Способ спектрального определения активности пептидаз

Способ спектрального определения активности пептидаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к анализу пептидаз по флюоресценции продуктов реакции. Цель изобретения - повышение точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов. В качестве субстратов предложено использовать 1-аминоациламинонафталин-5-сульфокислоты. Продукт ферментативной реакции - 1-аминонафталин-5-сульфокислоту определяют по флюоресценции /98л<SB POS="POST">в</SB>озб 360 нм,98л*<SB POS="POST">ф</SB>л 505 нм/ непосредственно в реакционной смеси. Флюоресценция субстрата /λ<SB POS="POST">в</SB>озб 340 нм,λ<SB POS="POST">ф</SB>л 420 нм/ не мешает определению. 1 з.п.ф-лы,1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1470766 А1 у11 4 C 12 0.1/00, G 01 N 33/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ субстратов-1-(аминоацил)-аминонафталин-5-сульфокислот.

Для проведения анализа согласно способу. целесообразно использовать для возбуждения флюоресценции источник длиной волны 360 нм, а продукт реакции — 1-нафтиламин-5-сульфокислоту — определять при . 505 нм„ при этом флюоресценция субстрата (, -340 нм, 9, 420 нм) полностью исключается. К реакционной смеси, содержащей субстрат, буферные добавки, вещества, необходимые для нормальной работы фермента (например, комплексоны, ионы магния и пр.), добавляют известное количество определяемого фермента, смесь инкубируют при постоянной температуре, наблюдая за увеличением флюоресценции при

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ .И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4106664/31-13 (22) 05. 06. 86 (46) 07.04.89. Бюл. N - 13 (71) Институт молекулярной генетики

АН СССР (72) А.А.Недоспасов и В.Н.Незавибатько (53) 655.4 (088.8) (56) Hemker Н,С. Handbook of Synthetic Substrabes for the Coagulation

and Fibrinolytic System. — М. Nijhoff Publ ° 1983 °

Авторское свидетельство СССР

М- 1359283, кл. С 12 N 9/50, С 07 С 143/60, 14.06.86.

Изобретение относится к биохимии, конкретнее к способам определения ферментов, гидролизующих амидные связи, и может быть использовано в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой, гидролизной, фото- и микробиологической промышленности для анализа пептидаз.

Целью изобретения является повышение точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов.

На чертеже приведен график определения чувствительности пептидаз.

Целесообразно использовать метод флюоресценции для количественной регистрации продукта ферментативной реакции — 1-нафтиламин-5-сульфокислоты, образующейся при гидролизе (54) СПОСОБ СПЕКТРАЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДАЗ (57) Изобретение относится к анализу пептидаз по флюоресценции продуктов реакции. Цель изобретения — повышение точности и чувствительности определения пептндазной активности ферментов. В качестве субстратов предложено использовать 1-аминоациламинонафталин-5-сульфокислоты. Продукт ферментативной реакции — 1-аминонафталин-5-сульфокислоту определяют по флюоресценции (> 360 нм, 505 нм) непосредственно в реакционной смеси. Флюоресценция субстрата (9 340 нм, % „ 420 нм) не Я мешает определению. 1 з.п. ф-лы, 1 ил, 1 табл.

1470766

Опыт Фермент

Буферный раствор

Время инкубации, позволяюВремя инкубации по прототипу, с

Субстрат щее выявить фермент визуально, с

Проназа Ю- е" - н 0,05 тРис-НС1ь 25 600

О О рН 7,6 оун

Как в примере 1 25 600

2 Трипсин Тозил

-g1y-Pro-Arg-NH

3 Папаин Как в примере 1

0,05М трис-НС1, рН 8,0, 0,001М, ЭДТА, 0,001 М дитиотреит

Как в примере 1

0,066 трис-НС1, 0,05 М СаС1, 0,05 И NaC1 25 600 35

37 1800 120

4 Тромбин

5 Комплекс А фпротеаз О О сыворотки о,н

60 крови

6 Комплекс Pro-Рпепротеаз Аг NH

То же

so> н

505 нм. По интенсивности роста флюоресценции судят о количестве фер/ мента. Можно также проводить измере ния "по конечной точке", определяя флюоресценцию однократно по истечении определенного промежутка времени.

Пример 1. Определение активности трипсина по флюоресценции 1-нафтиламин-5-сульфокислоты. 10

2 мл реакционной смеси, содержащей 5 10 M 1-(N-карбобензоксиаргиHHJI)-аминонафталин-5-сульфокислоты в 0,05 M трис-НС1 буфере, рН 8,2, помещают в кювету спектрофлюориметра, 15 добавляют 10 мкл исследуемого фермента и проводят измерение флюорес ценции при 505 нм, -> 360 нм, по отношению прироста интенсивности фпюоресценции к временному интервалу 20 судят о количестве фермента, используя в качестве эталона стандартную кривую, снятую в тех же условиях при известных концентрациях стандартного раствора трипсина.

Пример 2. Определение активного тромбина по флюоресценции

1-аминонафталин-5-сульфокислоты. 2мл

2 ° 10 М раствора тозилглицил-1-пролил-1-аргинил-аминонафталин-5-сульфокислоты в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 8,2 помещают в кювету спектрофлюориметра, добавляют 10 мкл исследуемого образца тромбина, перемешивают и регистрируют рост интенсивности флюоресценции при 505 нм (Э о .

360 нм) во времени. Активность фермента определяют по тангенсу наклона касательной и кривой зависимости интенсивности флюоресценции от времени.

Аналогичным образом может быть проведен анализ других пептидаэ, приведенных в таблице.

0,8

500 в00

300

Составитель И.Привалова

Техред .Л. Сердюкова

Редактор Н.Рогулич

Корректор С.Черни

Заказ 1551/29 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óàãîðîä, ул. Гагарина,101 е 14707

Как видно из чертежа, максимумы чувствительности определения приходятся на длину волны эмиссии 505 нм, при возбуждении 360 нм отклонение от .

5 максимумов понижает чувствительность определения.

Формула изобретения

1. Способ спектрального определения активности пептидаз, предусматривающий измерение скорости ферментативного гидролиза аминоацильных производных 1-аминонафталин-5-сульI

66 е фокислоты с количественной регистрацией изменения спектральных характеристик реакционной смеси, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повьппения точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов, количественную регистрацию проводят путем измерения интенсивности флюоресценции.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что интенсивность флюоресценции измеряют на длине волны 505 нм при использовании источника возбуждения с Э 360 нм.