Способ количественного определения фосфолипидов

Способ количественного определения фосфолипидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения фосфолипидов в липидных экстрактах, полученных из различных видов тканей, клеток, субклеточных фракций и биологических жидкостей. Цель изобретения - повьппение чувствительности и селективности анализа . Последний ведут обработкой пробы в растворителе - СНС1. с помощью красителя - раствора основного синего К в глицерине и/или этиленгликоле. Целесообразно после обработки красителем в полученную смесь добавлять этиленгликоль. Затем отделяют экстракт и измеряют его оптическую плотность . Время определения одного образца 5 мин, время измерения 5-ти образцов 8 мин. Способ обеспечивает в 2,5 раза лучшую чувствительность при высокой селективности анализа, чем в известном случае. 1 з.п. ф-лы, 6 табл. (Л со со со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СО(4ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1

„,SU, 1343 1 (51)4 G 01 N 21 78

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А STOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАм изОБРетений и ОтнРытий (21) 4046571/31-04 (22) 31.03,86 (46) 07. 10.87. Бюл. Р 37 (71) Институт биохимии им. А. Н. Баха (72) В,А.Еремин, С,П.Позняков и С,А,Авдюшко (53) 543.42.062 (088.8) (56) Кейтс М. Техника липидологии.

М.: Мир, 1975, с.78-79, с.310-311.

Stewart I,С.М. Analytical Вiochemis try. 104 1980 р. 10-14 ° (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ (57) Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения фосфолипидов в липидных экстрактах, полученных из различных видов тканей, клеток, субклеточных фракций и биологических жидкостей. Цель изобретения — повышение чувствительности и селективности анализа, Последний ведут обработкой пробы в растворителе — СНС1 с помощью

3 красителя — раствора основного синего

К в глицерине и/или этиленгликоле °

Целесообразно после обработки красителем в полученную смесь добавлять этиленгликоль. Затем отделяют экстракт и измеряют его оптическую плотность. Время определения одного образца 5 мин, время измерения 5-ти образцов 8 мин, Способ обеспечивает в 2,5 раза лучшую чувствительность при высокой селективности анализа, чем в известном случае. 1 з,п. лы, 6 табл.

1 13433

Изобретение отно.ится к области аналитической химии, а именно к способам колориметрического определения количества фосфолипидов в липидных

5 экстрактах, полученных иэ различных . видов тканей, клеток, субклеточных фракций и биологи-tIcaIm жидкостей.

Целью изобретения является повышение селективности и чувствительности анализа °

Пример !. В пять стандартных пробирок вносят по 6 мкл раствора фосфатидилэтаноламина (ФЭА) в хлороформе (16,7 мкг/мкл), по 3 мл хлороформа и по 0,5 мл раствора красителя основного синего K в глицерине (4мг/

/60 мл). В контрольные пробирки фосфолипид не вносят, Смесь тщательно встряхивают несколько раз, добавляют по 1 мл этиленгликоля в каждую пробирку и опять перемешивают встряхиванием. Через 3 мин (после расслоения фаз) отбирают гастеровской пипеткой по 2,5 мл окрашенной хлороформной фа- 25 зы и измеряют ее оптическую плотность (01I) при 590 нм на цифровом спектрофатометре в 1-сантиметровой кювете против контроля, Оптическую плотность хлороформной фазы в контрольных про- з<> бир ах измеряют против хлороформа, Результаты измерений: ОП контролей

0,138 и 0,147 ед, ОП, Результаты определения оптических плотчостей в присутствии красителя

35 в 100/-ном глицерине приведены в табл,1, Время определения одного образца

5 мин, время измерения пяти образцов — S мин, Основной недос1аток определения — высокая вязкость глицеринового раствора красителя, что затрудняет его дозировку при введении.

Пример 2. Способ осуществляется как в примере 1, но краситель растворяют в 1007-ном этиленгликоле (4 мг/60 мл),.Оптическую плотность контрольных и опытных образцов измеряют против хлороформа, Результаты измерений приведены в табл. 2

Бремя определения одного образна

20-25 мин, время измерения пяти об разцов — 30 мин. Чувствительность метода, как в примере 1.

Медленное отделение избытка красителя из хлороформной фазы, диффузная граница раздела фаэ, снижение точности измерений, увеличение разброса. результатов измерения, высокий конт19 роль сужает диапазон определяемых количеств фосфолипидов.

Пример 3, Без проведения отмывки избытка красителя этиленгликолем перед колориметрией образцов.

Способ осуществляют согласно примеру 1, но краситель растворяют в смеси глицерин/этиленгликоль 1: 1 об/

/об (4 мг/60 мл), Оптическую плотность образцов измеряют против хлороформа. Результаты измерений приведены в табл.3.

Время определения одного образца

15 мин, время измерения пяти образцов — 18 мин, Чувствительность метода, как в примере 1 °

Интенсивная окраска контроля, нечеткое разделение фаз и избыток красителя в хлороформной фазе существенно снижают воспроиэводимость измерений.

Пример 4. Подбор оптимального минимального объема этиленгликоля для отмывки избытка красителя перед колориметрией образцов.

Способ осуществляют согласно примеру 3. Перед колориметрией хлороформную фазу промывают 0,2-5 0 мп этиленгликоля, При этом пропорционально увеличению добавляемого объема этиленгликоля происходит уменьшение объема хлороформа и повьппение скорости перехода избытка краски из хлороформной фазы. Результаты измерений приведены в табл,4.

Таким образом, оптимальный минимальный объем этиленгликоля составляет 1,0 мл, а измерения можно проводить в интервале объемов этиленгликоля 0,2-3,0 мп, т.е ° при объемном соотношении этиленгликоль:хлороформный раствор фосфолипида (0,2-3,0):

:3,0 °

Пример 5. Избирательное количественное определение фосфолипидов в бинарных смесях на примере смеси

ФЭА с фосфатидилхолином (ФХ).

Смесь фосфолипидов: 6 мкл ФЭА (16,7 мкг/мкл) и 6 мкл ФХ (16,7 мкг/

/мкл) вносят в три пробирки, В три пробирки вносят ФЭА беэ ФХ и две пробирки без фосфолипидов служат контролем. Определение количеств фосфолипидов проводят, как в примере 3, с отмывкой красителя 1,0 мл этиленгликоля (отношение этиленгликоль:хлороформ

t:3 по объему). Результаты измерений приведены в табл,5, 19

ОП Коэффициент вариации, 7

Образ ец ОП

0,623

0,610

0,632 0,621

0,620

0,625

3,54

Т а б л и ц а 2

ОП

Контроль 1 О, 6 70

1,320 0,625

1,282 0,587

ТаблицаЗ

ОП с ср

Коэффициент

ОП

Образец

ОП вариаХ

Контроль 1 О, 426

Контроль 2 0,472

0,450

Л 13433

Таким образом, предлагаемый метод не позволяет опредечять ФХ, что мо-жет быть использовано для прямого (без тонкослойной хроматографии) on5 рецеления количеств других фосфолипидов, входящих в состав бинарных смесей с ФХ °

Пример 6, Определение ФЭА в присутствии метанола ° 10

В десять опытных пробирок вносят по 6 мкл раствора ФЭА в хлороформе (16,7 мкг/мл) и в каждую пару пробирок добавляют различные количества метанола (О, 20, 50, 100 и 150 мкл).

В десять контрольных пробирок (без добавления фосфолипидов) добавляют попарно по О, 20, 50, 100 и 150 мкл метанола, Затем по все пробирки добавляют по 3 мл хлороформа, смесь встряхивают, добавляют во все пробирки по

0 5 мп красителя — основного синего

К (4 мг/60 мл) из раствора этиленгликоль — глицерин (l 1) и после тща- 5 тельного перемешивания в каждую пробирку добавляют по 1 мп этиленгликоля.

Смесь в пробирках тщательно перемешивают и после расслоения фаз отби рают нижнюю (хлороформную фазу) пастеровской пипеткой. Далее измеряют

ОП образцов на спектрофотометре при

590 нм против чистого хлороформа или воды в 1-сантиметровых кюветах, Результаты измерений представлены в табл,6, Поскольку основной средой для определения фосфолипидов является хлороформ, то добавление в среду определения аликвот метанола полностью

40 соответствует тому, как если бы фосфоЛипиды добавлялись из смеси хлороформа и метанола.

Предлагаемый способ количественного определения фосфолипидов по сравнению с известным обеспечивает повы45 шение чувствительности в 2, 5 раза и повышение селективности определения „

Формула изобретения

1. Способ количественного определения фосфолипидов путем обработки раствора анализируемой пробы в хлороформе красителем с последующим отделением экстракта и измерением его 55 оптической плотности, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения селективности определения и его чувствительности, в качестве красителя используют раствор основного синего К в глицерине, или этиленгликоле, или в смеси глицерина с этиленгликолем.

2, Способ по п ° 1, о т л и ч а ю шийся тем, что после обработки пробы красителем в полученную смесь добавляют этиленгликоль.

Та блица 1

Контроль 2 О, 720 0,695

1 1,295 0,600

1 330 0 635

1,302 0,607 0,611 7,9

1,0?3 0,623

0,968 0,518

0,925 0,475 0,619 57,2

1,100 0,650

1, 279 0,829

1343319

Время расслоеОстаточный объем хлороформной фазы после расслоения фаз, мл

Добавлено этиленОбразец

ОП гликоля, мл ния фаз, мин

15 0,453

15 1,088

12 0,426

12 1,027

5 0,300

5 0,950

3 0,170

3 0,795

3,0

1 Контроль

0,635

3,0

Опыт

2,8

0,2

Контроль

0,601

2,8

0,2

Опыт

2,6

0,5

Контроль

0,650

0,5

2,6

Опыт

2,4

1,0

Контроль

0,625

2,4

1,0

Опыт

2,5

2,0

2,0

Контроль

2,5

2,0

2,0

Опыт

2,0

3,0

1,5

Контроль

2,0

3,0

1,5

Опыт

1,5

0,5

5,0

Контроль

0 5

5,0

1,5

Опыт

Коэффициент вариации, 7.

ОП

ОП Образец

ОП ср

О, 150

Нет

Контроль 1

Контроль 2

0,633

0,627 0,625 2,88

ФЭА

0,615

0,602

0,615 0,619

ФЭА + ФХ

6,1

0 790 О 640

Фосфолипиды

О, 154

0,147

0,783

О, 777

0,765

0,752

0,765

Таблица4

Объем остающейся хлороформной фазы ниже требующегося для измерений в обычных кюветах

Таблица5

1343319

Таблицаб

ОП (590 нм) Объем добавленноОбразец

Количество меганола, об.Х

>ОП (опытконтроль) Коэффициент

ОП

Опыт Контроль

ro метаиола, мкл вариации, Х

2, 4 О, 785 О, 158 О, 627

2э4 Оэ 765 Оэ 150 Ов 615

0,621

2,4 0,773 0 148 0 625

0,626

2,4 0,780 0 153 0,627

0,67

0,67

2,6

2,3 0,762 0,146 0,616

0,610

2, 3 О, 750 О, 146 0,604

1,6

50

1,6

2,2 О, 770 0,160 0,610

2,2 О, 780 О, 150 0,630

3,3

0,620

3,3

5 0

2,0

5,0

2,0

Составитель С, Хованская

Редактор Н.Егорова Техред JI.Сердщкова Корректор А.Обручар

Заказ 4817/45 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 3-35 Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 100

8 100

9 150

10 150

Объем оставшейся хлороформной фазы, Объем оставшейся хлороформной фазы не позволяет надежно проводить измерения ОП в обычных кюветах, так как он ниже нижнего предела