Способ получения производных мурамилпептидантигенов

Способ получения производных мурамилпептидантигенов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОД- i НЫХ МУРАМИЛПЕПТИДАН ЕИГЕНОВ структур:ной формулы (I) . А - - MPJH г ; : где А - остаток антигена: сывороточ ный альбумин, мембраны эритроцитов , полисахарид Neisse ria mehingiticlis, мерозоиты возбудителей малярии, Т-лим-, фобласты, клетки рака молочной железы, вакцины против ящура, бешенства, антигены .вируса против гриппа, столбнячные и холерные токсоиды, эйкозапептид, паразиты Tri- ponosoma«cru2i, (что соответствует прямой связи между антигене и мурамилпептидом), остаток связанного с атомом азота оС,0)-диаминоалкана (C,j-j ) , . . алкандикарбонила ( тллм оС,р-или У-аминоалканкарбонила () ; МР - остаток мурамилпептида формулы (II)

(19) (11) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

Я(Я) С 07 С 103 °

37 02

ГОСУДАР ()ТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛА рМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ !

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flAT EHTY

СН20Ь 5 (21) 2739298/04 (22) 23.02 ° 79 (31) 2035/78;. 3777/781 5394/78 (32) 24.92.78; 07. 04,78; 18.05.78 (33) Швейцария (46) 15. 11 .83. Бюл. М. 42 (72) Герхард Башанг, Феликс Макс Дитрих (ФРГ), Роланд Гнзлер (Швейцария), . Альберт Хартманн (C PI ), .Ярослав .Станек (ЧССР ) и Лайос Тарчай . (ФРГ) (7 1) Циба-Гейги АГ (Швейцария) (53) 547.964.4.07 (088.8), (56) 1.,Шредер Э, Любке К. Пептиды."

:М., "Мнр", 1967, ч. I, с. 1"16. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОД-

:НЦХ МУРАМИЛПЕПТИДАНТИГЕНОВ структурной формулы (I) A — К вЂ” МР)„ где A — остаток антигена: сывороточ- ный альбумнн, мембранЫ эрит-. роцитов, полйсахарид Nei.sseria mehingitidis, мероэоиты возбудителей малярии, Т-лим-, фобласты, клетки рака молочной железы, вакцины против ящура, бешенства, антигены . вируса против гриппа, столбнячные и холерные токсоиды, эйкозапептид, паразиты Тг1ponosomacruai, 3 = 0 (что соответствует прямой связи между антигеном.и мурамилпептидом), остаток связанного с атомом азота

cC,И-диаминоалкана (Су 4 ), алкандикарбоннла (С) 4 ) или

at,f-нли jt -аминоалканкарбонила (С 22);

МР— остаток мурамнлпептнда формулы (II) 2 — 0 . СОН вЂ” CB-CON — CH — СЕ СЕ-Rii „ (Ц I Р)

j (где Х - карбоннл-, карбоннлоксилили сульфонил-группа)

R(рк4 и R> — водород нли триметилси g лил;

R<- фенил, неэамещенный низший алкил или низший алкил, замещенный гидроксилом, карбоксилом или алкоксикарбонилом. (С(- 5 ) t

ВВ к g R6 iВ8 и .R)q водород. или С -Cg алкил;

R7 — водород, С -С9-алкил, свобод. . ный, этерифицированный в проеэой ипи сложный эфир

С< -С -оксиалкил, свободный, этерифицированный в простой илн сложный эфир Ci-С -меркаптоалкил, свободный или ацилированный С -С -аминоал кил, хлорметнл, фенил, бензил или n — оксибенэилу

Rq R<0 и Rq независимо друг от друга свободный этерифицированный в сложный эфир или амидированный карбоксилу

Н(р - также водород n — целое число ньиве 0 при условии, что на 1 мг или на 10+ клеток антигена соответственно содержится от 0,01 до

:0,5 мг мурамнлпептида в соединениях структурной фор)мулы (I ), 1055312

Изобретение относится к способу получения новых биологически активных производных мурамилпептидантигенов, которые могут найти применение в медицине.

В лептидной химик при конденсации фрагментов, содержащих аминогруппу и карбоксильную группу широко используются методы карбодиимидный и активированных эфиров )1) .

Цель изобретения — способ получе ния новых биологически активных соединений — производных мурамилпептидантигенов, обладающих ценными фармакологическими свойствами.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения, производных мурамилпептидантигенов формулы

А — )Z — МР) (I) где A - остаток антигена: сывороточный альбумин,мембраны эритроцитов, полисахарид Neisseria meningiti мероэоиты возбудителей малярии, Т-лимфобласты, клетки рака молочной железы, вакцины .против ящура, бешенства, антигены вируса против гриппа, столбнячные и холерные токсоиды, эйкоэапептид, паразиты Tripanosoma cruzi, Б = 0 (что соответствует прямой связи между антигеном и мурамилпептидом), остаток

, связанного атомом азота К,Q

-диаминоалкана {Cy4 ), алкандикарбонила (с 4 ) или

GL", (— или g -аминоалканкар бонила (С -у );

СН2®5

OEi где Х - карбонил-, карбонилоксил< или сульфонил-группа;

R(iR4 и  — водород или триметилсилил

Ю Rg - фенил, незамещенный низший алкил или низший алкин, замещенный гидроксилом, карбоксилом или алкоксикарбонилом (С4 g ) s

25 R,Q,R> и R<> — водород или С -С алкил;

R — водород, С -Су-алкид, свободный, этврифицированный в простой или сложный эфир

30 6 -С -оксиалкил, свободный, этерифицированный в простой или сложный эфир С -С -меркаптоалкил, свободный или ацилированный С4-Су-аминоалкил, хлорметил, фенил, бенэил или И -оксибензилу

Ry,В4 и В,((— независимо друг от друга свободный этерифицированный в сложный эфир или

40 .амидированный карбоксил1 отличающийся тем, что антиген конденсируют с 5-150-кратным избытком мурапилпептида формулы (II) связанного с Е, имеющим .указанные значения, причем связанный фрагментом Б мурамилпептид содержит карбоксильную группу или активированную сложноэфирную группу карбоновой кислоты и антиген содержит по меньшей. мере одну свободную амино-, оксиили меркаптогруппу, или связанный фрагментом Е мурамилпептид содержит свободную аминогруппу и антиген по меньшей мере одну свободную карбо ксильную или активированную сложноэфирную группу карбоновой кислоты, при температуре 0-40 С в воде или

О водном буфере при рН 5-9 в течение времени от 5 мин до 48 ч, по методу активированных эфиров или карбЫ иимидным методом.

Приоритет по при знакам:

24.02.78. при соединениях форм;улы (Т), где А — сывороточный аль бум ин, мембраны эритроцитов, полисахари,ды

Neisseria meningitidis, мерозоит ы возбудителей малярии, Т-лимфобла<-.ты, 07. 04 .78. при соединениях фор. му.лы (I), где А — клетки рака молс чной железы, вакцины против ящура, вакцины против бешенства, антиге,йы вируса против гриппа

18.05.78. при соединениях форму лы (I) где A. — столбнячные и х злерные токсоиды, эйкозапептид, или. паразиты Tripanosoma cruai.

МР— остаток мурамилпептида формулы

3 R К К

{9 )О

СОН (.Н COZf (.К СНЗ(".  — СК вЂ”, с(— 11

15 Кб 86

1055312

R t0 т aK Ke Водород

n — целое число выше 0 при условии, что на 1 мг или на 10 клеток антигена соответственно содержится от 0,01 до

0,5 кг мурамилпептида в соединениях формулы (Г), антиген конденсируют с 5-150-кратным избытком мурамилпептида формулы (11), связанного с z имеющим указанные значения,причем связанный фрагментом Ю

Е мурамилпептид содержит карбоксильную группу или активированную сложноэфирную группу карбоновой кислоты г антиген содержит, по меньшей мере одну свободную амино-, окси-или мер- 15 каптогруппу, или связанный фрагментом 2 мурамилпептид содержит свобод.ную аминогруппу и антиген по меньшей мере одну свободную карбоксильную или активированную сложнозфирную группу карбоновой кислоты, при температуре 0-40оС в воде или водном буфере при рН 5 — 9 в течение времени от 5 мин до 48 ч по методу активированных эфиров или карбодиимид= 25 ным методом.

Описываемые соединения вызывают повышение иммунного ответа на анти- ген,,проявляющегося посредством кле ток иммунитета при клинически приемлемых условиях введения,. как это показано в биологических испытаниях.

Потенцирование проявляющегося посредством клеток иммунитете in чиччо: повышение Spattyp-чувствительности против бычьего альбумина сыворотки (BSA) и против зритроцитов овцы (SRBC) у морских свинок, Морских свинок Pirbrignt на

0 сутки иммунизируют 1 мг BSA или 40

1 мг SRBC — Ghosts (SRBCG) и полным вспомогательным средством

Фройнда посредством инъекции в обе задние лапы смеси антигена и вспомогательного средства. Через 3 недели 45 вызывают кожную реакцию посредством внутрикожной инъекции 100 мкг BA или 100 мкг SRBCC в 0,1 мл буферного физиологического раствора соли и через 24 ч после этого определяют реакционный объем, который рассчитывают по площади эритемы и по увеличению толщины кожи. Наблюдаемое через 24 ч (Spattyp-реакция) специфичное антигенное увеличение реакционного объема служит мерой проявляю.щегося посредством клеток иммунитета. BSA u SRBCC являются слабыми иммуногенами для того, чтобы в чистом виде..или в водно-масляной эмульсии с неполным вспомогательным сред- 60 ством Фройнда (10 .. BSA-раствора соответственно SRSCG суспензии в

О, 9% NaCg смешанные с 8,5 ч. Вауо F и 1,5 ч. Arface) A инду цирйвать Брй ур-реакцию, и для эф- 65 фективной иммунизации должны применяться в полном вспомогательном средстве, к которому добавлены мико. бактерии (5 мг мертвых и лиофилизованных М. butyricum sa 10 мл Ва-, уо6 F / АгйасеЕ A ).

Вместо микобактерий новые соединения, содержащие в качестве антиге- на BSA (1 мг BSA, 60 мкг NDP на животное) или SRBCG (1 мг RBCG,25 мкг

NDP на животное) применяют в суспендированном виде либо в форме смеси антиген — масло, либо в карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ). Новые соединения в отсутствие микобактерий индуцируют в описанном опыте Spattypреакцию.

Значительнее потенцирование Spattyp-реакции против BSA и против

SRBCG также может быть достигнуто посредством того, что новые соединения смешивают не в полном вспомогательном средстве Фройнда, а суспендируют и применяют в КМЦ. Особенно эффективно в этом случае внутри,мышечное введение. При этих условиях равное количество свободного мурамил, ептида, промышленное к КМЦ, значительно менее активно по сравнению с новым биологически активным веществом. Таким образом, новые соеди» нения при клинически приемлемых ус-! ловиях применения, т.е. при введении с благоприятными для организма сопутствующими веществами, способны индуцировать проявляющийся посредством клеток иммунитет даже по отношению к растворимым протеиновым антигенам.

Потенцирование проявляющегося посредством клеток иммунитета in ч1т

vo : повышение Sphttyp-чувствительности против BSA и против SRBCG умышей.

Самцов NAG-мышей на 0 сутки иммунизируют частичными дозами антигена, не соединенного с мурамилпептидом. (BSA-агароза или-SPBCG) или соединен- ного с ним (BSA-агароза или SRBCG).

Препарат BSA-агароэы вводят подкожно в дозах от 0,1 до 100 мкг (в слу;чае нового соединения с мурамилпептидом соответствует дозе биологически активного вещества 0,0029-6 мкг на одно животное) в 0,2 мл буферного физиологического раствора поваренной соли.SRBCG-препарат в дозе 0 013 мг (в случае нового соединения с мурамилпептидом соответствует дозе биологически активного вещества

0,25-75 мкг на одно животное) в

0,5 мл буферного физиологического раствора соли вводят внутрибрюшинно или по 0,5 мп внутрикожно соответственно в стопы 3-х лап.

Спустя 4-20 сут вызывают Spattypреакцию посредством инъекции 100 мкг

1055312

BSA или 108 SRBG в 20 мкл буферного физиологического растврра соли в стопу лввой задней лапы и через 24 и 48 ч определяют реакционный объем, который рассчитывают по опуханию стопы. Наблюдаемое специфичное антигеновое увеличение объема стопы служит мерой проявляющегося посредством клеток иммунитета.

На 14 сут после иммунизации соединением BRA-агароэà-NDP ярковыраженная

Splttyp-реакция наступает даже в случае очень малых доэ (0,1 мкг соответственно, 0,006 мкг биологически активного вещества)..В противоположность этому свободная BSA-агароза 15 не в состоянии сенсибилизировать

Spattyp-реакцию. Равным образом

SRBCG-MDP-.ñîåäèíåíèÿ,. прежде всего после внутрик эжного введения, спо собны индуцировать реакцию, которая значительно более ярко выражена, чем реакция, возникающая после сенсибилизации $ВВСО, не сЬединенным с мурамилпептидом.

Таким образом, новые соединения также. способны значительно повышать клеточный иммунитет.

Потенцирование гуморального иммунитета in vivo. :повышение воспроизводства антител против BSA у мышей °

Мышей NMRI иммунизируют "на

0 сутки посредством внутрибрюшинной инъекции 0 1-100 мкг BSA связанно- го с мурамилпептидом (0,0014—

6,0 мкг биологически активного вещества). Спустя 10, 17 и 28 сут отбирают пробы сыворотки и исследуют их на содержание анти-BSA антител с помощью пассивной Haemaggfutinations-техники. В примененных дозах 40 свободный BSA является слабым иммуногеном для подопытных животных, т.е. он не способен или способен лншь в незначительной степени вызывать производство антител. Соединение BSA с 45 мурамилпептидом позволяет s 2-3 раза повысить титр антител в сыворотке (титр. - сумма 1ед2 разности титров в три дня взятия крови), Кроме того, новые соединения, которые к тому же соединены е агарозой в качестве носителя, после внутрибрюшинного или подкожного введения являются еще более сильными иммуногенами.

Опыты показывают, что предлагаемые новые соединения также способны значительно повышать гуморальный иммунитет.

Описываемые производные антигена представляют собой вакцины нового типа или улучшенные известные вакци,ны и служат для новых способов вакцинации или для упрощения традицион" ных способов вакцинации (например, может быть уменьшено количество при-(65 вивок, которое необходимо для Поддержания защиты в течение продолжительного промежутка времени) .

Пример 1. К раствору 1 r альбумина -бычьей сыворотки в 100 мп

0,1 М раствора кислого углекислого натрия и 0,5 М раствора поваренной соли прибавляют при перемешивании

500 мг 2-ацетамидо-3-0- ((Ь-1- (D-1-карбамоил-3-сукцинимндооксикарбонилпропил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозы. Раствор перемешивают в.течение 4 ч при комнатной температуре и непосредственно после этого реакционную смесь фильтруют в стерильных условиях (NFMik ipore, фильтр 0,45 мкм) . Сопряженный альбумин бычьей сыворотки отделяют способом диалитического фильтрования через фильтр Амикон

UN-10 .от низкомолекулярных продуктов реакции и от солей и подвергают сублимационной сушке.

Количественное определение мурамилпептида, связанного с альбумином бычьей сыворотки, производят с помощью реакции Моргана-Эльсона. В среднем найдено 60 мкг мурамилпептида в 1 мг соединения с альбумином бычьей сыворотки.

Сукцинимидоэфир, который применяют в качестве исходного вещества, может быть получен, например, следую(щим способом.

1 ммоль 2-ацетамидо-3-0-{(Ь-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил) -2-дезокси-D-глюкозы, 1 ммоль дициклогексикар« бодиимида и 1,1 ммоль N-оксисукцинимида растворяют в 3 мл абсолютного диметилформамида и в закрытом сосуде в условиях, исключающих присутствие влаги, реакционную массу перемешивают в течение 20 ч. Выделившуюся в осадок дициклогексилмочевину отделяют, растворитель упаривают в высоком вакууме, полученный остаток обрабатывают диэтиловым эфиром, после чего его отфильтровывают и сушат.

Получеиный указанным Способом сукцинимидоэфир может храниться в условиях, исключающих присутствие влагИ, например в ампуле, заполненной азотом.

Пример 2. При конденсации полученного в примере 1 производного антигена с активированной агарозой применяют поступающее иа рынок производное агароэы B10-RAD Affi ef

10 . Оно содержит на каркасе агаро- . зы простую эфирную боковую цепь (Spaeer arms ) М -алкилсукцинимида, который этерифицируют я -оксисукцинимидом.

120 мг полученного в соответствии с примером 1 производного альбумина бычьей сыворотки растворяют при 4 С

1055312

1 ммоль 2-ацетамино-3-0-((Ь-1-(0-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозы и 2 ммоль гидрохлорида

40 .N-этил-N -(3-диметиламинопропил)-карбодиимида растворяют в 10 мл воды и рН раствора доводят до 5,0 посредством .прибавления соляной кис лоти,- после чего прибавляют раствор

4 5 ймоль дигидрохлорида этилендиамина в 10 мп воды. Реакционную смесь при рН 5,0 н комнатной температуре перемешивают в течение 6 ч, затем поме щают ее в колонку, заполненную слабо ,® кислотным катионообменником Амберлит CG 50 tl причем колонка имеет размеры 2,5 х 45 см, и производят элюнрование 0,05 М раствором пиридинацетата -(рН 3,7, 300 мл). Содержащие .полученный ацетат 2-ацетамино-3-0-,((Ь-1-(D-1-карбамоил-3-N-аминбэтил-карбамоилпропил)-карбамоилэтил)-карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозы фракции испытывают и жарактериэуют с применением нингидрина или электро60, фореэа с высоким напряжением, подвер;гают сублимационной сушке.

Переведение продукта в гидрохлоридную форму осуществляют следующим

gg образом. в 12, 5 мп О, 1 N фосфатного буферного раствора с рН 7,3. Затем в растворе посредством встряхивания суспенднруют 500 мг АХЕ1-СеО 10, после чего массу встряхивают еще в течение 4 ч при 4 С. Оставшиеся активные сложноэфирные группы вводят во взаимодействие посредством обработки в течение 30 мин 1 М раствором хлоргидрата этаноламина в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 7,3) . Пос- 10 ле,этого гель помещают в колонку и производят элюирование сначала 200 мл раствора с концентрацией 0,1 М фосфатного буфера и 1 М поваренной соли (рН 7,3) и затем 20 мп физиоло- 15 гического раствора поваренной соли.

Определение количества присоеди:ненного в результате конденсации к Affi-Ge0 10 соединения мурамилпептида и альбумина бычьей сыворотки ;р производят с помощью количественного анализа содержания альбумина бычьей сыворотки и аминокислот в гидролиэате определенной аликвотной части гея. В среднем обнаружено 9-10 мг производного мурамилпептида и альбу= мина бычьей сыворотки на 1 мл набухшего Affi-(еб 10 .

Пример 3. Мембраны эритроцитов овцы получают из свежей овечьей крови. К суспензии 500 мп мембран З0 эритроцитов овцы в 50 мл раствора

;с концентрациями 0,1 М кислого углекислого натрия и 0,1 М поваренной соли прибавляют при перемешивании

400 мг 2-ацетамидо-3-0 ((L-1-(D- 35,-1-карбамонл-3-сукциннмидо-оксикар бонилпропил)-карбамоилэтил1 -карба моилметил7(-2-дезокси-Р-глюкозы и смесь перемешивают в течение 4 ч

i ,при комнатной температуре. После этого продукт взаимодействия с мембранами эритроцитов седиментнруют посредством обработки смеси в течение 1 ч на ультрацентрифуге при

90000 и 4 С. Полученный осадок, три раза промывают буферным раствором фосфата и поваренной соли, причем каждый раз осадок суспендируют. в этом растворе и затем отделяют на ультрацентрифуге, затем его промывают один раэ дистиллированной во! дой. Промытое соединение с мембранами эритроцитов суспендируют в 100 мл ,дистиллированной воды и производят сублимационную сушку.

Количественное определение мурамилпептида связанного с эритроцитами овцы, производят с помощью реакции Моргана-Эльсона, в результате чего обнаружено 25 мкг мурамилпептида на 1 мг мембран эритроцитов °

П р и м.е р 4. 1()0 мг группы С .полисахарида Ncisseria meningitlgdis и 110 мг (0,2 ммоль) гидрохлорида

2-ацетамидо-3-О-((ф-1-(D-1-карбамоил-3-N-аминоэтилкарбамоилпропил)-карбамоилэтил1-карбамоилметил -2-дезокси-Р-глюкозы растворяют в 10 мл дистил-. лированной воды и посредством прибавления разбавленной соляной кислоты рН раствора доводят до 5.

19,2 мг гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида при перемешивании прибавляют к раствору. Смесь перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре, значение рН смеси доводят -до 5 посредством прибавления разбавленного раствора гидроокиси натрия, после чего прибавляют 5 мп 2 М натрийацетатного буферного раствора (рН 5) и.в течение 30 мин реакционную массу перемешивают. Непосредственно после этого рН смеси доводят до 7 посредством прибавления гидроокиси натрия. Раствор фильтруют, в стерильных условиях, фильтрат подвергают диализу против дистиллированной воды при 4 С и непосредственно после этого. сублимационной, сушке.

Количественное определение десметилмурамилдипептида, присоединенного к С-полисахариду, производят по аналогии с примером 1 с помощью реакции

Моргана-Эльсона, в результате чего найдено 80 мкг десметилмурамилдипептида на 1 мг полисахарида.

Применяемый гидрохлорид 2-ацеаамнно-3-0- g jL-1= D-1-карбамоил-3-N-аминоэтилкарбамоилпропил)-карбамоилэтил)-метил)-2-дезокси-D-глюкозы мо, жет быть получен, например, следую,щим способом.

1055312

Лиофнлизат растворяют в 6 мл

0,2 н. раствора соляной кислоты и производят хроматографирование на

810-Ge+ P2-колонке размерами 2,5 » 90 см при применении воды в качестве элюирующего средства. Фракции, содержащие гидрохлорид 2-ацетамино-3-0-f tL-1-(D-1-карбамоил-3-N-аминаэтилкарбамоилпропил)-карбамоилэтил)—

-карбамоилметкл -2-днзокси-D-глюкозы, подвергают сублимационной сушке. (О

Подданным электрофореэа с высоким напряжением полученный продукт однороден. При определении состава гидролизата найдено молекулярное соотношение 1 мураминовая кислота : 1Ь- 15

-аланинг1Р-глутаминовая кислота:1 зтилендиамин.

При применении соответствующих мурамилдипепткдов в качестве исходных соединений аналогичным способом 2О получают соответствующие гидрохлориды S-аминоэтилаьйда, а именна гидрохлорид 2-ацетамино-3-0- (D-.l;fL-.lвЂ(Р-1-карбамоил-3-И-аминаэтИЛкарбамоилпропил)-карбамоилэтил)-карбамакл 25 этил)-2-дезокси-9-глюкозы гндрохлорид

2-бензоиламино-3-0-1))-1-(Е-1-(D-1-карбамоил-3-N-амийоэтилкарбамоилпропил)-карбамоилэтил) -карбамоклэтил)-2-дезокси-D-глюкозы гидрохлорид

2-бензоиламино-3-0-$jL-1-(D-.l-карбаФ

ЗО моил-3-N-аминоэтилварбамоилпропил)-карбамоилэтил(-карбамоклметкл)-2-дезокси-D-глюкозы, гидрахлорид 2ацетамино-3-0-f(L-1-(D 1-N-карбамоилметилкарбамоил-3-N-аминоэтилкарбамоилпропил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил -2-дезокси-Р-глюкозы, гкдрохлорид 2-бензоиламино-3-0-ДЬ-1 (Р 1-карбамоил-3-N-аминоэтилкарбамоил пропил)-карбамоилпропил) -карбамоил- 40 метил) -2-дезокси-D-глюкозы, гидрохлорид 2-пропионкламино-3-0-1 (Ь-1†(D-1-карбамоил-3-N-аминоэтилкарбамоилпро ил)-карбамаилэтил)-карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозы, гидро- 45 хлорид -ацетиламино-3-0-ЦЬ-1-(Р-1

-карбамоил-3-N-аминоэтклкарбамоклпропил)-карбамаилпропкл)-карбамаил-. метил)-2-дезакси-D-глюкозы, гидрохлорид 2-ацетиламкно-3-9-((Ь-1(D-1карбамаил-3-N-аминаэтилкарбамоклпропил)-карбамоил-2-оксиэтил) -карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозы, гидроклорид .2-пропиониламино-3-0-)fL-1-(D-1 или 3-карбокси-3- илк

l-N-аминоэтилкарбамоилп пил)-карба1 моилэтил) -карбамоилэтил «2-дезокси-Р-глюкозы, гидрохларид 2-бензоиламкно-3-0- ЦЬ-1- (Р-1-карбамоилметилкарбамоил- Э-Я-амикоэтилкарбайоилпропкл)-карбамоилэтил -карбамоилметкл -2- 40

-дезокси-D-глюкозы, гидрохларид 2-ацетамкно-3-0-((Ь-1-(D-1-карбамокл-3-N-аминоэтилкарбамоклпропил)-карбамайл"2-метилпропил) -карбамоилметкл) -2-деэокси-D-глюкозы, гидрохло- g5 рид 2-ацетамино-3-0-fD-1-)L-1- (D-1- -карбамоил-Э-(1-N-аминоэтилкарбамоил)

-этилкарбамаилпропил)-карбамоилэтил) -карбамоилэтил)-2-дезокси-D-глюкозы, гидрохлорид 2-ацетамино-3-0- (fL — 1-,(D-l-карбокси-Э-N-аминоэтилкарбамоилпропил)-карбамокл-2

-seeTasmponHsij -карбамоилметил) -2-дезокси-D-глюкозы, гидрохларид 2-ацетамино-3-0-f(L-1-(D-1-карбамоил-3-N-аминозтилкарбамоилпропил)-карбамоил-N,N- тетраметилен)-карбамоилметил)-2-дезокси-D-глЖкозй; гидрохлорйд 2-ацетамино-3-0-ЦЬ-1-(D-1-карбамоил-3-N-аминоэтилкарбамоилпропил)-карбамоилэтил -N-метилкарбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозы или гидрохлорид 2-бензоиламино-3-0-(fL-l-(D-1-карбамоил-3-N-аминоэтилкарбамоилпропил) -карбамоил-2 -метилпро.

7 пил)-карбамоилметил) -2-дезокси-Dглюкозы

Эти соединения могут быть введены в реакцию конденсации с группой С полисахаридов.

Пример 5. Непосредственно

После получения мерозоиты возбудителя малярии Plasmodium Knowfesl (общкй выход из крови зараженных Pheзиз-обезьян суспендируют в растворе

100 мг, т.е. 0,17 ммоль) 2-ацетамино-3-0-jtL-1-(Р-1-карбамоил-3-сукцинимкдаоксикарбонилпропил) -карбамоилэтил -карбамоилметил}-.2-дезокси-Dглюкозы в 15 мл физиологического буферного раствора (рН 7,2). Суспензию выдерживают в течение 1 ч при

37 С. Затем продукт реакции седиментируют посредством центркфугнрования. Полученный оаадок промывают посредством суспендирования в физиологическом буферном растворе и вновь центрифугируют. Промытое соединение с мерозоитами па Г.Х. Иктчелу суспеидируют в 10%-ной сыворотке Phesusобезьян и осуществляют сублимационную сушку.

Количественное определение мурамилдипепткда, связанного с мерозоитамк прризводят с помощью реакции

Моргаиа-Эльсона, в результате чего обнаружено 40-60 мкг мурамилдипептида ка 1 мг мерозоктов.

Пример б. В растворе 200 мг (0,34 ммоль) 2-ацетамино-3-0-((Ь-l-(Ь-1-карбамоил-3-сукцинимидооксикарбонилп пил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил -2-деэокси-D-глюкозы в

20 мл ф атного буферного физиологического раствора поваренной соли (рН 7,2) суспендируют 109 Т-лимфобластов CBA/.) ьыШЕй (Т-лимфобласты получают в mixed E ymphocyte cueture против стимулирующих клеток

С57ВЬ/б мышей). После этого полученное соединение .с лимфобластами седиментируют: посредством центрифугироваикя, после чего осадок промывают

1055312

12 суспендированием в фосфатном буфер- ном физиологическом растворе поваренной соли и повторным центрифугированием.

Количественное определение мура милдипептида, связанного с T-лимфо5 бластами, производят с помощью реакции Моргана-Эльсона (пример 1), в результате чего обнаружено 60-70 мкг .мурамилдипептида на 10 Т-лимфоблас.тов.

Пример 7. По аналогии с описанным способом альбумин бычьей сыворотки может быть введен в реакцию сочетания с 2-ацетамидо-3-0- 0-1-(Ь-1-(D-1-карбамоил-3-карбокси 15 пропил) -карбамоилэтил) -карбамоилэтил) -2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламино-3-О-(б-1-(Ь-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил»-харбамоилэтил -2-дезокси-альфа, бе- -щ та-D-глюкозой, 2-бензоиламино-3-0-((Ь-1-. (D-1-карбамоил-3-карбоксипропил) -карбамоилэтил) -карбамоилметил)--2-дезокси-альфа, бета-D-глюкозойr . 2-ацетамидо-3-0- ((L-1-(D-1-карбамоилметилкарбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил -карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензамидо-2-дезокси-3-0-f(L-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил -карбамоилпропилД-карбамоилметил -D-глюкопиранозой, 3-0- ((L-1-(D-1=карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил -2-дезокси-2-пропионамидо-D-глюкозой, 2-ацетамидо-Э-О-((L-1- (D-1- K Mow- 3- K ap5ox cHrr pan mr) — З5

-карбамоилпропил) -карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-О-((Ь-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоил-2-оксиэтил) -карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 4()

2-пропиониламино-3-0-f(L-1-(D- 1,3-дикарбоксипропил)-карбамоилэтил)—

-карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламино-3-0-1 (Ь-1-(D-1-N-карбамоилметилкарбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил) -2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацет1 амино-3-О-((Ь-1-0-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоил-2 -метилпропил) -карбамоилэтил)-2-дезокси-Dглюкозой, 2-бенэоиламино-3 0-((Ь-1-.

-(Р-1,3-дикарбоксипррпил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил -2-дезокси-Dглюкозой, 2-ацетамино-3-0-((.0-1-1Ь

-1-карбамоил-3-карбоксипропил)— т ,-карбамоил-2 -метилпропил -карбамоиИ-55

3 2-peaoxcH-D-коэой, -ацетамино-3-О-(D-1-(Ь-1-(D-1-карба- моил-3-/ -1-карбоксиэтил/-карбамоил-пропил) — карбамоилэтил -карбамоил- . этил 2-дезокси-0-глюкозой,2-ацета-:. 60 мино-З-О- 1-1-(0-1,3-дикарбоксипропил -карбамоил-2 -метилпропил -карбамоилметил -2-дезокси- О-глюкозой,2-ацетамино-3-0-((Ь-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамрил-N,N-тетра-у метилен)-карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3" О-(pL-1-

-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)—

-карбамоилметил» -N-метилкарбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламино-3-0-((L — 1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоил-2 метилпропил)-карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой.

Пример 8. Способом, аналогичным описанному в примере 3, получают мембраны эритроцитов овцы, введенные в реакцию сочетания с 2-ацетамино-3-0-(D 1-(L1-(D-1-карбамоил3-карбоксипропил)-карбамоилэтил)-карбамоилэтил-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламино-3-О-(D-1-(Ь-1-(D-1карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил) -карбамоилэтил -2-дезокси-D-глюкозой,2-бензоилам но-3-0-f(Ь-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)—

-карбамоилэтил) -карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламинс,-3-0-((1 вЂ, 1-(D-1,3-дикарбоксипропил)-карбамоилэтил)-карбамонлметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-пропиониламино-3-0-((Ь-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил» -карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамйно-3-0-((?;-1 †(D-1-N-карбамоилметилкарбамоил-3-карбоксипропил) -карбамоилэтил) -карбамоилметнЛ .

-2-дезокси-0-глюкозой, 2-бензоиламкно-3-0-((L-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил -карбамоилпропил -карбамоилметил - 2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетами о-3-0-ЦЬ-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилпропил)—

-карбамоилметил -2-дезнкси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-О-((L 1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоил-2-оксиэтил) -карбамоилметил —

-2-дезокси-D-глюкозой, 2-пропио ил амино-3-0-$(Ь-1-(D-1,3тдикарбокси-. пропил)-карбамоилэтил)-карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бенэоиламино-3-0-(fL-1-.(0- -1-N-карбамоилметилкарбамоил-3-карбоксипропил)— карбамоилэтил)-карбамоилметил)-2-деэокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0-ЦЬ-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил) -карбамоил-2 -метилпропил)—

-карбамоилметил)-2-де окси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0- D-1-(Ь-1-(Р-1-карбамоил-3-/Ь-1-кар оксиэтил/-карбамоилпропил) -карбамоилэтил)—

-карбамоилэтил)- 2-дезокси-0-глюкозой, 2-ацетамино-З-О-((Ь-1-(9-1,3.—

;дикарбоксипропил)-карбамоил-2)- ;метилпропил7-карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламино-3-0-ЯЬ-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропиМ) -карбамоел-2 -метилпропил)-карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетаминь-3-О-((Ь-1-(D-1карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоил-g,N-гетраметилен)-карбамоилметил3-2-дезокси-D-глюкозой, 2-аце13

1055312 тиламййо- 3-0-g/L-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтилД—

-Н-метилкарбамоилметил -2-дезокси-В-глюкозой, 2-ацетами о-3-0-((Р-1-(L-1- карбамоил-3-карбоксипропил)—

-карбамоил-2 -метилпропил) -карба 5 моилэтил)-2-деэокси-D-глюкозой.

Пример 9. По аналогии со способом, описанным в примере 5, получают мерозоиты возбудителя малярии

Р asmodium knowfesi, введенные в 10 реакцию сочетания с 2-ацетамино-3-0-(D-1-fL-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил) -карбамоилэтил) -карбамоилэтил) -2-дезокси-В-глюкозой, 2-бензоиламино-3-0-%D-1-(Ь-1-(D-1-карбамоил-15

-3-карбоксипропил) -карбамоилэтил —

-карбамоилэтил -2-дезокси-D-глюко- . зой, 2-бе4зоиламино-3-0-(IL-1-4В-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил -карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоилам но-3-0-$IL-1-(D-1,З-дикарбоксипропил)—

-карбамоилэтилД -карбамоилметил)-2-дезокси-D- ãëþêîçîé, 2-пропиониламино-3-0-((Ь-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0-(ЬЬ-1-(Р-l-N-карбамилметилкарбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилметил) -карбамоилмети+2-дезокси-D-глюкозой, 2.-ацетамино-3-0-$(L-1-(D-1-N-карбамоилметилкарбамоил-3-карбоксипропил).-карбамоилэтил) -карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламино-3-0-((L-1-(D-1-карбамоил-.З-карбоксипропиЛ)-карбамоилпропил) -карбамоилметил)«2-дезок си-D-глюкозой, 2-ацетиламино-3"0- .

-fI L 1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилпропил) -карбамоилметил1

-2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино- 40

-3-0-(tL-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоил-2-оксиэтил)-карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой

2-пропиониламино-3-0-((Ь-1-(D"1,3-дикарбоксипропил) -карбамоилэтил) — 4

-карбамоилметил)-2-дезокси-В-глюкозой, 2-бензоиламино-3-О-fIL-1-(D-1-N-карбамоилметилкарбамоил-3-карбоксипронил)-карбамоилэтил -карбамоил-.

MezHJIj -2-дезокси-D-глюкозой 2-ацет50 амино-3-0-((Ь-l-(Р-l-карбамоил.-З.-карбоксипропил)-карбамоил-2 -метилпропил) -карбамоилметил) -2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0- D-1 †.

-jL-1-(Р-й-карбамойл-3-(Ь-1-карбок сиэтил)-карбамоилпропил) -карбамоил этил(-карбамоилэтил -2-дезокси-Dглюкозой, 2-ацетамино-3-0-((Ь-1-(D-l,3-дикарбоксипропил)-карбамоил-.

„-2 -MeTHJInponHJI) -карбамоилметил)-2-дезокси-В=глюкозой, 2-бензоилами- Я} но-3-0-(fL-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропйл)-карбамоил-2 -метилпропил карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюко зой, 2-ацетамино-3-0-1 (L-1-(D-1-карбамоил-Ç-карбоксипропил)-карба. .1 моил-Е, N-тетраметилен) -карбамоилме. ! . тил) -2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0-((Ь-1-(Р-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил) -N-метилкарбамоилметк+2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0- 10-1-tL-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоил-2 -метилпропил)-карбамоилэтил)-2-деэокси-П-глюкозой.

Пример 10. В растворе

100.мг 2-ацетамино-3-0-(Р-1- $L -1-, †(D-1-карбамоил-.3-сукцинимидооксикарбонилпропил)-карбамоилэтизЯ вЂ .карбамоилэтил -2-дезокси-D-глюкозы в

10 мл фосфатного буферного физиологического раствора поваренной соли (рН 7,2) суспендируют 108 раковых клеток грудной железы собаки. Суспензию выдерживают в течение 90 мин при комнатной температуре. Затем продукт присоединения мурамилдипептида к опухолевым клеткам седиментируют посредством центрифугирования и промывают фосфатным буферным физиологическим раствором поваренной .соли посредством повторного суспендирования в нем йродукта и повторного центрифугирования.

Количественное определение мура.— милдипептида, связанного с опухолевыми клетками, производят с помоцью реакции Моргана-Эльсона (пример 1), в результате чего обнаружено 6080 мкг мурамилдипептида на 10 раковых клеток грудной железы.

Пример 11. По аналогии по способам, описанным в примере 10, получают раковые клетки .грудной железы,собаки, соединенные с 2-ацетамино-3-0-(Р-1-|L-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил)—

-карбамоилэтил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламино-3-0-(О-1-fL-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил) -карбамоилэтил -2-деэокси-Р-глюкозой, 2-бензонламино-3-0-(fL-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипрдпил)-карбамоилэтил)-карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламнно-3-.0- (Ь-l-(Р-1,3-дикарбоксипропил) -карбамоилэтил) -карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-пропиониламино-3-0-((Ь-1-(Р-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил»-карбамоилметил)-2- дезокси-D-ãJIþêo-. зой, 2-ацетамино-3-0-ИЬ-1-(D-1-N-карбамоилметилкарбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилэтил) -карбамоилметил1-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бензоиламино»З-0-(fL-1-(D-карбамоил-3-карбоксипропил) -карбамоилпропил)-карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0-(Ь-1-{D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карба моилпропил-карбамоилметил-2-дезокси-D-глюкозой, 2-,ацетамино-3-0-1ЬЬ-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)—

1055312

„16

-карбамоил-2-оксиэтил) -карбамоилме- тил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-пропиониламино-З-О-ЦЬ-1-(0-1,3-дикарбоксипррпил)-карбамоилэтил -карбаиоилметил -2-дезокси-0-глюкозой, 2-бензоиламино-3-О-((L 1-(D-1-Я-карбамоил- 5 метилкарбамоил-3-карбоксипропил)карбаиоилэтил) -карбамонлметил -2-деэокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0-1t L-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил-карбамоил-2 -метилпропил)—

-карбамоилметил)-2-дезокси-0-глюкозой, 2-ацетамино-3-0- 0-1-L-1-(D-1-карбамоил-3-(Ь-1-карбоксиэтил— карбамоилпропил) -карбамоилэтил—

-карбаиоилэтил -2-дезокси-D-г козой,35

2-ацетамино-3-0-((L-1-(0- 1,3,-дикарбоксипропил)-карбамоил-2 -метилпропил) -карбаиоилметил -2-деэокси-.Dглюкозой, 2-бензоиламино-3-0-((L-1-(D-1-карбамонл-3-карбоксипропил)- 2п

-карбамоил-2 . -метилпропил)-карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0- ЦЬ вЂ 1 †(D-1- карбамоил-З-карбоксипропил)-карбамоил-М,Итетраиетилен -карбамоилметил)-2-деэокси-0-глюкозой, 2-ацетамино-3-0-((L-1-(О-1-карбамоил-3-карбоксипропил) -ка бамоилэтнл)-N-метилкарбамоилиетил -2-дезоксн-D-глюкозой, 2-ацета но-3-0-%0-1-(L-1-карбамоил-3-карбоксипроп л) -карбамоил-2 -ме30 тилпропнл) -карбамоилэтил -2-дезокси.-0-глюкозой.

Пример 12.. К 10 мл суспензии вакцины культуры ящура (Vakzine

Beringwerke) в фосфатнои буферном физиологическом растворе поваренной соли прибавляют 100 мг 2-ацетаиино3-0-f(L-1-(D-. 1-карбамоил-3-сукциним-идооксикарбонилпропил)-карбамонлэтил)-карбаиоилметил)-2-дезокси-D-глюкоэИ.49 Сусперзню встряхивают в течение 4 ч при 4 С. После этого продукт присое-, динения мурамилдипептида к вирусу отфильтровывают в стерильных условиях, посредством диМ иза против воды 45 производят отделение от низкомолекулярных продуктов реакции, после чего осуществляют сублимационную сушку.

Количественное определеяие мурамил.дипептида„ связанного с вирусом © производят с помощью реакции Nopraна-Эльсона (пример 1) °

Пример 13. По аналогии со способом, описанным в примере 12, получают вакцину ящура, связанную с

2-ацетаиино-3-0-(D-1- Ь-1-(D-1-кар-- бамоил-3-карбоксипропил)-карбаионлэтил) -карбамоилэтил -2-дезоксн"D-глюкозой, .2-бензоиламино-3-0- 01-fL-1-(Э-1-карбамоил-3-карбокснп опил) - &6

-карбаиоилэтнл) -карбамоилэтил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-бенэоил но-3-0- ДЬ-1-10-1-карбамоил-3- карбоксипропил) -к арбамочлэтил3 -к арбамоилме тил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бенэо- 65 илаЪЙино-3-0-f Ь-l-(D-1,3-днкарбокси" ,пропил)-карбамоилэтил) -карбамоилме- тил)-2-дезокси-D-глюкозой,2-пропионнламнно-3-0-ffÜ-1-(О-1-карбамоил-3-карбоксиаропил)-карбамоиЛэтил -карбаио-. ,илиетил)-2 -дезокси-0-Глюкозой, 2 -ацетамино-3-0-(ЬЬ-1-(D-1-N-карба моилметилкарбамоил-3-карбоксипро-пил)-карбамоилэтил)-карбамонлмети+"

"2-дезокси-ф-глюкозой, 2-бензоиламино-3-0-gfL 1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипропил)-карбамоилпропил)-карбамоилметил)-2-дезокси-0-глюкозой, 2-ацетиламино-3-.0-)jL-1(D-1-карбамоил-3-карбокснпрОпил)-карбамоилпропил) -карбамоилметил) -2-дезекси-D-глюкозой, 2-ацетаиино-3-0-,ЦЬ-1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипроцил)карбамоил-2-оксиэтил -карбамоиЯ-2.

-дезокси-D-глюкозой, 2-пропионйламнно-3-0((Ь-1-(0-1,3-дикарбоксипропил)-карбамоилэтил -карбамоилметил)-2-дезокси-D-глюкозой, 2-бенэоиЛамино— 3-0-(ЬЬ-1 †(D-1-Н-карбайоилметилкарбамоил-3-карбоксипропил)-карба.моилэтил -карбамоилметил -2-дезокси-D-глюкозой, 2-ацетамино-3-0-((Ь -.1-(D-1-карбамоил-3-карбоксипройил)т карбамоил-2 -метилпропил)-карбамоилметил -2-дезоксн-. Ь-глюкозой, 2-ацетамнно-3-0- D-1-)Ь-1-(0-1-ка