Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами

Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения степени поражения пищевых продуктов метаболитами грибов. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа определения степени поражения зерна микроскопическими грибами. Для этого предлагается после размалывания зерна проводить определение степени поражения зерна путем приготовления водных экстрактов зерна и добавления их в реакционную смесь, содержащую НАДН ФМН-оксидоредуктазу, люциферазу и их субстраты и измерения интенсивности свечения, а о степени поражения зерна судят по отношению интенсивности биолюминесценции экстракта зерна к интенсивности биолюминесценции реакционной смеси. 6 табл. 1 ил.

СОНИ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) 00 (1) С 0! N 33/10

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

HAQH:ФИН-оксилорелуктаза +

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

fN ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4272105/31-13 (22) 30.06.87 (46) 15.04.90. Бюл. !1- 14 (71) Институт биофизики СО АН СССР .и Всесоюзный научно-исследовательский институт зерна и продуктов ег!э переработки (72) В,А,Кратасюк, Н,Б,Плотникова, Л,С,Львова и Н,Ю. Орлова (53) 664.7(088.8) (56) Львова Л.С., Шатилова Т.И., Шальгина А,П, Прикладная биохимия и микробиология, И,, 1976, т ° 1 2 )) 3, с,442-448. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ IIOPA»

ЖЕНИЯ ЗЕРНА МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ (57) Изобретение относится к биохимии, Изобретение относится к исследованию материалов химическими способами и может быть использовано для определения степени загрязнения зерна метаболитами грибов, Целью изобретения является повышение точности определения и упрощение способа, На чертеже представлена зависиМость интенсивности свечения от времени реакции, 2 в частности к способам определения степени поражения пищевых продуктов метаболитами грибов ° Цель изобрете- . ния - повышение точности и упрощение способа определения степени поражения зерна микроскопическими грибами, Для этого предлагается после размалывания проводить определение степени поражения зерна путем приготовления водных экстрактов зерна и добавления их в реакционную смесь, содержащую

НАДН ФИН-оксидоредуктазу, люциферазу и их субстраты и измерения интенсивности свечения, а о степени поражения зерна судят по отношению интенсивности биолюминесценции экстракта зерна к интенсивности биолюминесценции реакционной смеси. 6 табл,, 1 ил.

Способ осуществляют следующим образом, Приготавливают водный экстракт зерна и добавляют его в реакционную смесь, содержащую НАДН:ФМН-оксидоре° дуктазу, люциферазу и их субстраты, наличие метоболитов в экстракте определяют по интенсивности свечения, Для анализа используют биферментную систему НАДИ:ФИН-оксидоредуктаза-люцифераэа, Эти ферменты катализируют цепь двух сопряженных реакций:

1557521 мой люцифераэой: люцифеоаза

ФИНН + RCOH + Π— — — — — + ФМН + RCOOH + Н О + свет и Z 1

Полученный в этой реакции ФИНН используется в реакции, катализируегде ФМН ФМНН - окисленная и восстаВ новленная формы флавинмононуклеотида;

НАД,НАДН вЂ” окисленная и восста- 10 новленная формы нико тинамиддинуклеотида;.

RC0H — длинноцепочечный алифатический альдегид, gCOOH — соответствующая жир- l5

l ная кислота, Особенностью этой системы является то, что одним из продуктов реакции является светоизлучение в сине-зеле-. ной области спектра (длина волн 520- 20

600 нм).

Экстракты зерна не флуоресцируют °

Зерно размалывают, проводят водную экстракцию, затем из экстракта удаляют остатки размолотого зерна, 25

Приготавливают реакционную смесь, содержащую НАДИ:ФМН-оксидоредуктазу, ° люциферазу.и субстраты ФМН, НАДН и

RC0H. Реакцию инициируют добавлением

НАДН и измеряют интенсивность био- 30 люминесценции на специальном приборе биолюминометре, который состоит из кюветной части, фотоэлектроумножителя, усилителя фототока и регистрирующего устройства (самописец, осциллог- 3 раф и т.п,), Как видно из зависимости, представленной на чертеже, в течение некоторого времени после начала реакции интенсивность свечения растет, дости- 40 гает своего максимального значения и затем начинает медленно падать, Через 20-30 с после достижения максимума биолюминесценции измеряют величину

I, и затем в реакционную смесь добав- 45 K ляют водный экстракт зерна, наблюдают при этом снижение интенсивности биолюминесценции, измеряют Т и по величине отношения Х /Ik судят о степени поражения зерна, чем меньше величина I /I тем сильнее поражено зерно, Пример 1 ° Водные экстракты зерна кукурузы приготавливают следующим образом: к 10 кг размолотого зерна добавляют 30 мл дН О, экстрагируют при постоянном встряхивании на качалке в течение 1 ч и центрифугируют 5 мин при 5 тыс,оборотов в 1 мин, Для измерения интенсивности свечения приготавливают реакционную смесь, содержащую 50 мкл раствора НАДН:ФМНоксидоредуктазы (О, 1 ед, активности в I мл), люциферазы (0,3 мг/мл} и

ФМН { 8 ° 1 0 M), 50 мкл О, 0025/-но го

t раствора тетрадеканаля, 200 мкл

0,1 M фосфатного буфера рН 6,8, 200 мкл 4 1 0 M раствора НАДН. Интенсивность свечения этой реакционной смеси измеряют на биолюминометре в условных единицах, В отсутствие водного экстракта (контроль) интенсивность свечения I 37 усл,ед.

При внесении в реакционную смесь

20 мкл водных экстрактов кукурузы, зараженной в разной степени метаболитами грибов, интенсивность свечения падает, измеряют I .

В табл,1 представлены примеры реализации способа для образцов зерна кукурузы, Точность метода определяли, измеряя среднеквадратичную ошибку в серии из 3-5 измерений для каждого об.разца, Из табл,! видно, что ошибка не превышает 107. Таким образом, точность .метода увеличена по сравнению с прототипом в 2,5-3 раза, время анализа сокращено до 1 ч, т,е, в 6-7 раз метод прост в исполнении, уменьшены трудовые затраты по сравнению с прототипом, Пример 2, В табл,2 представлены примеры реализации способа при добавлении в реакционную смесь разных количеств водных экстрактов кукурузы образца 11 - 3 (количество грибов444,5 тыс/г, содержание ЗФС

1040 мг/кг) .

Как видно из приведенных данных, реализация предлагаемого способа не зависит от количества добавляемого экстракта зерна, Таким образом, предлагаемый способ позволяет при использовании разных количеств экстракта зерна повысить точность определения и уменьшить временные и трудовые затраты, Пример; .3, Водные экстракты нормальной и плесневелой пшеницы приготавливают следующим образом: к 3 г размолотого зерна добавляют 9 мл

1557521 6

Как видно из табл,5, с увеличением к оличес тва фу за риозных з ерен воз- растает степень ингибирования биолюминес ценции °

Таким образом, сравнение примеров 1,2 . и пр..жеров 3,4,5, осуществленных при разном выборе соотношения компонентов, входящих в реакционную смесь, показывает, что от выбора сол) отношения компонентов, входящих в

). реакционную смесь, не влияет на результаты определения, Так как измерения степени поражения зерна всегда

15 проводят по величине относительного изменения интенсивности свечения

/I », то абсолютные величины I о е, и Т» не имеют значения при реализации способа, 20 Пример 6, В табл,6 представлены примеры реализации способа для и- разных количеств водного экстракта е- нормальной и фузариозной (ЗОЖ фузаРиозных зерен)пшеницы, Условия изме25 рения аналогичны примеру 3.

Как видно из данных табл,б предлагаемый способ реализуется при разных количествах экстракта зерна пшеницы, добавляемого в реакционную смесь, 30 Однако в зависимости от сорта„ вида зерна может меняться величина I /Т», Количество экстракта подбирается экспериментально, Таким образом, предлагаемый способ а позволяет увеличить точность измерения в 3-4 раза (ошибка измерений не превышает )OX) уменьшить трудовые а- затраты, Предлагаемый способ является экспресс-методом (время одного.иэ40 мерения 1-1,2 ч), прост, доступен, мое- жет -быть использован для рутинных изд- мерений, дН О, экстрагируют при постоянном встряхивании на качалке в течение

10,30,60 мин при 30 С, Далее экстрак ты центрифугируют при 5 тыс,оборотов в 1 мин в течение 5 мин, либо фильтруют через бумажный фильтр, Для измерения биолюминесценции пр готавливают реакционную смесь, содер жащую 50 мкл раствора НАДН:ФМН-оксид редуктазы (0,01 ед, активности в 1 м люцифераэы (0,015 мг/мл), ФМН (1,7 ° 10 М), 50 мкл 0,0025Х-ного рас вора тетрадеканаля, 500 мкл О,1 M фосфатного буфера рН 7,0, 200 мкл

-Ф

НАДН (4 ° 10 М) . Интенсивность свечения этой реакционной смеси измеряют в условнйх единицах на биолюминометр

10 мкл экстрактов зерна добавляют в реакционную смесь после достижения постоянной интенсивности биолюмннесценции (I ) и измеряют I после дост жения нового уровня интенсивности св чения в присутствии экстракта, В табл.З представлены примеры реа лизации способа в зависимости от вре иени экстракции.

Иэ табл,3 видно, что результаты реализации способа практически не за висят от времени экстракции, от прие ма отделения остатков зерна: центрифугированием или фильтрацией.

Данные по определению количества белка в экстрактах, приведенные в табл,3, свидетельствуют о том, что н результаты определения не влияют . время приготовления экстракта и спо соб отделения обломков зерна (содерж ние белка в экстрактах практически одинаково).

Пример 4, В табл.4 представл ны примеры реализации способа для во ных экстрактов зерна кукурузы, зараженного в разной степени микроскопическими грибами. Приемы измерения све- 45 чения аналогичны приведенным в примере 3, В реакционную смесь добавляют

20 мкл водного экстракта кукурузы.

Из табл,4 видно, что имеется связь между количеством грибов, содержанием ЗФС и величиной Х /I (с увеличением степени поражения зерна величи-. на I>/Х» уменьшается).

Пример 5. В табл,5 представлены примеры Реализации способа для пшеницы. Условия измерения аналогичны примеру 3. В реакционную смесь до" бавляют 5 и 10 мкл водного экстракта пшеницы, Формула изобретения

Способ определения степени пораже-,. ния зерна микроскопическими грибами, заключающийся в размалывании зерна, приготовлении экстракта, введении его реакционную смесь и определении в экстракте наличия грибных метаболитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и упрощения способа, в ка- . честве реакционной смеси используют смесь, содержащую НАДН:ФМН-оксидоредуктазу, люциферазу и их субстра..ты, наличие метаболитов в экстракте определяют по интенсивности их свече155752) присутствии экстрактов зерна и без него, ния, а о степени поражения зерна судят по отношению интенсивностей биолюминесценции реакционной смеси в

Таблица 1

Количество грибов разных видов, .Ф тыс/г

Концент- Т, Т /„Т рация усл,ед, ЗФС, мг/кг

Общее коли0 0 0,3 0

10,5 0 26,0 364

0 70,0 95,0 1040

Таблица 2

КОличест . Т (в ТО в ТО/ ê«%

ВО ВОДНО» УСЛ à ЕД в УСЛ а ЕД а

ГО экст рак та, мкл

5 42

10 42

20 40

50 40

71+3,3

45+5,3

35+3,7

14+3,8

19

13,5

5,5

Та блица 3

Время экстракции, мин

Т /| в%

Пшеница плес нев ела я

Пшеница нормальная

5 мкл 10

5 мкл 10 мкл 20 мкл Белок мг/мл мкл 20 мкл Белок мг/мл!

О (центр.)

30 (центр,)

60 (центр,)

30 (фильтр,) 027 96 78

18 0,28 89 64

0 32 91 66

21 0 25 87 72

Та блица 4

):î,/Тк «% (20 мкл экстракта) Количество грибов, тыс/г

3,7

117,0

435, 0

1970,8 чество грибов, тыс/г

Контроль

0,92

63,6

444,5

0

50,0

0,2

25,0

220,0

77 36 .87 33

74 42

88 51

Содержание ЗФС, мг/кг

6 2-69

104 0

520, 0

416,0

48

33

37

29

100+2, 7

78,4+5,6

54,1 -4,8

35,1+3,7

0,24

40 0,31

27 0,27

29 0,27

1557521

Таблица 6

Таблица 5 о/ к, Пшеница узариэная

Колич е«

Количество фузариоэйых зерен пшеницей у Х ство эк стракта, мкл еница

10 мкл мкл

P льная

0,43

0i53

Oi87

1,27. !

ОО,О

62.8

44,4

5,5

?6

18

gppwp в гу

Составитель М,Шапкина

ТехредЛ.Сердшкова Корректор Н,Король

Редактор Л,Веселовская

Заказ 716 Тирам 509 Подписное!

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

9,0

10,0

15 0

91,9

77,7

69,7

46,5

43,3

19,2

20,0

18,2

5,9

61,4

46,7

28,6

20,?

11,1

13i3

10,2

10,9

6,0

2,7

3,2

30,5

31

41,1

29,3

35,4

30,0

19

12,4

14,0

15,5

2э?

2,4