Способ определения формы холерных вибрионов
Иллюстрации
Показать всеРеферат
Изобретение относится к микробиологин. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа. В бактериальную взвесь добавляют тритон Х-100, глиоксилат, ацетил-коэнэим А, перемешивают и после инкубирования вводят основной фенилгндраянн. После кипячения и охлаждения н смесь добавляют соляную кислоту и красную кровяную соль. Но интенсивности окраски можно определить формы холерных вибрионов в течение 30 мин. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
OC APOTE1EHH é HOMHTET
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГННт Оса (46) 23. 09. 90. Бюл. Р 35 (21) 4187785/28-14 (22) 18, 11. 86 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) Л.А.Голубкова, Л.Е.Асеева, Ю.И.Ломов, И.М.Фоменко и Б.Д.Рублев (53) 612.015(088.8) (56) Механизмы и диапазон изменчивости холерных вибрионов, Ростов-на-До" ну, 1981 с. 166-167.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к методам диагностики холеры.
Целью изобретения является ускорение и упрощение способа.
Цель достигается тем, что дифференциацию измененных форм холерных вибрионов проводят по определению активности фермента малат-синтазы (К.Ф.
4.1 ° 3.2).
Способ осуществляют следующим образом.
Иэ. колоний клеток отбирают 2 петли материала (что соответствует 5 млрд. микробных клеток) и готовят взвесь в .0,2 мл буферного раствора (трис-НС1, рН 7,4), добавляют последовательно растворы компонентов с таким расчетом, чтобы в конечном объеме 1 мл содержалось: 5 млрд. микробных клеток, 0,05-0,3 мкмоль глиоксилата, 0,2
0,3 мкмоль ацетил-КоА, после 15-30Р минутного икубирования при 37 С—
5-15 мкмоль основного фенилгидраэина, после доведения до кипения на водя„„Я0„„1475336 А 1 (51) 5 G 01 N 33/48 C 12 1 00 (54) С!!ОСОБ ОПРЕДЕ1!ЕНИЯ ФОР!1Ы ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ (57) Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения — ускорение и упрощение способа. В бактериалъную взвесь добавляют тритон X-100, глиоксилат, ацетил-коэнэим А, перемешивают и после инкубирования вводят основной фенилгидразин. После кипячения и охлаждения в смесь добавляют соляную кислоту и красную кровяную соль. По интенсивности окраски можно определить формы холерных вибрионов в течение 30 мин. 1 табл.
2 ной бане и охлаждения до комнатной температуры — 0,25 — 1,0 ммоль соляной кислоты и 4-16 мкмоль красной кровяной соли К >(Fe(CN) ). Учет результатов (см. таблицу) проводят через 1-2 мин по интенсивности окраски.
П р.и м е р 1. Иэ подозрительных колоний отбирают 2 петли материала (соответствует 5 млрд, микробных кле- р ток и в 0,2-0, 4 мл буферного раствора (например: 0,2 М трис-НС1, рН 7,4) приготавливают бактериальную взвесь.
Рабочие растворы приливаемых ингредиентов готовят с таким расчетом, .чтобы в конечном объеме 1 мл содержались следующие количества компонентов, добавляемые в указанной последовательности: 5 млрд. микробных кле- а ток, 0,5 мг тритона Х-100, 0,05 мкмоль глиоксилата, 0,2 мкмоль ацетилVoA, после тщательного перемешивания и 15-минутного инкубирования при 37 С (минимальное время, необходимое для конденсации ацетил-КсА с глиоксилатом) — 5 мкмоль основного фенилгидра1475336 зина, после доведения до кипения на водяной бане и охлаждения до комнат- ной температуры - 0,25 ммоль соляной кислоты и 4 мкмоль красной кро-: вяной соли Kg(Pe(CN}e j. 11ри использоC 5 ванг и данных концентраций предлагае" мой смеси через 1-2 мин у гладких
S-форм холерных вибрионов окраска отсутствовала, К-формы окрашивались в. бледно-розовый цвет, а у Л-форм наблюдалось красное окрашивание, свидетельствующее об образовании фенилгицраэона:глиоксиловой кислоты.
Пример 2. Иэ подозрительных колоний отбирают 2 петли материала (соответствует 5 млрд. микробных клеток) и в 0,2 " 0,4 мл буферного растнора (например, 0,15 М ХЕПЕС; рН 7,4) приготавливают бактериальную взвесь.
Рабочие растворы приливаемых ингре" диентов готовят с расчетом, чтобы в, конечном объеме 1 мл содержались следующие количества компонентов, добавляемые в указанной последова-". тельности: 5 млрд. микробных клеток,.
1,0 мг тритона Х"100, 0,2 мкмоль глиоксилата, 0,25 мкмоль ацетил-. КоА, после перемешивания н 30-минутного с инкубирования при 37 С (максимальное время, необходимое для конденсации ацетил-КоА с глиоксилатом) - 10 мк моль основного фенилгидраэина, после кипячения на водяной бане и охлажде ння до комнатной температуры—
0,5 ммоль соляной кислоты и 8 мкмоль красной кровяной соли. Учет резуль" татов проводят через 1-2 мин. У гладких S-форм окраска не развивается, что говорит о наличии у них фермента малатсинтазы. Проба с Л-трансформиро40 ванными клетками мгновенно окрашивается в красный цвет, а проба с К-формами — в розовый цвет,, что свидетельствует о6 отсутствии фермента малатсинтазы у Л-форм и ггизкой его актив45 ности у R-форм холерных вибрионов.
П р и и е р 3. Из подозрительных колоний отбирают 2 петли материала (соответствует 5 млрд. микробных клеток) и в 0,2"0,4 мл буферного раствора (например, О, 1 М МОПС; рН 7,4) приготавливают бактериальную взвесь.
Рабочие растворы приливаемых ингредиентов выбирают с расчетом, чтобы в конечном объеме 1 мл содержались сле" дующие количества компонен1ов, добавляемые в указанной последовательности: 5 млрд. микробных клеток, 1,5 мг тритона Х-100, 0,3 мкмоль глиоксилата, 0,3 мкмоль ацетил-КоА, после перемешивания и 15-минутного инкубирования прн 37 С вЂ” 15 мкмоль основного фенилгидразина, после кипячения на водяной бане и охлаждения до комнатной температуры — 1,0 ммоль соляной кислоты и 16 мкмоль красной кровяной соли, 1
При учете результатов через 12 мин у гладких S-форм окраска не появляется, в связи с тем, что образуется малат, который не дает цветного комплекса с фенилгидразнном н
KqlFe(CN) ). У К-форм мгновенно появляется малиновая окраска, а .у Л-форм холерных вибрионов окрашиваются в ярко-красный цвет, что свидетельствует об образовании фепилгидраэона глиоKcHJIoBoй кислоты °
Способ. позволяет в течение 30 мин (по сравнению с 3 сутками в прототипе) определять формы холерных вибрионов.
Ф о р и у ë а и з о б р е т е н и я !
Способ определения формы холернггх вибрионов путем приготовления взвеси клеток исследуемых вибрионов и обра" ботки ее реагентами с .последующей регистрацией результата прошедшей реакции, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, взвесь содержит 5 млрд. микробных клеток, а обработку проводят 0,5-1,5 мг тритона Х-100, 0,050,3 мкмоль глиоксилата, О,?"0,3 мкмоль. ацетил-коэнэима А rr течение 1530 мин, затем добавляют 5-15 мкмоль основного фенилгидраэина, смесь донодят до кипения, охлаждают, добавляют к ней 0,25-1 моль соляной кислоты и 4"16 мкмоль красной кровяной соли и прн сохранении исходной окраски смеси огределяют S-форму, ярко-красном окрашивании смеси Л-форму, розогor окрашиванин К-форму.
147533б и 5
Х! о iO C аф
1! о5
» IC аф х
lC
О ф
1 о ф Ik а ф
М й
1 о о ф
A и
О
» Ф а»
L
1 ф М о а» !
» 11!
»» ф». м
O В н ю» !»!
O Ю\
1»
Ю х х к
v а
3! о
1 1 о
egeg
Й»3,»
1 о
cpm
Л х аа
1 о
6l
0» Ф
1 1 о
4I I юъ М ! л2 да к о о фй Ф Ф оаэи ЮЖ
1 о v к В» аале сикх! 1 о v !! ф М
oахф
Т"
cs! о v к»к о.ае к х
1 1 о и ааф
1К К
1 о о о.а»
1х 3с х