Способ определения активности @ -зависимых дегидрогеназ

Способ определения активности @ -зависимых дегидрогеназ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ NAДH-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ путем добавлення КАДН-зависимой депщрогеиазы , ее субстрата - акцептора злектроИОВ и NAДH в реакционную смесь,содержащую люциферузу, NAДH:ФMH-oкcидopeдyктазу и их субстраты с последуюш}1м измерением биолюминесценции,о тличающийс я тем, что, с целью повышения точности способа ,ийпользуют субстрат - акцептор электронов в насыщающей концентрации, а МАДН в концентрации М и активность определяют по константе псевдопервого порядка спада биолюминесценции.

СООЗ СООЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (l9) (l »

IS»4 G 01 N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

/ "ч /

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕРАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К ABTOPCHO5hY СВИДЕТЕЛЬСТВУ..(21) 3733406/28-14 (22) 16.02.84 (46) 071185. Бюл. я 41 (7i) Институт биофизики СО АН СССР (72) В. Н. Петушков, Л. П. Шефер, Н. С. Родионова и А. М. Фиш (53) 577.15 (088.8) (56) Докладь1 АН СССР, 1983, т. 270, N 5, с. 1239 — 1242. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХАДН-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНА3 путем добавления ХАДН-зависимой депщрогеназы, ее субстрата - акцептора электро. нов и ХАДН в реакционную смесь, содержащую люцнферузу, ХАДН:ФМН-оксидоредуктазу и их субстраты с последующим измерением биолюминесценцин,о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа,используют субстрат - акцептор электронов в насыщающей концентрации, а ХАДН в концентрации 10 -10 М и активность определяют по константе псевдопервого порядка спада биолюминесценции .

119026

Составитель Н. Гуляева

Техред М.Гергель Корректор Т. Колб

Редактор Е. Папп

Заказ 6972/46 Тираж 896 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб,, д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретенйе относится к биохимии и мо-жет быть использовано в технической микробиологии и медицинской диагностике и предназначено для измерения микроколичеств

ХАДН- зависимых дегидрогеназ. S

Цель изобретения — повышение точности способа.

Пример. В качестве NA3H-зависимой дегидрогеназы использовали лактатдегидрогеназу из сердечной мьшщы свиньи с удель- 10 ной активностью 200 ед/мг (Reanal — Венгрия) .

К образцу, содержащему 50 мкл миристинового альдегида, 1,09 ° 10 М; 50 мкл флавинмононуклеотида, 2,5 ° 10 М; частично очищенный препарат люцифераэы из Beneckea >>

harveyi, содержащей и NA3H ФМН-оксидоредуктазу (активность люциферазы 7.IO кВ с, активность ХАДН ФМИ-оксидоредуктазы—

0,01 мкмоль/мл) - 30 мкг; 100 мкл пирувата, 8 10 М; 0,1 мкг лактадегидрогеназы; 460 мкл

0,1 М; К, Na-фосфатного буфера, рН вЂ”. 70 добавляли 100 мкл ХАДН 1,2 ° 10 М. Из3 г мерение проводили в термостатируемой кювете при 30 С.

Для учета неспецифического окисления

ХАДН измерения, аналогичные описанным выше, проводилй в отсутствии NA3H-зависимой дегидрогеназы. Кинетика уменьшения биолюминесценции в присутствии и отсутствии лактагидрогенаэы соответствовала псевдопервому порядку. Констанку лсевдопервого порядка спада биолюминесценции рассчитывали по формуле

Константы спада биолюминесценции в присутствии и отсутствии ХАДН составляют

15,8 мин и 0,22 мин соответственно.

Аналогично были посчитаны константы спада и для других концентраций лактатдегидрогеназы. Константа спада К прямо пропорциональна количеству лактатдегидрогеназы.