Способ получения солей мурамилпептидов

Способ получения солей мурамилпептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается замещенных пептидов, в частности натриевых солей мурамилпептидов: N-ацетил-мурамил-Ъ-аланил-Б-глютамил-(С 1)-L-ала нил-2- (1,2-дипалмитоил-Зп-глицеро-3- -оксифосфорилокси)-этилс1мида (l); N- -аце тил-мурамил-L-аланил-В-глютамил- -(Cot)-алкиловый эфир ( )-(CV)-L- -аланил-2-(I,2-дипальмитош1-5п-глицеро-3-оксифосфорилокс-О-этиламида (и), которые обладают антивирусной активностью и могут быть использованы в медицине. Для выявления активности ; среди замещенных пептидов были получены новые соли I и II. Синтез ведут из N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты или ее С( алкилового () эфира, который в среде смеси растворителей (СН 01 + ) в присутствии N-оксисукцинимида и дициклогексилкарбодиимида конденсируют с натриевой солью Ь-аланил-2-(1,2- -дипальмитоил-8п-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида при комнатной температуре. Испытания I и II показывают , что они обладают лучшей антивирусной активностью, чем известньп Н-ацетил-мурамил-Ь-аланил-2-(1,2-дипальмитоил-8п-глицеро-3-оксифосфорилокси)-зтенсламид (пирогенность в лТ °С, .составляет 0,48-1,1 против 2). Кроме того, I и II можно использовать против вирусных и бактериальных воз- ,будителей и для профилактики заболеваний . 4 табл. СО ьо со со СЛ О5 СМ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УБ ЛИК

ВСЕС(1УЗ,,4 Я

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

В%В. 1В У ;"Pg p, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3622707/23-04 (22) 22.07.83 (31) 4527/82 (32) 23.07 ° 82 (33) СН (46) 23.03.87. Бюл. 11 ll (71) Циба-Гейги АГ (СН) (72) Альберт Хартманн, Оскар Вакер, Герхард Башанг и Лайош Торчай (DE) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Шредер Э. Любке К. Нептиды, М.;

Мир, 1967, ч. 1, с. 116.

Европейский патент 0025495, кл. С 07 С 103/52, опублик. 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕЙ МУРАМИЛПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается замещенных пептидов, в частности натрневых солей мурамилпептидов: И-ацетил-мурамил-L- аланил-Э-глютамил- (С ф) -L ала нил-2-(1, 2-дип алмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси) -этиламида (I ) N-аце тил-мур амил-L-аланил-D-глютамил-(0d.)-алкиловыи эфир (С -С )-(С Р)-?» -аланил-. 2-(1,2-дипальмитоил-зп-глипе, SU„„1299516 А3 (51)4 С 07 К 9/00; А 61 К 37/02 ро-3-оксифосфорилокс- )-этиламида (II), которые обладают антивирусной активностью и могут быть использованы в медицине. Для выявления активности среди эамещенных пептидов были получены новые соли I u II. Синтез ведут из N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты или ee C(d) алкилового (С,-С ) эфира, KQTopbBI в среде смеси растворителей (СН С1 + СН OH) в присутствии N-оксисукцинимида и дициклогексилкарбодиимида конденсируют с натриевой солью L-аланил-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида при комнатной температуре. Испытания I u II показывают, что они обладают лучшей антивирусной активностью, чем известныйN-ацетил-мурамил-L-аланил-2-(1,2-дипальмитоил-Нп-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этаноламид (пирогенность в ьТ С, .составляет 0,48-1,1 против 2).

Кроме того, I u II можно использовать против вирусных и бактериальных воз:будителей и для профилактики заболеваний. 4 табл.

1299516

Изобретение относится к способу получения солей мурамилпептидов — новых биологических активных соединений, которые могут найти применение в медицине ° 5

Цель изобретения — получение новых производных в ряду мурамилпептидов, обладающих более высокой антивирусной активностью и низкой токсичностью.

1О

П р и и е р 1. 3,60 r(5,66 моль) (Col)-п-бутилового эфира N-ацетилиураиил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты, 0,6 моль воды и 0,88 г(7,54ммоль)

N-оксисукцинимида при непрерывном перемешивании растворяют в 20 мл смеси хлороформа и метанола при объемном соотношении 4:1. В смесь вводят 1,6 r (7,54 ммоль) твердого дициклогексилкарбодиимида и по каплям в течение

4 ч при комнатной температуре добавляют раствор 3,7 (4,72 ммоль) натриевой соли L-аланил-2-(1,2-дипальмитоил-глицеро-3-оксифосфорил-окси)-этил-амида в 40 мл хлороформа. Смесь выдерживают 1 ч, упаривают на роторном испарителе, к остатку добавляют

200 мл диоксана, раствор лиофилизуют., Продукт суспендируют в 100 мл хлороформа, добавляют 600 мл эфира уксусной кислоты, смесь при непрерывном перемешивании охлаждают в ледяной бане в течение 1 ч. Нерастворившиеся частичци дициклогексилкарбодиимида отфильтровывают, фильтрат упаривают, Остаток растворяют в 14 мл смеси хлороформа-метанола и воды 70:30:5 (объемное соотношение) и очищают на колонке (диаметр 4,5 см, длина 80 си), заполненную 700 r геля кремневой кис— лоты 60 (Мерк, 70-230 Nem, А$ТМ) в указанной смесирастворителей. Прого,няют 500мл указанной смеси, затем этой же смесью элюируют продукт. собиоая фракции объемом 10 мл N - 133-152и 153236, их раздельно подвергают диофильтрации. Процент основной фракции растворяют в 300 мл бидистиллированной воды, быстро нагревают до 40 С, после охлаждения пентрифугируют, удаляя нерастворивииеся частички дициклогексилмочевины.

Надосадочную жидкость подают в диализатор (Аиикон Корпорейшн, Данвер, Массачуает, 01932 СНА, модель

ЦО2, ультрафильтр РМ, 10176 мм диаметр, инертный, неонный полимер на основе полисульдюна, средняя неличина пор 10 А) и, подвергают диализу при 4 атм техн, против 1,5 л бидистиллированной воды, 0,5 л буферного раствора фосфата-хлорида натрия (по О,1 М, 1:1, рН = 7) и 1,5 л воды полного вымывания хлоридов.

Полученный продукт диализа (70 мл) стерильно фильтруют на фильтре с милипорами (0,2 MKM) и лиофилизируют. ,Получают натриевую соль N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютамил-(Сд)-н-бутилэфир-(С7)-L-алании-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-3-окси-фосфорилокси)-этиламида (3 4 моль Н О)

У z в виде бесцветного порошка в количестве 4,13 r (67 от теории):

1, ) = + 14 + 1 С (С = 0,44; вода);

Bf = 0,37 (хлороформ:метанол:вода = 70 : 30 : 5);

Rf = 0,64 (этиловый эфир уксусной кислоты : н-бутанол-пиридин:уксусная кислота:вода = 42:21:21:6:10)

Рассчитано, : С 54,77; Н 8,94;

М 5,07; P 2,24; Н О 4,71

С Н

Найдено, %: С 54,3; Н 9,1; N 5,6;

Р 2,3 Н,О 4,7, Рассчитано: Na 1,75

С Н,„ О, 11 РБа (1316,59)

Найдено,", Na. 1,57.

Исходный продукт получают следующим образом.

5,5 г (8,1 ммоль) (С)-и-бутил-(С)-бензилэфир-4,6-0-изопропилиден-И-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты растворяют в 60 мл

60 -ной уксусной кислоты и оставляют на ночь при комнатной температуре.

Желтоватый раствор выпаривают приблизительно наполовину на роторном ис-, парителе при 30 С, лиофилизуют, 4,8 г (7,5 ммоль) полученного продукта растворяют в 100 мл смеси диметоксиэтана и воды (9:1), смешивают с 0,8 г катализатора, состоящего из окиси палладия на угле (10 =ный) и в течение 4 ч обрабатывают водородом, катализатор отфильтровывают, Фильтрат упаривают, остаток чистят дважды хроматографией на геле кремневой кислоты 60 (Мерк, 1:200, фракции 10 и 5 мл) в системе хлороформ: метанол: вода 70:30:5.

Фракции, содержашие.продукт, объединяют, упаривают.

Полученный продукт частично представленный в виде натриевой соли

3 12995 (из геля кремневой кислоты) растворяют в 40 мл бидистиллата и пропускают через 50 мл хорошо очищенного ионообменника (Dowex 50w х 8 50/100 меш, форма Н) колонку промывают 100 мл бидистиллата, элюат фильтруют через фильтр с миллипорами 0,2 МкМ и лиофилизуют. Получают 3,7 г (69_#_ от теории) (Cd)-и-О-утиленэфира-N-ацетил-мурамил-L-аланилЭ-глютаминовой 10 кислоты в виде бесцветного порошка, содержащего 0,6 моль воды. 3 +45 + 1 С (С = 1,142, метаЭ нол);

Rf 0,23 (хлороформ:метанол:вода

70:30:5);

Rf 0,40 (Н-бутанол:уксусная кислота:вода 75:7,5:21).

Исходный материал получают следующим образом. 20

4,4 г (11 ммоль) натриевой соли

N-ацетил-4,6-0-изопропилиден-мурамиловой кислоты (2,5 моль, 1 г) суспендируют в 60 мл диметилформамида.

При интенсивном перемешивании последовательно добавляют 4,4 г (11 моль) хлоргидрата (Со0-и-бутиловый эфир-(Сд.)-бензиловый эфир L-аланил-D-глютаминовой кислоты, 2,53 г (22 ммоль

N-оксисукцинимида и 2,5 г (12,1 ммоль)30 дициклогексилкарбодиимида, смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.

Для переработки суспензии последнюю разбавляют 100 мл этилового эфи- 35 ра уксусной кислоты и после получао сового размешивания при 0 Г отфильтровывают нерастворившиеся частички (дициклогексамочевина, хлорид натрия)

Фильтрат упаривают в вакууме при

30 С, остаток вводят в 400 мл уксусного эфира и экстрагируют биди тиллированной водой (10х50 мл). После сушки органической фазы и упаривания растворителя остается 5,6 r (Cd)-и45

-бутилэфира-(Со )-бензилэфира N-ацетил-4,6,0-изопрополиден-L-аланил-D. -глютаминовой кислоты в виде аморфного порошка (75Х от теории).

/ot(> = +30 + 1 С (С = 0,732; мета- 50 нол);

Rf = 0,87 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,83 (ь -бутанол:уксусная кис«55 лота:вода 75:7,5:21).

Исходный продукт получают следующим образом.

16 4

5,6 г (12,1 ммоль) (Cd)-n-бутилэфир-(ry)-бензилэфира N-третичн. бутилоксикарбонил-L-аланил-В-глютаминовой кислоты растворяют в 20 мл абс. этилэфира уксусной кислоты, при интенсивном перемешивании и исключении попадания влаги по каплям . вводят

50 мл 4,5 н. соляной кислоты в абс. уксусном эфире и смесь оставляют о стоять в течение часа при 0 С. Желтоватый раствор упаривают при комнатной температуре приблизительно до

20 мл, смешивают с 150 мл диоксана и лиофилизируют. Получают 4,75 г (97X от теории) гидрохлорида (CW)-и-бутилэфир-(Сp)-бензилэфир-L-аланил-Р-глютаминовой кислоты в виде бесцветного масла

r.< -), = +19 + 1 С (С = 0,313; метанол);

Rf = 0,58 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5), Rf = 0,56 (этил-эфир уксусной кислоты: и -бутанол:пиридин:вода =

= 42:21:6:10).

Исходный продукт получают следующим образом.

К 8,5 г (25,8 ммоль) гидрохлорида (Сс ) — и-бутилэфир-(Сg)-бензилэфир-D-глютаминовой кислоты и 7,4 r (25,8 ммоль) N-трет.бутилоксикарбонил-L-алании-N-оксисукцинимидэфира растворенных в 150 мл диметилформамида, добавляют 2,6 r (25,7 ммоль) Nметилморфолина и смесь оставляют стоять в течение 20 ч при комнатной температуре, Прозрачный желтый расто вор выпаривают в вакууме при 30 С, полутвердый остаток вводят в 500 мл этилового эфира уксусной кислоты и экстрагируют семь раз безводным сульфатом натрия. Остаток после выпаривания уксусного эфира чистят на

600 r геля кремневой кислоты 60 (Мерк, размер зерна 70-230, меш А$ТМ) в системе хлороформ:метанол = 98:2.

Продукт в фракциях 36-82 собирают и высушивают. Получают (Cd)- -бутилэфир-(СУ)-бензилэфир-N-трет.-бутилоксикарбонил-L-аланин-D-глютаминовой кислоты в виде бесцветного масла (6 r, 502 от теории). 3 = +7 + 1 С (С = 0,315; диЭ метилформамид); .Rf = 0,73 (хлороформ:изопропанол:

:уксусная кислота = 70:8:2);

Rf = 0,75 (n -бутанол:уксусная кислота:вода = 75:7,5:21).

5 12

Исходный продукт получают следующим образом.

К 1!,Or (30 ммоль) (Cd)-и-бутилэфир-(СУ)-бензилэфира И-трет.-бутилоксикарбонил-D-глютаминовой кислоты, растворенного в 25 мл абс. этилового эфира уксусной кислоты, добавляют на холоде при постоянном помешивании и исключении попадания влаги 25 мл

4 н.соляной кислоты в абс. этиловом эфире уксусной кислоты и оставляют все это стоять в течение часа. Легколетучие составляющие упаривают при

25 С, масляный остаток вводят в

150 мл абс. диэтилового эфира и смесь упаривают снова (3 мл). Масляный остаток высушивают над натровым асбестом при полувакууме. Получают гидрохлорид (Cd) — и-бутиловый эфир-(C"г)—

-бензилового эфира D-глютаминовой кислоты (8,5 г; 92,4Х от теории). (d.1 = 9 + 1 С (С = 0,646; меЭ танол );

Bf = 0,82 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,68 (этил-эфир уксусной кислоты и-бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 42 21:21:6:10).

Исходный продукт получают .следующим образом.

20,0 г (64,6 ммоль) (CY)-бензилового эфира Б-трет.-бутилоксикарбонил-D-глютаминовой кислоты растворяют в

750 мл абс,тетрагидрофурана, 25,05 г (64,6 ммоль) карбоната цезия (слука, чистый), растворенных в 80 мл воды вводят по каплям и всю смесь улари— вают в вакууме. Остаток растворяют в

200 мл абс.диметилформамида, растворитель упаривают и всю операцию повторяют. Кристаллический остаток, полученный после сушки в высоком вакууме, растворяют в l л абс. диметилформамида и при постоянном перемешивании по каплям вводят 13,3 г (97 ммоль) и -бутилбромида.

Суспензию, полученную после 18-ча сового перемешивания при комнатной температуре, фильтруют, фильтрат упаривают наполовину и после добавления

1 л этилового эфира уксусной кислоты экстрагируют водой (10xl00 мл). Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и упаривают, Масляный остаток вводят в 100 мл диэтилового эфира и кристаллизуют благодаря добавке

1800 мл петролейного эфира и выдерж- ке при -10 С. Кристаллическую массу

99516 отсасывают, промывают и высушивают, Получают (Cd.) — и-бутилэфир-.(Сd)-бензилэфир N-трет.-бутилоксикарбонил-D-глютаминовой кислоты в виде бесцветных игл (21 г; 89 от теории).

Т„ = 70-71 С; (3 = 20+1 С (С = 1,149, метаЗ нол);

Rf = 0,77 (хлороформ:изопропанол:

:уксусная кислота = 30:8:2);

Bf = 0,92 (этил-эфир уксусной кислоты:й.-бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 42:21:21:6:10).

L-алании-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-.3-оксифосфорилокси)-этиламид, служащий в качестве исходного продукта, получают следующим образом.

13,25 г (14,9.ммоль) N-трет.-бутилоксикарбонил-L-аланин-2-(1,2-дипалмитоил-Бг;глицеро-3-оксифосфорилокси)-этил-амид вводят при постоянном перемешивании вводят в 170 мл охлажденного до 0 С смеси из трифторуксусной кислоты и хлористого метилена при соотношении 1:3 (V:V), причем получают прозрачный раствор.

После выдержки в течение 2 1/2 ч при комнатной температуре раствор упаривают на роторном испарителе при 30 С. Полутвердый остаток для удаления избыточной трифторуксусной кислоты смешивают неоднократно каждый раз со 100 мл хлорида метилена и затем выпаривают, 35 После пятикратного перетирания остатка каждый раз со 100 мл абс. диэтилового эфира и отстаивания полученного продукта получают хорошо фильтруемую суспензию. Ее фильтруют .

40 на нутч-фильтре, промывают твердый продукт диэтиловым эфиром, затем дважды каждый раз 100 мл горячего ацетона и сушат в вакууме при 6070 С. Получают 10,9 г L-алании-245 -(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламид в виде бесцветных кристаллов с Т „ = 138-147 С (95,67, от теории). ° (d-1 = +30 + 1 С (С = 1, хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,14 (хлороформ:метанол =

7:3);

Rf. = 0,40 (хлороформ:метанол:вода = 70 30:5).

Полученный таким образом продукт переводят в натриевую соль следующим образом.

7 1299516 s

3,82 г (5 ммоль) L-аланин-2-(1,2- ный раствор упаривают на роторном

-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфо- испарителе до сухого состояния (30 С), рилокси)-этиламида растворяют в Полученный продукт очищают на геле

100 мл смеси хлороформ:метанол = 7:3 кремневой кислоты 60 (Мерк, размер при кратковременном нагревании до 5 зерен 70-230 Меш, ASTM) в системе

35 С. Охлаждают и осторожно добавля- хлороформ:метанол:вода = 70:30:5 ют по каплям 5 мл 1N натрового щело- (5 мл фракций). Фракции содержащие ка. Прозрачный раствор выпаривают продукт, собирают (ДС) . Остаток посприблизительно до 1/З.первоначально- ле выпаривания растворителя растворяго объема и после добавления 200 мл 10 ют в 250 мл дважды дистиллированной диоксана лиофилизируют. Получают нат- воды и очищают аналогично тому, как риевую соль L-алании-2-(1,2-дипальми- это описано в примере 1, путем дитоил-Sn-глиперо-3-оксифосфорилокси)- фильтрации (AMICON-мешалка, тип 402, -этиламида в виде рыхлого порошка ультрафильтр 9.30/76 мм). Раствор, (0,41 г). 15 остающийся в мешалке, фильтруют чеПример 2. 3,5 г (6,9 ммоль) рез фильтр с миллипорами (0,2 МКм) и

-(Cck)-метилового эфира N-ацетил-му- лиофилизируют. Получают натриевую рамил-L-этенил-Э-глутаминовой кисло-, соль N-апетил-мурамил-L-аланил-Dты и 1,2 г N-оксисукцинимида раство- -глютамид-(Cat)-метилэфир-(СP)-1-аларяют в 50 мл смеси, состоящей.из ди- 20 нин-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицерометилформамида, изопропанола и хлоро- -З-оксифосфорилокси)-этил-амида, форма (1:3:6; V:V:V), добавляют 2,96 моль Н О в виде бесцветного по2

2,10 r (10,35 ммоль) дициклогексил- рошка.

20 о карбодиимида и при исключении попада- t l =+11 + 1 С (С = 0,285;

3 ния влаги при помешивании выдерживают25 10 — ная уксусная кислота);

1 ч при комнатной температуре. Cyc- Rf = 0,25 (хлороформ:метанол:вопензию смешивают с 50 мл этилового да = 70:30:5.); эфира уксусной кислоты, 30 мин выдер- Rf = 0,39 (этиловый эфир уксусной живают при перемешивании в ледяной кислоты: п -бутанол-пиридин:уксусная ванне-и затем отфильтровывают нераст->О кислота:вода = 42:21:21:6:10) (в воримые частицы дициклогексилмочеви- кол-ве 3,1 г; 55% от теории) ° ны. Фильтрат упаривают на роторном Исходные соединения получают. слеиспарителе приблизительно до 40 мл, дуюшим образом. в результате добавления 150 абс. ди- 7,7 r (21,2 ммоль) гидрохлорида этилового эфира выпадает сложный 35 (Col)-метилэфира-(CY)-бензилэфира активный эфир (дважды), фильтруют и L-аланил-Р-глютаминовой кислоты и высушивают, в результате получают 8,96 r (23,3 ммоль) натриевой соли эфир с N-окси-сукцинимидом с Rf = N-ацетил-4,6-0-изопропилиден-мурами= 0,43 (хлороформ:метанол:вода = новой кислоты соединяют аналогично

70l30:5) — сырьевой продукт в ко- 40 примеру 1 по методу дициклогексикарличестве 5,1 .г. бодиимид): N-окси-суксинимид, Полу3,43 r (4,4 ммоль) L-алании-2- ченный продукт без дальнейшей очист-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-Ç-окси- ки расщепляют в 100 мл 60 -ной укфосфорилокси)-этиламида суспендируют сусной кислоты. После 5 1/2 ч мешао в 45 мл хлороформа и при 40 C в те- 45 ния при комнатной температуре растчение 5 мин по каплям вводят 0,86 мл вор упаривают, смешивают с водой, (6,1 ммоль) триэтиламина, растворен- вновь упаривают и после добавки . ного в 5 мл хлороформа, при этом по- 100 мл диоксана лиофилизируют. Остадлучают прозрачный раствор. К нему по ток чистят на 60 мл геля кремневой каплям при интенсивном мешанин 0 кислоты в системе хлороформ:метанол: при исключении попадания влаги ..вода 70.30.5 (7 мл фракции), про в течение 5 мин добавляют раствор цесс проводится дважды. указанного активного сложного эфира Фракции, содержание необходимый в 100 мл смеси, состоящей из диметил- продукт, объединяют, растворитель формамида, хлороформа и диоксана 55 упаривают. В остатке (Сс )-метилэфир(1:14:6; V:V:V). (С 7) -бензилэфир N-ацетил-мурамил-LПосле 2 1/2 ч перемешивания при -аланил-D-глютаминовой кислоты в викомнатной температуре несколько мут- де бесцветной пены с Rf = 0,63 хло9 1 2995 роформ:метанол:вода = 70:30:5) в количестве 6,9 r.

6,0 г (10 ммоль) (СЫ)-метилэфир-(Су)-бензилэфир Н-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты, ра- 5 створенного в смеси 1,2 диметоксиэтана и воды 95,5 (Ч:V) гидрируют в присутствии 0,6 г катализатора палладий на угле (10 -ный) в течение 1

1/2 ч при нормальном давлении. Ката- t0 лизатор отфильтровывают и фильтрат упаривают при комнатной температуре при повышенном давлении. Остаток чистят на 400 г геля кремневой кислоты

60 в системе хлороформ:метанол:вода= 15 — 70:30:5 (10 мл фракций), как было указано выше.

Фракции, содержащие продукт,, объ— единяют, растворитель упаривают, Остаток в форме соли натрия чистят от 20 солей, как описано в примере 1, на

50 мл Dowex 50 WX 8 (50/100 Меш, форма Н, сильнокислотный катионообменник). Фильтрат пропускают через фильтр с миллипорами (0,45 мкм) и лиофилизируют. Получают (Cd)-метиловый эфир N-ацетил-мурамил-L-аланил-Р-глютаминовой кислоты (1,27 моль

Н 0) в виде бесцветного порошка с (д.3 = +47 + 1 С (С = 1,249; мета- 30 нол) в количестве 3,1 r (58 от теории).

Rf = О;80 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

БГ = 0,30 (ацетоннитрил:вода = 35

3:1);

= 0,43 (этиловый эфир уксусной кйслоты:уксусная кислота:вода:метанол = 67:10:23:12).

Пример 3, 9,4 г (11,1 ммоль)40 (Col)-трет.-бутилэфира N-auevvrv-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты переводят аналогично примеру 2 в активный эфир и затем, как описано. соединяют с 6.48 г (8,2 ммолв) L- 4>

-алании-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида в присутствии триэтиламина. Полученный продукт суспендируют в 250 мл бидистиллата воды и быстро нагревают до >О

37 С, перемешивают 15 мин в ледяной ванне, отфильтровывают нерастворимые частички дициклогексилмочевины и фильтрат подвергают диафильтрации, как описано в примере 1 (AMICON — ме- шалка 402, ультрафильтр РМ 0 30/76 мм

Остающийся в мешалке раствор (120 мл) лиофилизируют и продукт чистят на

16 1О хроматографе на 550 r геля кремневой кислоты 60Ä

Получаемый продукт собирают, смешивают с 200 мл бидистиллированной воды (рН=7), фильтруют в стерильных условиях (0,45 мкм) и лиофилизируют, Получают натриевую соль N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютамил-(Cck) †трет-бутилэфир-(Сg)-L-алании †-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-3 †îêñèôîñôîðèëокси)-этил-амида в виде бесцветного порошка, содержащего 3,4 моль воды. (с 3 -- +14 + 1 С (С = 0,817; .10 -ная уксусная кислота);

Rf = 0,29 (хлороформ:метанол:вода = 70:30"5);

Rf = 0,53 (этиловый эфир уксусной кислоты: Л -бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 4 2:21:21:6:IO). Выход натриевой соли 8,39 r 78 от теории, Пептидпроизводное, используемое в качестве исходного продукта, получают следующим образом.

38,3 г (63,5 ммоль) (Со()-трет,—

-бутилэфир-(С9)-бензилэфира N-12-(4-бифенилил)-пропилоксикарбонил)-?-аланил-D-глютаминовой кислоты растворяют в 700 м смеси из трифторэтана и воды = 9:1 (V/V) и в результате добавления по каплям 1,23 н.соляной кислоты в такой же смеси растворителей (1 об, ч. концентрированной соляной кислоты и 9 об. ч. трифторэтанола) значение рН уменьшается до 1,5 (2 1/2 ч, расход 51,66 мл, т,е. 81 от теории).

Светложелтоватый раствор на роторном испарителе в вакууме, создаваемом водоструйным насосом, при 30 С упаривают почти до 100 мл, затем добавляют 200 мл диоксана, смесь высушивают на холоде.

Полутвердый остаток растворяют в

30 мл абс, диэтилового эфира и при

0-5 С при постоянном перемешивании, и продукт осаждают 150 мл петролейного эфира. Выдерживают на холоде (-26 С), декантируют и повторяют эту процедуру дважды. Масляный остаток затем вводят в 100 мл, трет,-бутанола, лиофилизируют и остаток высушивают над натровым асбестом в высоком вакууме, Получают гидрохлорид (C<-трет.-бутилэфира (Сг)-бензилэфира Ь-аланил-D-глютаминовой кислоты в виде сильно гигроскопичного порошка.

1299516 (8jÝ + хлороформ);

Rf =,60 да = 70:30:5)

Rf = 0,45 лота:вода = 1 от теории).

7 + 1 С (С = 1,630; (хлороформ:метанол:во(и-бутанол:уксусная кис0:1:2:8) 19,25 r (76,57.

К охлажденному до 0 С раствору, состоящему из 65,96 г (0,2 моль) гидрохлорида (Сс()-трет.-бутилэфира-(С )-бензилэфира D-глютаминовой кислоты и 65,47 г (0,2 моль) N†- (? (4-бифенилил)-пропилокси-карбонил J-Ь-аланина в 650 мл абс. диметилформамида, добавляют при постоянном помешивании 22 мл (0,24-моль) Б-метилформалина и затем 59,11 r (0,24 моль)

2-этокси-М-этокси-карбонил-1,2-дигид, рохинолина. После 10-часового размешивания при комнатной температуре желтый раствор упаривают на роторном испарителе при 30 С. Остаток вводят в 1 л этилового эфира уксусной кислоты, экстрагируют водой (5x200 мл), водную фазу экстрагируют 0,5 л уксусного -эфира и собранные органические

Лазы высушивают.

Продукт, полученный после упаривания растворителя (продукта 150 мл) чистят многократно на хроматографе на геле кремневой кислоты 60 (1:20) с уксусным эфиром. Получают (СЫ)-трет.-бутилэфир-(С P)-бензилэфир-N-(2-(4-бифенилил)-пропилоксикарбонил-L-аланил-Р-глютаминовой кислоты в виде бесцветного масла. () = -14 + 1ОС (С = 1,625; этиЭ ловый эфир уксусной кислоты) (100 r, 832 от теории);

Rf = 0,73 (хлороформ:изопропанол:

:уксусная кислота = 70:8:2);

Rf = 0,51 (толуол:уксусный эфир

° 1)

Используемый в качестве исходного продукта гидрохлорид (Cd)-трет.-бутилэфира-(СУ)-бензилэфира D-глютаминовой кислоты получают путем проведения реакции между (С )-бензиловым эфиром D-глютаминовой кислоты и изобутанолом в смеси, состоящей из 1 4-диоксана и серной кислоты, выделяют продукт в виде бесцветных игл с Т„ — 108-109 С. (а3 = -16 + 1ФС (C = 1,235; этанол

Rf = 0,84 (хлороформ-метанол:вода = 70:30:5);

12

R f = О, 64 (этиловый эфир уксусной кислоты:4-бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 42:21:21:6 .10) в количестве 613 от теории).

5 Пример 4. К раствору 4,62 r (6,05 ммоль) ?,-алании-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида в 100 м смеси хлороформ:

:изопропанол:вода = 70:30:2 при помешивании при 15- С в течение 10 мин по каплям добавляют 14,52 г (7,26 ммоль) 0,5 М раствора триэтиламина в смеси хлороформ:изопропанол:

:вода = 70:90:2. Затем в течение

15 20 мин добавляют 4-мя порциями по

1,5 г в твердом виде 6 0 г (7,26 ммоль) (Со )-метилэфир-(СУ)-N-гидрооксисуксинимидэфира N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глю- таминовой кислоты, содержащий еще дициклогексилмочевину, причем раствор мутнеет на глазах.

Затем после 15-минутного помешивания при 15 С охлаждение прекращают и продолжают перемешивание еще 2

1/2 ч при комнатной температуре. 3атем полученный таким образом мутный раствор упаривают в вакууме при 30 С.

Остаток (10,75 г) суспендируют в

170 мл бидистиллированной воды (рН = 5,5), суспензию путем добавки

0,3 мл триэтиламина доводят до рН вЂ” 6,0; отфильтровывают нерастворимые частицы (дициклогексилмочевины) и

35 фильтрат лиофилизируют в высоком вакууме.

Полученный таким образом лиофилизат растворяют в 300 мл, затем лио40 филизируют в глубоком вакууме.

Получают натриевую соль N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютамил-(Cd)-метилэфир-(Сф)-L-аланин-2-(1,2-дипалмитоил- п-глицеро-З-ок45 сифосфорилокси)-этиламида в виде бесцветного порошка, содержащего

1,90 моль воды. о о = 3,7 + 0,1 С (С = 0,672; хлороформ); (d j = +1,7 + 0,1 С (С = 1,044; вода);

Rf = 0,42 (хлороформ.метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,62 (уксусный эфир:и-бута55 нол:пиридин:уксусная кислота:вода =

42:21:21:6:10) в количестве 5,64 r (71,27 от теории).

Исходный продукт получают следующим образом.

6 14 таминовой кислоты (0,68 моль волы) в

2О виде бесцветного лиоАилизата с Г<1>

= +14,9 + 0,1 С (С = 1,067; метанол), в количестве 11,0 г(96% от теории).

Rf = 0,78 (хлороформ:метанол:вода= — 7,:30:5);

Rf = 0,57 (уксусный эфир. п бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода =

= 42:21:21:6;10).

Исходный продукт получают следующим образом.

Раствор 20,7 r (32,46 ммоль) (Cd)-метилэфир-(СУ)-бензилэфира 4,6-0-изопропиллиден-N-пронионил-дезметилмурамил-Т-аланил-D-глютаминовой кислоты в 400 мл 60%-ной уксусной кислоте мешают в течение 21 ч при комнатной температуре, затем упаривают в вакууме при 30 С и полученный остаток последовательно трижды смеши1 вают каждый раз со .)00 мл воды и снова упаривают. Полученный сырой

1 родукт очищают путем хроматографии на колонне на 1000 r геля кремневой кислоты 60 (Мерк, 0,063-0,200 мм) в системе метиленхлорид:метанол = 85:

:15 (15 мл фракции). Фракции 207-290 собираются и выпариваются в вакууме при 30 С. Получают (Cd)-метилэфир-(CY)-бензилэфир Н-пропионил-дезметилмурамил-Т-аланил-D-глютаминовой кислоты, содержащей 0,24 моль воды (к1 = +16 + 0,1 С (С = 1,463;

Э метанол);

Rf = 0,24 (хлороформ:метанол =

= 9:1);

Rf = 0,55 (хлороформ:метанол =

5:1);

Rf = 0,94 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5) в количестве 13,7 r . (70,1% от теории).

Исходный продукт получают следующим образом.

В суспензию из 13,2 г (35,77 ммоль) натриевой соли 4 б-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в 200 мл диметилформамида добавляют при комнатной температуре при мешании 9,6 г (46,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, 5,35 r (46,5 ммоль) N-оксисукцинимида и

12,8 r (35,77 ммоль) гидрохлорида (Cd)-метилзфир-(СУ)-бензилэфира Т-алании-D-глютаминовой кислоты и все мешают в течение 21.ч при комнатной температуре.

Полученную таким образом белую суспензию смешивают с 200 мл уксус13 12995)

5,12 г (10,1 ммоль) g -метилового эфира N-пропионилдезметилмурамил-Т-аланил -D-глютаминовой кислоты полностью растворяют в 100 мл смеси хлороформ:изопропанол = 7:3 и в результате добавления 10 мл диметилформамида.

К этому раствору добавляют 2,68 г (13 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и 1,50 r (13 ммоль) N-оксисукциними10 да и полученный в результате этого прозрачный бесцветный раствор мешают в течение 1 1/2 ч при комнатной температуре и затем выдерживают 17 ч о 15 при 4 С.

Полученную таким образом суспен эию смешивают с 400 мл диэтилового эфира и затем перемешивают еще в течение 1 ч при комнатной температу20

PB °

Затем кристаллизат отсасывают, промывают диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме над пятиокисью фосфора.

Получают сырой (Сд)-метилэфир -4СУ)-N-оксисукцинимидэфир-N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов, содержащий в виде примеси дициклогексилмочевину и используемый без последуюшей очистки.

Rf = 0,46 (хлороформ:метанол =

5 ° 1 ) °

Rt = 0 72 (хлороформ. метанол =

Э

7:3) Выход сложного эфира 8,34 r, Исходный продукт получают следующим образом.

Раствор 13,0 r (21,75 ммоль) (Cd)-метилэфир-(Cy)-бенэилэфира N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты в 250 мл смеси диметоксиэтан:вода = 20:1 гидрируется

2,5 г катализатора палладий на угле (10%-ный) в течение 1 ч при комнатной температуре и нормальном давлении.

Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме до сухого состояния и полученный остаток трижды смешивают с водой в количестве по 50 мл и снова упаривают.

Осадок растворяют в приблизительно 100 мл бидистиллированной воды, фильтруют этот раствор через фильтр с миллипорами (МАТ GENES: 0,2 мкм) и лиофилизируют в глубоком вакууме.

Получают Ы -метиловый эфир N-пропио- нил-дезметилмурамил-Т вЂ” аланил-D-глю

l5 12995 ного эфира, перемешивают в течение

1 ч при 0 С, отделяют от кристаллиза1 тора (дициклогексилмочевины), на нутч-фильтре, промывают ледяным уксусным эфиром и фильтрат упаривают в о вакууме при 30 С. Полученный таким образом остаток вводят в 300 мл уксусного эфира и дважды последовательно промывают 50 мл 2 н. лимонной кислоты, водой, 10Х-ным раствором гидро- 10 карбоната натрия и снова водой.

Зфирные слои объединяют, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают в вакууме.

Получают (Cdá-метилэфир-(C g)-бен- 15 эилэфир 4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил;Р-глютаминовой кислоты.

Rf = 0,65 (хлороформ:метанол =

9:1); 20

Rf = 0,86 (хлороформ:метанол =

= 5:1) в количестве 21,3 r (93,3Х от теории).

Оба исходных продукта получают следующим образом.

К раствору 20,3 r (48,0 ммоль) (Сd)-метилэфир-(С )-бензилэфира N -трет.-бутилоксикарбонила-L-аланил-.

-D-глютаминовой кислоты в 100 мл абсолютного уксусного эфира добавляют 30 при 0 С 100 мл приблизительно 5 N соляной кислоты в абсолютном эфире и мешают 2 ч при 0 С, Желтоватыи раствор упаривают в вакууме, полученный остаток дважды сме- 35 шивают каждый раз со 100 мл абсолютного эфира и снова упаривают. После дигерирования с абсолютным диэтиловым эфиром (2x100 мл) остаток высушивают в вакууме и получают гидрохлорид (Cd)-метилэфир-(Сф)-бензилэфира L-аланил-D-глютаминовой кислоты, содержащий 0,31 моль воды. с 3 = +18,6 + 0,1 С (С = 0,043; метанол);

Rf = 0,72 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,44 (хлороформ:метанол

= 5:1);

Rf = 0 31 (хлороформ:метанол =

= 9:1) в количестве 1,7 г (94,8Х от теории).

Раствор 34,4 r (73,8 ммоль, 2,14 ммоль), содержащий хлорид натрия натриевой соли 1 < -О-бензил-4,6-0-иэопропилиден N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в 340 мл воды, гидрируют при постоянном значении

l6 l6 рН = 7,1 6,0 r 10K-ного катализатора палладий на угле в течение 23 ч при комнатной температуре и нормальном давлении. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме при 30 С и при рН = 7,1; и полученный таким образом остаток высушивают в высоком вакууме над пятиокисью фосфора. Получают натриевую соль

4,6-0-изопропилиден-Н-пропионил-дезметилмураминовой кислоты (16,6 r, 94,8Х от теории)

Rf = 0,50 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);.

Rf = 0,66 (ацетонитрил. вода =

= 3:1).

Исходный продукт получают следующим образом.

Раствор 14,3 г (32,7 ммоль) мети-. лового эфира 1 d- -О-бензил-4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в 130 мл метанола смешивают с 24,4 мл (48,7 ммоль) 2 н. натрового щелока и перемешивают в течение 1 1/2 ч при комнатной температуре.

Затем полученный таким образом прозрачный желтоватый раствор с помощью 1 н. соляной кислоты доводят до значения рН = 7,0 и упаривают в вакууме при 30 С.

После сушки над пятиокисью фосфо.ра получают натриевую соль 1 -0.†.бензил-4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов в количестве

27,2 г.

Rf = 0,67 (хлороформ .метанол:вода = 70:30:5);

Rf 0,74 (ацетонитрил:вода 3:1).

Исходный продукт получают следующим образом.

К суспензии из 6,75 r (224,7 ммоль) гидрида натрия в 120 мл абсолютного тетрагидрофурана добавляют по каплям о при 5 С в атмосфере азота при постоянном помешивании в течение 5 мин раствор 31 3 г (85,65 ммоль) 10=0-бензил-2-дезокси-4,6-0-изопропилиден- 2-пропионамид-3-D-глюкопиранозида в 200 мл абсолютного тетрагидрофурана, причем температура повышается до 20 С.

Полученную таким образом суспензию перемешивают erne 2 ч при 40 С, затем охлаждают до О и добавляют по каплям в атмосфере азота и непрерывном помешивании в течение 30 мин

12995!6 17 к охлажденному до -15 C раствору

20,7 r (135,77 ммоль) метилового эфира бромуксусной кислоты в 95 мл абс. тетрагидрофурана. Полученную таким образом суспензию размешивают еще в течение 3 ч при 0-5 С, затем добавляо ется 20 мл метанола и 20 мл тетрагидрофурана. С помощью 4,5 мл ледяной уксусной кислоты устанавливан т значение рН-6 и раствор упаривают в вакууме при 30 С.

Остаток растворяют 200 мл метиленхлорида и промывают полученный раствор водой (Зх125 мл). Собранные метиленхлоридные фракции высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и о упаривают в вакууме при 30 С.

Получают сырой продукт в виде желтоватых кристаллов, которые затем очищают хромотографией на колонне на 500 г нейтральной окиси алюминия (Йоелм N, супер I), используя эфир в качестве элюента (10 мл фракций).

Фракции 14-36 объединяют и упаривают в вакууме.

Получают метиловый эфир l ol-0-бензил- 4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов с Тп

121-123 (диэтилэфир:нефтяной эфир =

1:2).

Г -3 = +147,9 + 0,1 С (С =

0,849; хлороформ) — 32,2 г (86,2 от теории).

Rf = 0,67 (хлороформ:метанол =

= 9:1).

Пример 5. Аналогично примеру 4 получают иэ 5,5?5 г (6,43 ммоль) сырого (содержит еще незначительное количество дициклогексилмочевины) (Cd)-трет-бутилэфир-(СУ)-N-окси-сукцинимидэфира N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-.

-глютаминовой кислоты и 3,78 г (4,95 ммоль) L-алании-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида натриевую соль N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютамил-(Сd)-трет.-бутилэфир-(С ф—

-L алании-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида в виде бесцветного порошка, содержащего 2,64 моль воды.

5oL3 = +2,5 + 0,1ОС (С = 0,649; .вода); д.1 = +5,8 + 0,1 С (С = 0,694; хлороформ);

18

Rf = 0,60 (хлороформ .метанол. вода = 70:30:5), в количестве 4,32 r (64,0% от теории).

Ис;."одный продукт получают следующим образом.

Аналогично примеру 3 из 3,44 r (6,15 ммоль) -трет.-бутилэфира

N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глитаминовой кислоты, 1,68 r

l0 (8,14 ммоль) дициклогексилкарбодимида и 0,94 r (8,14 ммоль) N-оксисукцинимида получают сырой (Со )-трет.—

-бутилэфир-(Сg)-N-оксисукцинимидэфир

N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил l5 -D-глютаминовой кислоты в количестве

5,38 r в виде бесцветных кристаллов, содержащих дициклогексилмочевину, и используемых без дальнейшей очистки.

Rf = 0,61 (хлороформ:метанол. во20 да = 70:30:5).

Исходный продукт получают следующим образом.

Раствор 5,1 r (7 ммоль) (Cd)-трет.

-бутилэфир-(С )-бензилэфира ld -0-бензил-М-пропионил-деэметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты в

100 мл смеси диметоксиэтан:вода =

9:1 гидрируют с 1,5 г 5 .-ного катализатора палладий на угле (Е 101N, 30 Дегуеса) в течение 20 ч при комнатной температуре и нормальном давлении Через 20 ч катализатор отфильтровывают и снова производят гидрирование с 1,5 г свежего катализатора в

35 течение 26 ч как указано. Затем катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме до сухого состояния при 30 С.

Полученный таким образом остаток

40 растворяют в смеси, состоящей из

-100 мл метиленхлорида и 5 мл изопропанола, раствор смешивают с 500 мл смеси из диэтилового и петролейного эфира = 3:2 и перемешивают еще l ч

45 при комнатной температуре. Затем отсасывают выпавший в осадок продукт и промывают его диэтиловым эфиром.

Получают Ы -трет-бутилэфир N-пропионилдезметилмурамил-1-алканил-D50 -глютаминовой кислоты в виде бесцвет; ного порошка, содержащего 0,52 моль воды (3 7 г, 94,7,от теории). (К) = +20,2 + 0,1 С (С = 0,902; вода);

Rf = 0,32 (хлороформ:метанол:вода = 70 30 5);

Rf = 0,54 (ацетонитрил:вода =

= 3:1).

12995

Получают исходный продукт следующим образом.

Аналогично примеру 4 получают из

7,3 г (9,5 ммоль) (Сй)-трет.-бутилэфир-(С g)-бензилэфир-1 oL -О-бензил-4,6-0-изопропилиден-пропионил-дезметилмурамил-1-аланил-D-глютаминовой кислоты и 150 мл 60Х-ной уксусной кислоты (Со()-трет.-бутилэфир-(С1 )-бензилэфир 1 Ы -О-бензил-N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов с Т 152-153 С (метанол: о

:вода = 1:5).

Го 3 = +68,9 + 0,1 С (С = 0,991; метанол);

Rf = 0,40 (хлороформ:метанол =

= 9:1);

Rf = 0,70 (ацетонитрил:вода = — 3:1), количество кислоты 5,9 г 20 (85,3% от теории).

Исходный продукт получают следующим образом.

Аналогично примеру 4 из 4,65 г (9,62 ммоль, 2,066 ммоль/г, содержит еще хлорид натрия) натриевой соли

1д