Способ определения эндо- @ (1-4) глюканазной активности

Способ определения эндо- @ (1-4) глюканазной активности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДО-р ( - 4 N ГЛЮКАНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ путем ферментативного гидролиза растворимого субстрата, отличающий с я тем, что, с целью повышения точности и производительности определения, в качестве субстрата используют карбоксиметилцеллкшозу, окрашенную активными красителями нафталинового ряда, содержащими 1-3 сульфогруппы в нафталиновом ядре, часть субстрата, не подверпиегося гидролизу, осаждают 0,5-3.0 объемами органического растворителя с добавлением электролита до концентрации 5-50 мМ, измеряют оптическую плотность полученного фильтрата, а эндо-j (I- 4) глюканазную активность определяют по формуле D-v 1000, -i л -, JA - где V оптическая плотность фильтрата; V объем реакционной смеси, мл; время гидролиза субстрата, t мин; копичество ферментного преrrt парата , взятого для аналиО ) за, мг, 2.-Способ по п. 1,отличающ и и с я тем, что используют карбоксиметилцеллюпозу, окрашенную активным ярко-оранжевым ЖТ, или ремазолом красным 2Б, или ярко-красным 2СХ, или активным алым 4 ЖТ. 3.Способ по п. 1,отличающ к и с я тем, что в качестве органического растворителя используют этанол или метанол, или монометиловый э4ир этиленгликоля, а в качестве электролита - CaCl, или КС1, или ZnCl . или MsSOi,

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СЮ МР

РЕСПУБЛИК, (!У (И) ЗЮ1у С 1 36 " 2 1 34

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 13

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Ь11Ь.!!Ж.. 1> ;:;:, рат а; l — объем реакционной смеси, мл; — время гидролиза субстрата, мин;

М вЂ” количество ферментного препарата, взятого для анализа, мг. (21) 3598702/28-13 (22) 31.03.83 (46) 07.09.84. Бюл. В 33 (72) P.Ю.Савицкене, В.Б.Герасимас, N.Ë.Ðàáèíoâè÷, A.À.Клесов, Ю.IO.Степонавичюс и Г.И.Денис (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (53) 577.15(088.8) (56) 1. Leisola _#_.„ Тлп1со М. Determination of the Solubilizing Acti—

vity of à Cellulase Complex with

Dyed Substcates- "Апа1. Biochem", 1976, то1. 70, р. 592-599. 2. Клесов А.А., Рабинович М.Л . Синицын А.П. и др. Ферментативный гидролиз древесины.-"Биоорганическая химия", 1980. т. 6, Ф 8, с. 1225-1242. (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДО-Р (I -) 4 ГЛЮКАНАЗНОИ АКТИВНОСТИ путем ферментативного гидролиза растворимого субстрата, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения точности и производительности определения, в качестве субстрата используют карбоксиметилцеллюлозу„ окрашенную активными красителями нафтапинового ряда, содержащими 1-3 сульфогруппы в нафталиновом ядре, часть субстрата, не подвергшегося гидролизу, осаждают 0,5-3.0 объемами органического растворителя с добавлением электролита до концентрации 5 — 50 мМ, измеряют оптическую плотность полученного фильтрата, а эндо-р (1- 41 глюканазную активность определяют по формуле

D.V

3A = — — — — — — 1000, t rn где 9 — оптическая плотность фильт2..Способ по п. !, о т л и ч а юшийся тем, что используют кар боксиметилцеллюлозу, окрашенную активным ярко †оранжев ЖТ, или ремазолом красным 2Б, или ярко-красным 2СХ, нли активным алым 4 ЖТ.

3. Способ ко и. 1, о т л и ч а ющ н и с я тем„ что в качестве органического растворителя используют этанол или метанол, или монометиловый эфир этиленгликоля, а в качест. ве электролита — СаС1, или КСI, или

ZnC1z, или М@БО

1112058 . 2 фильтрата, а эндо-р- (1 41 глюка:---.="-зную активность определяют по формуле

Изобретение относится к эн:;нмо-. логии, микробиологии и микрОбиолQ-"

Гической прОмышленности« а именнО к способам определения BKT. вностH ферментов.

Известен способ определения активности целлюлолитических ферментов с испОльзОванием нерастворимых Окра ш е н ны х су б ст р ат ось. к- от «алый в кл юч а(!фермент ативный гидролиз субстр ат"-..., кипячение реакционной смеси,. филь«рацию и последуюшее определение оптической плотности фильтрат=, по которой судят о ферментативной активности 111.

Недостатком такого способа является то, что при этом определяется

ToJIbKo обШая BKTHHHQQT L, =:JIKufBBного комплекса, а не активность отдельных ферментов, в частности эндо-1:11--ь 4)-Глюканаз (называемых в дальнейшем для краткости эндоглюканазами) .

Известно таРоке способ определе-:-.":я

) 1 эндо- <1--4) глюканазной активност:-; (так называем|й вискозиметрически:-.; метод1„который включает ферментативный гидролиз растворимого субстратB (карбоксиметилцеллюлозы ) и определение начальной скорости уменьшения относительной вязкости раствора.

ЗтОт спОсОб ЛОзвОляет рассчитBTI по вискозиметрическим данным абсол з-=ную эндоглюканазную активность (мкмоль расщепленных QBJIBeé в

1 мин1 1. 23.

Недостатками указанного способа являются его низкая производительность (5 определений в час1 и низкая точность (ошибка OX и более).

Цель изобретения — повышение

g0 точности и производительности определения эндо- ((1- 4)-глюканазной активности.

Поставленная цель достигается

А5 тем, что с" ãëàñíî способу определения эндо- †(1 4 1глюканазной активности путем ферментативного гидролиза ра."творимого субстрата в качестве субстрата применяют карбоксиметилцеллюлозу, окрашенную актив ными красителямл нафталинового ряда, содержащлми 1-3 сульфогруппы в наф= талиновом ядре, часть субстрата, не подвергше гося гидролизу, осаждают

0,5-3,0 объемами органического рВО=-. ворителя с добавлением электролита до концентрации 5,0-50,0 мИ, измеря-. ют оптическую плотность полученного эл =: 1ооо, (1) .m

:-,.: Е - оптическая плотность фильтPBTB

7 — объем реакционной смеси, мл, -«время гидролиза субстраТВ МИН ш — количество ферментного препаратB, взятого для анализа, мг.

Обычно используют карбоксиметилцРЛЛ«)0ЛОзу Окрашенную активным яр .-" ;О=ора«гжевыРл NT или ремазолом крас. :;,-..м 28., или ярко-красным 2СХ, или

:= -:.тивным алым 4ЖТ.

Б =-.à÷åñòâå органического раствор;:;гел обычно используют этанол или

Рлетанол, или монометиловый эфир

::".-.Иленгликоля, а в качестве электрол.лта — CBC 4 или KC I или ZHC1@ или «1«S0ц, 1Ip-IMåHBíHå в качестве субстрата карбоксиметнлцеллюлозы, окрашенной указ анными красителя«ял, позволяет поьыснть производительность определе-ьля "-ндо- вЂ, 1-- 41-глюканазной активi ности целлюлазных комплексов по сравнению с известным способом. Ироиэ..=-:Одительность предлагаемого спосо(:--а составляет 20 определений в час, тогда как известного — 5 определений час. Благодаря стабильности

QKраски фильтратов описываемый способ дает возможность раздельно проводить ферментативную реакцию с по;.«Ледуюцчм осаждением и измерение оптических плотностей фильтратов, :TQ позволяет одновременно определить энда--a (1 -41-глюканазную актив:-"«ость большего количества образцов.

Известный способ позволяет одновременно определить активность только одн-.ã-:о обо:=:."-ца.

HpoaegeTIB сравнительная оценка

-.Очности предлагаемого метода с известным на примере определения эндоглюканазной активности целлоброниHB Г10х, Средний коэффициент вариации равен 4,9-5,3Е, а по известному способу - 113. Из этого следует, -..то точность предлагаемого способа определения активности эндо F1 4)11120 глюканаз превышает точность известного способа почти в 2 раза.

f . Описываемый способ определения эндоглюканазной активности проверен на следующих целлюпаэных препаратах: цепловиридин ГЗх, целлобронин Г10х, пектофоетидин ГЗх, целлокандин ГЗх, ферментный препарат фирмы "Рапидаэа" (Франция) .

Пример 1. В ацетатном бу- 10 фере (рН 4,5) готовят 1Х-ный раствор карбоксиметилцеллюлозы, окр ашенной активным красителем ярко-оранжевым ЖТ (субстрат) . Концентрация целлобронина Г10х в ацетатном буфере 1 (рН 4,5) 1,0 мг/мп. В пробирку наливают 5 мп раствора субстрата, термостатируют при 40 С в течение 5 мин, приливают 1 мп ферментиого раствора, взбалтывают и инкубируют при 40 С ровно 10 мин, после чего добавляют 5 мп осадителя (807.-ный этанол, содержащий 25 мИ СаС1 ) . Реакционную смесь взбалтывают, выдерживают в течение 1 мин для полного выпадения осадка и фильтруют через бумажный широкопористый фильтр, после чего определяют оптическую плотность фильтрата на фотоэлектроколориметре

ФЭК-56И (фильтр 5, З =490+10 и. ) против контрольной пробы. Для приготовления контрольной пробы в пробирку наливают 5 мл раствора субстрата, 5 мп осадителя, взбалтывают, добавляют мл ферментного раствора, выдерживают в течение l мин и фильт—

35 руют через бумажный фильтр.

Оптическая плотность О, 31.

Эндоглюканазную активность исследуемого препарата рассчитывают по 4р формуле (1 ).

0 31 11

ЭА = - — — -- 1000 341 уел. ед/г.

10 1

Пример 2. В ацетатном буфере (рН 4,5) готовят 2Ж-ный раствор карбоксиметилцеллюлозы, окрашенной активным красителем ремазолом красным 2Б. Концентр ация целловиридина

ГЗх в ацетатном буфере (рН 4,5)

3 мг/мп. В пробирку наливают 2 мп раствора субстрата, термостатируют при 40 С в течение 5 мин, приливают 1 мп ферментного раствора, взбалтывают и инкубируют при 40 С ровно

l0 мин, после чего добавляют 6 мп осадителя (80K-ный монометиловый эфир этиленгликоля, содержащий 50 мМ

58 4

ZnCin), Реакционную смесь вз балтыв ают, выдерживают в течение 5 мин для полного выпадения осадка и фильтруют через бумажный фильтр, после чего определяют оптическую плотность фильтрата на фотоэлектроколориметре

ФЭК-56M (фильтр 5,Л =490+!О нм ) против контрольной пробы. Для приготовления контрольной пробы в пробирку наливают 2 мп раствора субстрата, 6 мл осадителя,взбалтывают,добавляют

1 мл ферме HT HoI раствора, выдерживают в течение 5 мин и фильтруют через бумажный фильтр.

Оптическая плотность 0,330.

Эндоглюканазную активность рассчи-! гывают по формуле (!) 0 33г 9

ЭА = --- -----

0 3

И о и м е р 3. В апетатном буфере (рН 4,5 ) готовят 27 — ный раст—

Вор карбоксиметилцеллюлозы, окрашенной активным красителем алым 4ЖТ.

Концентрация пектофоетидина ГЗх в ацетатном буфере (pH 4,5) 3 мг/мл.

В пробирку наливают 2 мл ?Т-ного раствора субстрата, термостатируют при 40 С в течение 5 мин, приливают l мл ферментного раствора, взбалтывают и инкубируют при 40 С ровно

l 0 мин, после чего добавляют 9 мп осадителя (смесь 8 мп

СН ОН и 1 мп водного 50 мМ раст вора КС1), взбалтывают, выдерживают

5 мин для полного выпадения осадка и фильтруют через бумажный фильтр, после чего определяют оптическую плотность фильтрата на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М (фильтр 5, Л.=490+ 10 нм) пр оти в конт рол ьн ой пр обы. Для приготовления контрольной пробы в пробирку наливают 2 мл раствора субстрата, 9 мл осадителя, взбалтывают, добавляют l мп ферментного раствора, выдерживают в течение 5 мин, после чего фильтруют через бумажный фильтр.

Оптическая плотность 0,23.

Эндоглюканазную активность исследуемого препарата рассчитывают по формуле (1) 0 23 12

ЭА = r 1000 = 92 уел,ед/г.

10е 3

Пример 4. В ацетатнам буфере(рН 4,5) готовят 17-ный раствор карбоксиметилцеллюлозы, окрашенной

1112058 активным красителем ярко-красным

2СХ. Концентрация целлюлазного препарата "Рапидазы", (Франция) в ацетатном буфере f(pH 4,5) 0,2 мг/мп.

В пробирку напивают 5 мл раствора субстрата, термостатируют при 40ЬС в течение 5 мин, приливают I мл ферментного раствора, взбалтывают и инкубируют при 40 С ровно 10 мин, после чего добавляют 3 мл осадителя )0

< смесь 807.-ного этанола и изопропанола I: l, содержащая 5 мМ MgSOc) .

Реакционную смесь взбалтывают, выдерживают I мин для полного выпадения осадка и фильтруют через бумажный I5 фильтр, после чего определяют оптическую плотность фильтрата на фотоэлектроколориметре ФЭ К-56М (фильтр

6,3. =540+10 нм)) против контрольной пробы. Для приготовления контроль- 20 ной пробы в пробирку наливают 5 мл раствора субстрата, 3 мл осадителя, взбалтывают, добавляют мл ферментного, раствора, выдерживают в течение !/мин и фильтруют через бумажный фильтр.

Оптическая плотность 0,48.

Эндоглюканазную активность рассчитывают по формуле (1) 0,48 9

ЗО

ЭА = -- — — — 1000 = 2 !60 усл.ед/х;

lO 0,2

Характеристики использованных препапатов приведены в табл. 1..

Иэ табл. видно, что корреля35 ция имеется только меэ у данными второй и шестой колон;, т. е. между эндоглюканаэной актив )cTbедлагаемому способу /(см. чертеж). В то же время никакой корреляции между активностями других компонентов целлкпазного комплекса и активностью по окрашенной карбоксиметилцеллюлозе ((предлагае<ый способ ) не наблюдается.

Таким образом, предлагаемый метод пригоден для селективного определения активности- эндоглюканазы в целлюпазных комплексах в присутствии других компонентов.

На чертеже приведена коррелляционная зависимость между эндоглюканаэной активностью, определенной при помощи предлагаемого способа, и данны-. ми, полученными вискозиметрическим способом.

На чертеже обозначены: точка I пектофоетидин ГЗх; точка 2 — целлови" ридин; точка 3 — целлокандин ГЗх; точка 4 — целлобронин Г10х; точка 5 ферментный препарат фирмы "Рапидаэа".

Кроме того, существует возможность пересчета полученных по формуле (1)

I, условных единиц в международные

1Аме,<<д !< ) с тем, чтобы можно было сравнивать данные, полученные в разных лабораториях.

Формула пересчета следующая: где К вЂ” тангенс угла наклона, измеренный для карбоксиметилцеллюлозы с данной степенью окраски; 1)<- оптическая плотность 0,17ного раствора окрашенной карбоксиметилцеллюлозы, использованной для построения калибровочного графика до начала реакции;

3 — оптическая плотность О, 17.— ного раствора окрашенной карбоксиметилцеллюлозы из другой партии.

Отношение )Р / <)„ введено в формулу для того, чтобы небольшие (на

l0-207.) изменения степени окраски карбоксиметилцеллюлозы не сказывались на определении абсолютной активности.

Предлагаемый способ определения эндо- <(1-> 4 глюканазной активности в целлюлозных комплексах по сравнению с известным обеспечивает. повышение производительности определения примерно в 4 раза, повышение точности определения в 2 раза, а также воз— можность пересчета полученных условных единиц в международные единицы активности.

1112058

Т абл ица 1

ЭА, усл.ед.

Активность в международных единицах

Пр еп ар ат целло би огидролазы ндолюкаэкзо- целло

-лю- биазы азы кози дазы

Целлобронин Г10х

80-100 30-40 35 !

34 !

Целловиридин ГЗх

30 20

8 àl

Пектофоетидин ГЗх

àl 25

l 5 4.l

Фер мент ный препарат фирмы "Рапидаз а" (Фр анция1 420

1845

Целлокандин

ГЗх

45 25 10 10

233 Активность определена с помощью методов, описанных в прототипе, + Активность определена по предлагаемому способу по примеру 1

Таблицами

Серия Число опр едел ений

Способ определения

Среднее значение

Дисперсия, у зндоглюканазной активности, ед/г

Пр едл агаемый

По примеру

341

300

4,6

394

360

392

5,4

350

448

5 2

402

71

Известный

78

1 10

2 8

1 10

2 10

1 8

2 10

Коэффициент вариации

Ч=- 100

А

ll!2058 ЙюЖ у>

Составитель О. Скородумова

Редактор С. Пекарь Техред Л.Иартяшова Корректор О.Тигор

Заказ 64 I9/ l 8 Тираж 52! Подпи сиое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

l l 3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, уп,Проектная, 4