Способ получения ксилозы путем ферментативного гидролиза водных растворов ксиланов

Способ получения ксилозы путем ферментативного гидролиза водных растворов ксиланов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУ1 ЕНИЯ КСИЛОЗЫ ПУТЕМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ВОДНЫХ РАСТВОРОВ КСИЛАНОВ посредством фер- ; ментной системы, включающей ксиланазу и ft-ксилозидазу, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, .ферментативный гидролиз осуществляют при в течение 4 ч, а в качестве ферментной системы используют ксиланазу и р -ксилозидазу и, в случае необходимости , фермент, отщепляющий уроновую кислоту, раздельно иммобилизованные на неорганическом носителе, выбранном из группы: пористое стекло, силикагель или кизельгур. (О ел

СО1ОЭ СОВЕТСНИХ

Э %%%

РЕСПУБЛИК

1 (19) (11) д1),C 07 H 3/02//С 13 D 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ Д ъ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ы С " "

6с ныа еибрапцз щепкиной arlpunuz

Фиг./ (21) 2532400/23-04 (22) 28.09.77 (31) Р 2643800.6 (32) 29.09.76 (33) ФРГ (46) 07.04.83. Бюл. ) 13 (72) Юрген Пулс, Михаэль Зиннер и

Ханс-Херман Дитрихс (ФРГ) (71) Проектирунг Хемише Ферфаренстехник ГмбХ (ФРГ) (53) 547,454.07(088.8) (56) 1. Kusakabe I., Yasui Т., Ko bayashi T. Новый метод получения ксилобйозы и ксилозы путем энзиматического гидролиза ксиланов растительного сырья . - "Agr. Biol. Chem." 1975, 39, И 7, 1355 (прототип). (54)(57) спасов полЖния ксилозы пуТЕМ ФЕРИЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ВОДНЫХ, РАСТВОРОВ КСИЛАНОВ посредством фер" : ментной системы, включающей ксилана" зу и )-ксилозидазу, о т. л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повыше" ния выхода целевого продукта, .Ферментативный гидролиз осуществляют при

40 С в течение 4 ч, а в качестве ферментной системы используют ксиланазу и $ -ксилозидазу и, в случае необходимости, фермент, отщепляющий уроновую кислоту, раздельно иммобилизованные на неорганическом носителе, выбранном из группы: пористое стекло, силикагель или кизельгур.

1011050

Изобретение относится к усовершенствованному. способу ферментатчвного получения ксилозы, важного продукта пищевой промышленности.

Известен способ получения ксилоэы: ферментативным гидролизом водных растворов ксиланов посредством кси" ланазы Pi -ксилоэидазы при комнатной температуре в течение 6"8 ч. В ре" зультате ферментативного гидролиза

1О получают гидролизат, содержащий ксилозу и ксилобиозу в соотношении

1:1 (13.

Недостатком известного способа является низкий выход целевого продукта.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цепь достигается спо" собом получения ксилозы, заключающимся в ферментативном гидролизе о водных растворов ксилана при 40 С в течение 4 ч путем обработки ксйланазой и -ксилозидазой и, в случае необходимости, ферментом, отщепляю" щим уроновую кислоту, которые.раздельно иммобилиэованы на неорганическом носителе, выбранном из группы: пористое стекло, силикагель или кизельгур. В результате ферментативно- .щ го гидролиза получают практически только ксилозу без примесей ксилобиозы. Выход 98,53.

Гидролиз ксилана с помощью фермента, связанного с носителем, отличается от гидролиза с помощью свободных ферментов тем, что благодаря более высокой стабильности связанных ферментов могут выбираться более высокие температуры, в результате чего 40 реакция идет быстрее.

Температуры в пределах 30-60 С, предпочтительно в пределах 40-45оС,. дают, как правило, оптимальные результаты. 45

Выход ксилозы в соответствии с предлагаемым способом заметно вы- ше, чем тогда, .когда с носителем производят одновременное связывание кси" ланаэы, -ксилозидазы и фермента, 50 вызывающего отщепление уроновой кислоты, и пытаются осуществить ферментный гидролиэ ксиланов за.счет того, что на водный раствор ксиланов воздействуют с помощью носителя, содержащего все эти три фермента.

В описании и s примерах, когда речь идет о процентах подразумеваются весовые проценты.

Пример 1. Процесс выделения (варки).

400 г древесины красного бука в форме рубленной щепы подвергают сушке на воздухе, обрабатывают на дефибраторе с помощью водяного пара при 185- 190 С в течение 6-7 мин и под соответствующим давлением в

12 атм приблизительно в течение 40 с.

Полученный таким образом сырой волокнистый материал вымывают из дефибратора, в результате чего получают 4 л пульпы, которая была загружена на сито.

Выход волокнистого материала сос. тавляет 834 из расчета на исходную древесину (абс. сух).

Промытый и отжатый на прессе волокнистый материал затем суспендируют при комнатной температуре в 5 л

14-ного раствора NaOH и 30 мин спустя отделяют от щелочной вытяжки путем Фильтрации и прессования.

После промывки водой, разбавленной кислотой и вновь водой, выход волонистого материала составляет 663 на исходную древесину (абс. cyx).

Соответствующим образом обработке подвергают и другие виды древесины, в том числе и в форме крупных опилок, а также в форме рубленной соломы.

В табл. 1 представлены средние значения выходов волокнистого материала (абс. cyx.).

ll р и м е р 2. Углеводородный состав после водной и щелочной. обработки.

Часть общего количества экстракта, полученного по примеру 1, продуктов водного и щелочного процессов подвергают полному гидролиэу (см. табл. 2).

Пример 3. Разделение и получение концентратов ксиланазы и jb-ксилозидаэы на основе ферментного препарата.

220 г ферментного препарата "Целлеэиме" {ксиланаза, ксилозидаза, энзим, отщепляющий 4-0-метилглюкуроновую кислоту). подвергают растворению в 4,8 л 0,02 М буферного раствора аммоний-ацетатного буфера при рН 5.

Нерастворяющийся остаток частично . удаляет путем пропускания через по ристый стеклянный фильтр. Затем раствор фермента фильтруют с осветлением через тефлоновый фильтр. Далее ультрафильтруют раствор фермента на приборе для ультрафильтрации TCF-10 фирмы Аминкон (Лексингтон, Массачузетс).i щепляющего кислоту).

25

3 10

Применяют следующие Аминкон-ульт-рафильтры (даны в порядке их использования). Область выделения мол. в.

ХМ100 А 100000

Х М 300 300000

Р М 30 30000

Э М 5 500

Очищенный раствор сырого фермента фильтруют первоначально через фильтр с областью выделения мол. в.

100000.

После этого кбйланаэа преимущественно находится в ультрафипьтрате. (Ь "Ксилозидаэа (неизвестный фермент, вызывающий отщепление 4-0-метил-глукуроновой кислоты от кислых ксилоолигомеров) находится преимуществеHHo в остатке.

Этот остаток ультрафильтрации профильтровывают через ультрафильтр, отделяющий мол. в. 300000. В конце названной операции Р-ксилозидаза вместе с активным ферментационным компонентом, вызывающим отщепление уроновой кислоты,. определяется только в светлом растворе ультрафильтрата, а густой темно-коричневый остаток не содержит активных компонентов

-ксилозидазы и уроновой кислоты.

Полученный при первой ультрафильтрации фильтрат подвергают далее следующей обработке.

Ультрафильтрация на P М 30: ксила-. наза после этого этапа снова в ультрафильтрате. Вещества, не обладающие активностью ксиланазы, выделяются в остаток

Ультрафильтрация íà D М 5: ксиланаза находится в остатке; на этом этапе ее концентрируют; Одновременно наибольшее количество углеводов (в исходном материале 3Я) выделяется ,в ультрафильтрат.

В табл. 3 приведены значения активности IlO ксиланаэе, Ъ-ксилозидазе

И ферменту, вызывающему отщепление уроновой кислоты, Представленные величины обозначены условными единицами. Одна условная единица. сооответствует такому количеству фермента, которое содержание сахара в разлагаемом растворе повышает при 370C на

1 мк моль ксилоэы для ксиланазы и ф-ксилозидазы и на 1 мк моль 4-0-метилглюкуроновой кислоты для фермента; отщепляющего кислоту (разлагаеьый раствор - 13 ксилана буковой древесины для ксиланазы, 2 ммоль.п-нитрофенилксилопиранозида для Jb-ксилози11050 ф дазы, 0,02 мкг/мкл 4-0-метилглюкуронозил-ксилотриозы для фермента, отДля измерения активности Р-ксилозидазы осуществляют взаимодействие разбавленного раствора и-нитрофенил" ксилоэида в объеме 1,5 мл с 2 мл

0,1 И боратного буфера рН 9,8.

Анализ высвободившегося п-нитрофенола проводят непосредственно в спектре 420 нм по его ослаблению.

Количество п-нитрофенола считывают по тарировочной кривой и пересчитывают на ксилозу.

В качестве субстрата, отщепляющего уроновую кислоту, служит 4-0-метилглюкуронозил-ксилотриоза.

ll р и м е р 4. Отложение фермен- та на носителе.

В качестве носителя фермента выбирают пористое стекло.

Ксилонолитические ферменты связываются с носителем через альдегид глютариновой кислоты.

1 г пористого стекла в течение ночи подогревают с обратным холодильником 103-ного раствора гамма-амино-пропил-триэтоксилана в толуоле. За счет этого носитель получает группу

З0,амина. После этого производят интенсивную промывку последовательно толуолом и ацетоном. Затем носитель интенсивно перемешИЬают с 20 мл

53-ного раствора альдегида глютариновой кислоты в 0,02 м фосфатном буфере при рН 6,5. Перваначально в те- чение 15 мин перемешивание производят под вакуумом, а затем дальнейшую инкубацию осуществляют при нор" мальном давлении. Далее проводят от40 сасывание, и материал носителя подвергают тщательной промывке 200 мл буферного раствбра.

На основе такого активированного материала носителя получают два фер-.

W5 ментных препарата, связанных с носи" телем: а) 1 r такого активированного носителя перемешивают в течение ночи с 5 мл ксилоназного ферментного раст50 вора с активностью 657 усл. ед., по" лученного в соответствии с примером 3.

Далее осуществляют промывку через пористый стеклянный фильтр с помощью раствора 1 И ИаС1 в -0,02 И фосфатном буфере с рН 4, после чего промывку осуществляют 0,02 M раство" ром фосфатного буфе 5а с рН 5 до тех

011050 4

30

5 1 йор, пока вода промывки не будет содержать фермента.

Полученный таким образом препарат.

1 содержит на 1 r 64 усл. ед. -свя" занной эффективной ксилоназы. б) Работу проводят как указано в пункте а, однако используют 5 мл раствора, полученного в соответствии с примером 3, который содержит

33 усл. ед. P -Kñèëîçèäàçû и

60 усл. ед. фермента, отщепляющего уроновую кислоту.

Полученный препарат 2 содержит в связанном состоянии на 1 г приблизительно 33 усл. ед. Р-ксилозидазы и

60 усл. ед. фермента, производящего отщепление уроновой кислоты.

П р.и м е р 5. Гидролиз ксилана древесины бука.

2 мл раствора ксилана, полученного no примеру 1 s результате промыв" ки водой древесины бука после ее варки (этот раствор содержит 1,33 ксилана), инкубируют с 60 мг препарата 1 л с 60 мг препарата 2, полученных как указ но в примере 4, причем во время инкубации в водяной. бане содержимое ее перемешивают встряхиванием, а температуру в ней поддержи вают равной 40 С.

Спустя 4 ч в результате гиуролиза ксилана буковой древесины образуются мономерные компоненты ксилозы и

4-0-метил-глюкуроновая кислота.

На фиг. 1.показана хроматограмма после 4 ч инкубирования. Из нее видно, что в растворе произошла полная деструкция ксилана до ксилозы.

Раствор не содержит ксилобиоэы.

Пример 6. В качестве носите" ля для фермента выбран силикагель (меркогель SI 1000). Работают точно так, как указано в примере 4, причем получают оба следующих ферментативных препарата, связанных с носите-. лем: а) 1 г активированного носителя, . содержащего. 59 ед. связанной ксиланазы.; б) 1 г активированного носителя, содержащего около 32 ед. -ксилоэида. зы и 59 ед. фермента в связанной форме, отщепляющего уроновую кислоту.

П р и м,е р 7. Работают как описано в примере 4, причем в качестве материала-носителя применяют кизельгур (инфузорная земля), При этом получают следующие .два ферментативных . препарата, связанных с носителем: а) 1 г активированного носителя содержит 52 ед. связанной ксиланазы; б) 1 г активированного носителя содержит 30 ед. -ксилоэидазы и

67 ед. связанного фермента, отщеп" ляющего уроновую кислоту.

Пример 8. Гидролиз ксилана букового дерева.

2 мл раствора ксилана, полученного согласно примеру 1 промывкой водой иэ переведенного в растворимую форму букового дерева (раствор содержит 1,33 ксилана), инкубируют

60 мг препарата 1 и 60 мг препарата

2, полученных согласно примеру 4, при 40 С на встряхиваемой водяной бане. Гидролиз ксилана производят аналитически хроматографией на колонке с применением ионообменной смолы.

Через 4 ч ксилан букового дерева гидролиэуют на его мономерные составные части и 4-0-метил-глюкуроновую кислоту.

На фиг. 2 приведена хроматограмма после четырехчасового инкубирования. Отсюда очевидно, что в растворе происходит полное расщепление кси- лана до ксилозы. Раствор не содержит ксилобиозы.

Сравнительный опыт. По 2 мл раст .воров ксилана, полученных согласно.примеру 1 (раствор содержит 13 мг ксилана в 1 мл), обрабатывают в те . чение 4 ч при 40 С тремя ниже описанными препаратами ферментов: а) 60 мг фермента (3,8 ед актив; ной ксиланазы соответственно относительной активности 9,7Ф), связанного с носителем, полученного соглас" но примеру 41 б) 60 мг препарата, связанного с носителем, полученного следующим образом: 1 г пористого стекла активи:руют, согласно примеру 4. 1 r активированного таким образом носителя перемешивают ночь с 5 мл неочищенного фермента, применяемого в приме" ре 3, затем промывают согласно примеру 4 а. Относительную активность полученного таким образом продукта не определяют, поскольку последующий опыт йоказал, что при помощи этого ферментативного препарата ксилан не может расщепляться до .ксилозы;

e) Смесь 60 мг препарата, получен. ного согласно примеру 4 а (3,8 ед. ксиланазы соответственно относитель ной активности 9,74) и 60 мг препа1011050

83

Бук

71

Тополь

86

Березка

Ель

Эвкалипт

71

Пшеничная солома

Солома ячменя

65

88

Солома овса

Таблиц а 2

Экстр матер

69

13

3 Бук

13 5

Н О

НЕОН l 3,2

6,8

ll

Н О

NaOH

Ель

77

Береза Н О

НаОН

11,2

7,3

8,3

6,5

76

6

Тополь Н О

NaOH

Эвкалипт Н О

NaOH

9>5

5,0

71

Пшени53

7,0

8,3

Н,О

Na0H

7 рата, полученного согласно примеру

4 б (2 ед.f?"ксилозидазы и 3,6 ед. фермента, отщепляющего уроновую кислоту, соответственно относительной активности 100t).

Расщепление ксиланов в трех раст- ворах контролируется через 3 ч хроматографией на колонке согласно примеру 5. Содержание ксилобиозы и ксиз лозы в растворах показано на фиг. 3. .Таблица1

1011050 10

Продолжение табл. 2

Р

Т абл и ц а

2568

34560

1541

1290

1996

7968

524 4480

1817

1011

21173

19730

Остаток

Экстрагирование материала

Ячмень H O

NaOH

Овес Н О

БвОН

Раствор Целлюзима

Остаток пос-. ле Х М 100 А

Ультрафильтрат Х М 100 А

Ультрафил ьтрат Х М 300

Ультрафильтрат Р М 30

6,1

9,5

5 1

4 4. 41

44 88

101 1 050

Составит@ а Л. Никулина, Техред И.Гергель К ректо Ю. Мак енко Редактор С» Пекарь илиал П Патент, r. Ужгород, ул.. роектная, аказ 51 Тираж 3 одписное

ВНИИЯИ Государственного .комитета СССР .. no делам изобретений и открытий

113035 Иосква W-35 Раушская наб. . 4/