Способ получения кислой фосфатазы

Способ получения кислой фосфатазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения кислых фосфатаз. Цель изобретения - повышение активности и выхода фермента. Изобретение заключается в том, что в качестве продуцента кислой фосфатазы используют полиплоидный штамм дрожжей с псевдомицелиальным типом роста +SACCHAROMYCES CEREVISIAE ВКПМ У-618. Активность секретируемой фосфатазы после 16 ч культивирования на среде, содержащей (г/л) глюкозу 20, пептон 20, КН<SB POS="POST">2</SB>РО<SB POS="POST">4</SB> 0,03, составляет 124,0±12,0 ед, фосфатазы, сорбированной на поверхности клеток, 700±35,0 ед. 1 ил. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д BTGPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4288343/31-13 (22) 22.07.87 (46) 23.07.89. Бюл. Р 27 (71) Ленинградский государственный университет и Ленинградский технологический институт им. Ленсовета (72) В.Н.Егорова, С.Г.Инге-Вечтомов, С.А.Кожин, В.А.Галынкин, В.В.Хадеева и В.И.Яковлев (53) 663.15 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОИ ФОСФАТАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может

Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к тем ее отраслям, где микробиологическим объектом технологического про-:. цесса являются дрожжи-сахаромицеты, и может быть использовано для получения кислых фосфатаз.

Цель изобретения — повьппение активности и выхода кислой фосфатазы.

Способ заключается в том, что в качестве продуцента кислой фосфатазьг, используют полиплоидный штамм с псевдомицелиальным типом роста Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-618.

Кислые фосфатазы (КФ) относятся к экзоферментам. Количество секретируемой КФ пропорционально площади по-.. верхности клетки. Полиплоидные штам.мы дрожжей с псевдомицелиальным типом фоста имеют крупные клетки с изменен ной морфологией, что может существенÄÄSUÄÄ 1495376 А1 (51) 4 С 12 N 9/16 (С 12 N 9/16, С 12 К 1:865) быть использдвано для получения кис= лых фосфатаз, Цель изобретения — повышение активности и выхода фермента, Изобретение заключается в том, что в качестве продуцента кислой фосфатазы используют полиплоидный штамм дрожжей с псевдомицелиальным типом роста Saccharomyces cerevisiae ВКПБ

У-618. Активность секретируемой фосфатазы после 16 ч культивирования на среде, содержащей (г/л) глюкозы

20, пептона 20, КН РО4 0,03, составляет 124,0 + 12,0 Ед, фосфатазы, сорбированной на поверхности клеток, 700 35, 0 Ед. 1 ил., 3 табл.

С:: но сказаться на площади клеточной поверхности. Кроме того, изменение мор- 2 фологии клеток затрагивает структуру клеточной оболочки, что также может влиять на секрецию экзоферментов, Со- 4 ° ,вокупность перечисленных характерис- Я 1 тик создает реальные предпосылки для (Д получения КФ из полиплоидных штаммов (, дрожжей-сахаромицетов с псевдомицели-, альным тиром роста. (3Ъ

Пример 1 ° Получение тетра плоида с псевдомицелиальным типом роста.

Для получения полиплоидного штам ма с псевдомицелиальным типом роста (Rpm) проводят серию скрещивания, юй

На чертеже представлена схема, реализующая способ.

Гаплоидные штаммы, использованные для получения тетраплоида 4-295, имеют следующий генотип:

3 149537

2Ь-П5003-МАТ Ы.leu 2-2 ura 3 rpm 3 rpm 6

4А-П5152-МАТ oL thr 4-В15 rpm 3

2Г-П5078-МАТ оСаде 1-6 rpm 3.

Все культуры депонированы во Все5 союзной коллекции промьппленных микроорганизмов ВНИИ генетика, где им присвоены следующие номера: 2Б-II5003

У-615, 4А-П5152 — У-616, 2Г-П5078—

У-6179 4-295 — У-618. 10

При выделении полиплоида с псевдомицелиальным типом роста используют метод, основанный на гомоэиготизации по локусу типа спаривания., Генетические данные, подтверждающие плоидность штамма BKIIN-618 представлены в табл.1.

В связи с тем, что выделенный тетраплоид Rpm не спорулирует, гомозиготу по полу ВКПМ У-618 скрещивают с 20 автодиплоидом 3-П219 генотипа МАТа/

/МАТа ade1/ade1 his7/his7 lys2/1ув2.

Анализируют полученный гексаплоид

6-5. Фертильность аскоспор 6-5 не превышает 507, поэтому анализируют 25 случайную выборку аскоспор. Полученные расщепления по ауксотрофным маркерам соответствуют теоретически ожидаемым при предполагаемом уровне плоидности ЗО

Пример 2. Оценка активности секретируемой кислой фосфатаэы (КФ) у штамма BKIIN У-618.

Для характеристики секретной ак- . тивности по КФ дрожжи выращивают в среде, содержащей в 1 л дистиллиро-. ванной Н О 20 r глюкозы; 20 r пелтона и 30 мг КН РО4. Выращивание проводят в течение 20-24 ч в колбах Эрленмейера (объем среды — 100 мл), на качалке .40 (235 об/мин). Определение биомассы дрожжей проводят нефелометрическим методом на ФЭК-N.

Для количественного определения активности КФ, экскретируемой дрожжа- 45 ми в,культуральную жидкость, используют калориметрический метод, основанный на способности КФ отщеплять от паранитрофенилфосфата (п-НФФ) фос-фор, в результате чего образуется паранитрофенол (п-НФ), имеющий максимум поглощения в области 410 нм. Ферментативную активность выражают в мкМ п-НФ, образующегося за,1 мин при

33 С, принимая Е, = 12500.

Удельную активйость КФ выражают в. мкМ и-НФ/мин/мг белка клеток дрожжей.

Расщепление гексаплоида 6-5 показано в табл.1.

Активность КФ у штамма У-618 пока-зана в табл.2.

В качестве контрольного используют штамм Saccharomyces cerevisiae D-б.

Статистическая обработка данных по критерию Стьюдента свидетельствует, что после 4 ч выращивания не выявляются достоверные отличия по количеству экскретируемой КФ между контрольным штаммом и У-618 (tdif = 3,87, = 4,30). Однако по мере роста выявляется достоверное превышение активности КФ штамма У-618 над контролем (tdif = 12,8; 4,8; 8,8; 8,9 . соответственно для измерений после

8,,12 16 и 20 ч роста).

Пример 3. Сравнение активности КФ у штаммов различной плоидности и морфологии.

Активность КФ оценивают после 16 ч роста культуры.

Результаты проведенных, опытов сум-. мированы в табл.3.

Данные табл.3,указывают на возрастание активности КФ как секретируемой, так и сорбированной на поверхности клетки в соответствии с плоид-ностью клетки. В то же время штаммы, образующие морщинистые колонии (МК)с псевдомицелиальными клетками, характеризуются более высоким уровнем секреции: активность секретируемой КФ у морщинистых штаммов превосходит вдвое таковую у гладких штаммов той же плоидности.

Физиолого-биохимическое описание штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ

У-618, Штамм является тетраплоидом, получен в результате серии последовательных скрещиваний.

На средах УАРД, полной с пептоном;

ПЕПФО и минимальной, штамм образует морщинистые колонии из псевдомицелиальных клеток. В жидких средах того же состава образует быстро осаждающиеся скопления клеток.

Состав сред, УАРД; пептон 20 r, глюкоза 20 r, дрожжевой автолизат, 10 мл, КН РО 0,9 r, NgSO< 0,5 r., (Nik<)< SO4 3,5 r, К НР04 0,23 r, агар

30 г; ПЕПФО; пептон 20 r глюкоза

20 г, КН РО 1 r, агар 25 г.

Минимальная: KH PO 0,9 r, К НРО

0,23 г, MgSOg0,5 r, (ИН4) БО 3,5 гр глюкоза 20 г, агар 30 r, тиамин

200.мкг, ф -аланин 500 мкг, биотин 2 мкт .

1495376

Таблица 1

Сравнение с теоретически ожидаемым

Полиплоид

Соотношение феноГенотип

Расщепление по типов

6-5 ZFU> len ; THR< thr4 ; ADE1 ade ; 1еп2

1 . HIS7; his7 ; ZYS2 lys2 ; URA3 ade1

ura 3.

151 24 3 54 О 05

171 4 3,25 )0,05

Таблица 2

Время ферментации, ч

Активность КФ

У-618

8

12

16

6,2+1,6

19,8 + 1,2

62,0 + 1,5

91,0 + 0,9

82,0 + 4,7

12,4 + 0,2

40,9 1 0,5

74,0 + 2,0

126,9 + 0,7

135,0 + 3,7

Активность КФ

Плоидность

Штамм

Морфо логия

Секретируемая КФ, сорбированная

КФ на поверхности клетки

MK 25,5 «1. 2,7

МК 40,0 + 4,5

ИК 124,0 + +12,0

230,0 + 24,0

380,0 + 29,0

700,0 + 35,0

У-616

П-5199

У-618 и

2п

4п

На среде с ацетатом натрия переходит к спорообразованию . Аски ромбические.

Отношение к углеводам. Усваивает глюкозу, галактоэу, сахарозу, мальтозу, рафинозу, фруктозу, не усваивает сорбоэу, лактозу, мелибиозу,,растворимый декстрин, арабинозу.

Отношение к спиртам. Усваивает этанол, глицерин.

Ф

Может использовать в качестве единственных источников .азота

@Н а4 804 ИН, ИОэ ИаИОз, мочевину, гидролизат панцирьсодержащего сырья (гидролиэат криля — отходы рыбной промышленности), гидролизат белкововитаминного концентрата, дрожжевой экстракт, пептон.

Оптимальная температура культиви0 рования 30 С. Активность зависит от температуры куя : тивирования, урс". ня аэрации и рН. Оптимальный режим при исходном значении рН 3,5-4,0, скорости растворения кислорода

И/ 02 о

16 — 76-- — и температуре 30 C. л/ч

Формула изобретения

Способ получения кислой фосфатазы, предусматривающей выращивание дрожжей рода Saccharomyces на питательной среде, содержащей источники

15 углерода. азота неорганический фосфат и воду, отличающийся тем, что,с целью увеличения активности и выхода фермента, в качестве продуцента используют полнплоидный штамм дрожжей а псевдомицелнальным типом роста Saccharomyces cerevisiae

ВКПИ У-618.

1495376

Продолжение табл.3

Активность КФ

Штамм

Илона ность

Секретируемая

КФ сорбированная поверхности етки !

12,5 + +1,5 230,0 + 24,.0

21 0 + 3 5 320 0 4- 32 0

56 ° 0 + 8 5 660)0 + 40 0

10Г-Д145

П-5200

4-293-24

ГК

ГК

ГК и

2п

4п

П р и м е ч а н и е. МК вЂ” морщинистые колонии, содержащие псевдомицелиальные клетки; ГК вЂ” гладкие колонии, содержащие дрожжевые клетки.

Определяют активность сорбированной

КФ после того, как клетки дважды отмывают от среды.

44-ЮХУХР

gl-П,ЩЩ

-1Ф

Составитель Е.Воробьева

Техред И„Цидык

Корректор О.Ципле

Редактор Н.Гунько

Заказ„ 4216/25 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, MocKBa„ Ж 35 Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.ужгород, ул. Гагарина, 10!

oCZe П5158 Х

3-171

Х е-д«к(жи «юм)