Способ получения сухой яичной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза

Способ получения сухой яичной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Цель изобретения - повышение ростовых свойств среды. Для этого приготавливают нативный сырьевой продукт для лиофилизации: среда Левенштейна - Иенсена, среда Финна П, среда Гельберга. Среды гомогенизируют. Каждую среду в асептических условиях фильтруют через несколько слоев марли и разливают по 200 мл во флаконы емкостью 500 мл. Далее их замораживают в ванне с охлажденным спиртом при t=( -40) - (- 50)^oС 30 - 40 мин. Сушку питательных сред из замороженного состояния проводят в сублимационных аппаратах при 40^oС в течение 16 - 18 ч, создав вакуум 0,026 - 0,013 кПа - в начале сушки и не выше 0,003 кПа в конце сушки. В результате высушивания получают мелкопористое вещество. Остаточная влажность высушенных сред не выше 1%. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии. Целью изобретения является повышение ростовых свойств среды. П р и м е р. I этап. Приготовление нативного сырьевого продукта для лиофилизации. Приготовление среды Левенштейна-Иенсена. Среду получают путем смешивания водного раствора солей, г/л: Калия фосфат одно- замещенный 1,54 Магния сульфат 0,15 Натрия цитрат 0,38 L-Аспарагин 7,7 Глицерин 7,5 Яичная масса 650 мл Малахитовый зеленый 0,28 Приготовление среды Финна II. Среду готовят путем смешивания солевого раствора, г/л: Магния сульфат 0,5 Натрия цитрат 1,0 Квасцы железоам- миачные 0,05 Калия фосфат одно- замещенный 20,0 Аммония цитрат одно- замещенный 5,0 Натрия глутаминат однозамещенный 10,0 Глицерин 20,0 Яичная масса 606 мл Малахитовый зеленый 0,2 Приготовление среды Гельберга. Среду готовят путем соединения 100 мл солевого раствора, г: Калий двуосновный фосфорнокислый 1,0 Натрий лимонно- кислый 1,0 Магнезия сернокислая 1,0 Пептон 6,0 Глицерин, мл 30 Вода дистиллиро- ванная, мл 1000 Молоко, мл 100 Картофельный отвал, мл 100 Цельные яйца, шт. 6 Желтки, шт. 4 2%-ный водный раствор малахито- вого зеленого 7,5 мл. Независимо от способа изготовления среды хорошо перемешивают до получения гомогенной массы. Каждую среду отдельно в асептических условиях фильтруют через несколько слоев марли и разливают по 200 мл в стандартные флаконы емкостью 500 мл. II этап. Замораживание. Замораживание проводят на морозильном устройстве типа 33 150/50С. Питательные среды, разлитые во флаконы, замораживают на стенках флакона в ванне с охлажденным спиртом в течение 30-40 мин при минус 40 минус 50^оС. III этап. Высушивание. Сушку питательных сред из замороженного состояния проводят в сублимационных аппаратах КС-30 или ЛЗ-45 при строгом соблюдении правил асептики в условиях вакуума с подогревом. Высушивание ведут при режиме, приведенном в табл. 1. По окончании сушки флаконы с питательной средой закрывают стерильными пробками и герметизируют металлическими колпачками или покрывают пастой Унна. В результате высушивания получается мелкопористое вещество равномерной светло-зеленой окраски. Остаточная влажность высушенных сред не превышает 1% В каждом флаконе содержится 36 г 0,5 г сухой массы среды, достаточной для изготовления 40 бактериологических пробирок восстановленной среды. Для восстановления приготовленной сухой среды с горлышка флакона снимают колпачок и во флакон вливают стерильную дистиллированную воду до метки 100 на стенке флакона, взбалтывают, полностью смывают сухую массу со стенок флакона. Ставят флакон в термостат и периодически перемешивают среду до образования равномерной суспензии. Хорошо высушенная среда полностью размачивается в течение 2-3 ч. После растворения среду разливают в пробирки и уплотняют традиционным для яичных сред методом, рН приготовленных сухих питательных сред Левенштейна-Иенсена 6,80,1, Финна II 6,30,1, Гельберга 7,00,1. Исследованию подвергнуты 100 образцов мокроты, из которых 25 не содержат микобактерий и 75 содержит микобактерии туберкулеза в различной степени. Оценка степени обсеменения мокроты проводится при микроскопии мазков по трехбальной системе: + единичные микобактерии в препарате; ++ скопление микобактерий в редких полях зрения, +++ скопление микобактерий в частных полях зрения. Исследуют утреннюю порцию мокроты, которую обрабатывают 10%-ной Na₃PO₄. Осадок в количестве 0,1 мл засевают на две пробирки каждой из сред. Просмотр посевов проводятся ежедневно, в случаях отсутствия роста к 10 неделям посевы удаляют. Для оценки качества среды используют следующие критерии процент выделения культур, интенсивность роста, скорость появления роста. Результаты исследования среды Левенштейна-Иенсена представлены в табл. 2. При исследовании всех образцов мокроты показатели высеваемости и интенсивности роста микобактерий получаются лучше на сухой среде Левенштейна-Иенсена по сравнению с аналогичными показателями на нативной среде. Но особенно показательны эти различия при исследовании бактериоскопически отрицательного материала и материала, содержащего единичные бактерии в препарате. Количество положительных посевов на сухой среде заметно выше, чем на нативной. По скорости роста сухая среда Левенштейна-Иенсена значительно превосходит нативную среду, на которой рост колоний при посеве мокроты с различным содержанием микобактерий отмечается на неделю позже и в меньшем проценте случаев. В основном рост колоний на сухой восстановленной среде Левенштейна-Иенсена появляется на 3-5-й неделе, а на нативной также и через 6-10 недель. Лиофилизированная среда Финна II также обнаруживает лучшие результаты по сравнению с исходной нативной средой. Результаты исследования 100 образцов мокроты на лиофилизованной и нативной средах Финна II представлены в табл. 3. Наибольшая высеваемость микобактерий туберкулеза имеет место на всех трех сериях сухой среды Финна II, а нативная среда Финна II по этому показателю уступает сухой. Это особенно выявляется при исследовании бактериоскопически отрицательных образцов мокроты и мокроты, содержащей единичные микобактерии. В этих исследованиях все испытанные серии сухой среды Финна II дают весьма близкие результаты по высеваемости микобактерий. Максимальное количество (92-96%) культур микобактерий туберкулеза дает рост на лиофилизированных средах на 6-й неделе после посева. Лиофилизованная яичная среда Гельберга по высеваемости микобактерий, интенсивности и скорости роста не отличается от нативной. Срок годности среды Левенштейна-Иенсена составляет 2 года после изготовления, сред Финна II и Гельберта 1 год с сохранением высоких ростовых свойств яичных питательных сред, что подтверждается исследованием 8188 посевов патологического материала, 155 посевов органов животных, 266 посевов лабораторных музейных культур.

Формула изобретения

Способ получения сухой яичной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза путем смешивания ингредиентов среды с последующим замораживанием и лиофильным высушиванием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения ростовых свойств среды, замораживание осуществляют в охлажденном до минус 40 минус 50^oС спирте в течение 30 40 мин, а лиофильное высушивание проводят при температуре, не превышающей 40^oС, в течение 16 18 ч в вакууме, при этом создают вакуум 0,026 0,013 кПа в начале сушки и не выше 0,003 кПа в конце сушки.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2