержаться от вакцинации в случае острых лихорадочных инфекций, болезней система гемато-.. поээа или тяжелой почечной недостаточности.

Й. Способ получения гетеровакци ны для.лечения- синдрома трихомонада, э аключающийся s том,, что Lactobacterium acldophl lum штам- )5 мы CBS. 465.77, CBS 466.77, CBS 467.77, СВЗ 468.77, СВ5 469..77, CBS 470..77, CBS 471.77 и/или CBS 472.77 порознь

; выращивают в жидкой питательной сре.. де в.;-аэробных условиях, отделяют -Э3 полученную биомассу, инактивируют ее и -смешивают 3-8 штаммов микроор-.! ганиэмов в равных количествах в,фи:зиологическом растворе или в-объемах, обратно пропорциональных концентрациям микроорганизмов.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с к тем, что выращивание осуществляют при рН 6,1-6,8 и 3245 С.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а=ю шийся тем, что инактивацию проводят 0,3%-ным раствором формаль дегида и О, 5В-ным раствором фенола.

4. Способ по и. 1, о. т л и ч а - ю шийся тем, что, с целью иовы шения устойчивости гетеровакцины, после смешивания микроорганизмов добавляют формальдегид, фенол илн

"натрий-этилртутьтиосалицйлат.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. МРТУ-42 В 263-68 на АКДС вак цину.