Способ определения активности протеиназ

Способ определения активности протеиназ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимическому анализу при проведении практических работ в пищевой и рыбообрабатывающей отраслях промышленности. Цель изобретения - повышение точности и упрощение процесса определения активности протеиназ. Способ заключается во взаимодействии ферментного раствора с желатином фотопластины и регистрации степени гидролиза субстрата по скорости растворения желатина. Реакцию проводят путем накладывания пропитанных ферментным раствором кусков фильтровальной бумаги на фотопластину. 2 табл.

СОаз СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1564 45

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТиЯм

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4289073/30-13 1 (22) 24,07.87 (46) 15,05.90. Бюл. Р 18 (71) Атлантический научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии и Институт биохимии им. А.Н.Баха (72) Л.M.Ëàóêîâà, В,В.Мосолов, Л. С. Байдалинс ва и В, П. Быков (53) 577.152.34 (088,8) (56) ГОСТ 20264.2-74, Препараты ферментные. Метод определения протеолитической активности.

Методы исследования фибринолитической системы крови./ Под ред, Г,В,Андреенко, М.:МГУ, 1981, с. 4345.

Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способам определения активности протеиназ, и может быть использовано при практических работах в энзимологической, пищевой и рыбообрабатывающей промышленности, и особенно для быстрого определения пригодности сырья для производства ферментных препаратов, Цель изобретения -повышение точности и упрощение процесса.

Способ заключается в том, что ферментный раствор наносят на куски фильтровальной бумаги одинаковой площади и толщины. Этот прием исключает необходимость!использования точной мерной посуды и обеспечивает оперативность выполнения определения. В качестве субстрата используют желащ) ° 01 N 33/48, С 12 q 1/37

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ПРОТЕИНАЗ (57) Изобретение относится к биохимическому анализу при проведении практических работ в пищевой и рыбообрабатывающей отраслях промышленности.

Цель изобретения — повышение точности и упрощение процесса определения активности протеиназ. Способ заключается во взаимодействии ферментного раствора с желатином фотопластины и регистрации степени гидролиза субстрата по скорости растворения желатина. Реакцию проводят путем накладывания пропитанных ферментным раствором кусков фильтровальной бумаги на фотопластину, 2 табл. тин, нанесенный ровным слоем, постоянной высоты на фотографические пластины. Замена быстропортящегося субстрата на стандартнь|е пластины с желатиновым слоем избавляет работающих от необходимости частого приготовления реактива. Далее реакцию ферментного раствора с субстратом осуществляют путем накладывания смоченной раствором фермента фильтровальной бумаги на покрытую слоем желатина сторону фотографической пластины и выдержи, вания пластиньь в течение определенного интервала времени, Такая организация анализа приводит к возможности его выполения без специального оборудования (термостата) и подготовки работающих. Регистрацию степени гидролиза субстрата ведут по ско1564545 рости гидролиза желатина, а именно поскорости образования прозрачных пятен под смоченной ферментным раствором фильтровальной бумагой.

Способ осуществляют следующим образом.

Кусочки фильтровальной бумаги одинаковой площади и толщины смачивают в экстракте протеиназ и быстро накла- 1g дывают рядами на матовую сторону фотопластины. Для получения одинаковых кусков бумаги удобно пользоваться канцелярским дыроколом, позволяющим получить кружки бумаги одинаковой площади. Фотопластину накрывают чашкой Петри и помещают горизонтально на рабочий стол. Температурный режим в процессе гидролиза обеспечивают настольной лампой на уровне

25 2 С, при необходимости опуская или поднимая ее.

Первый ряд кружков бумаги снимают через 10 мин, последующие — через каждые следующие 5 мин. Реакцию считают законченной при полном раство.рении желатинового слоя фотопластины и появлении на ней прозрачных пятен под одним из рядов кружков бумаги.

В табл. 1 приведены данные о величине активности протеиназ в зависи мости от продолжительности растворения желатина.

Продолжительность определения активности протеинаэ не превышает

50 мин.

Пример 1. Построение калибровочной кривой. Готовят растворы препарата протеолитических ферментов из креветки с концентрацией О, 1

1,5 мг/мл. Экстракты протеиназ готовят непосредственно перед определением активности. Навеску анализируемого материала, взвешенную с точностью до 0,01 г, растирают в фарфоровой ступке с водой ° Гомогенат наста0 ивают 30 мин в холодильнике при 2 С и фильтруют в пробирку через бумажный фильтр. Полученный фильтрат анализируют.

Кружки фильтровальной бумаги диаметром 5 мм вырезают иэ бумаги с помощью канцелярского дырокола, затем берут пинцетом, смачивают в экстракте протеиназ и быстро накладывают на покрытую слоем желатина сторону фото55 пластины. На одну фотопластину накладывают пять вертикальных рядов кружков (но три кружка в одном ряду).

Фотопластину с кружками накрывают чашкой Петри во избежание высыхания экстракта, помещают на рабочий стол и выдерживают при 25+2 С. В случае пониженной температуры в рабочем помещении пластину обогревают настольной лампой. Для контроля эа температурой с рядом пластиной помешают термометр. Для остановки реакции точно через 10 мин пинцетом снимают первый ряд бумажных кружков. Последующие ряды кружков бумаги, смоченной экстрактом протеиназ, снимают через каждые

5 мин.

Реакцию считают законченной при полном растворении желатинового слоя фотопластины и появлении на ней прозрачных пятен под одним из рядов кружков фильтровальной бумаги. Продолжительность реакции фиксируют, После снятия всех кружков пластину ополаскивают в кристаллизаторе с водой комнатной температуры и удаляют влагу фильтровальной бумагой. Для каждого иэ исследуемых растворов используют отдельную фотопластину.

Параллельно проводят определение протеолитической активности по модифицированному методу Аксона.

При построении калибровочной кривой или калибровочной таблицы величину интервала можно изменять с заданной степенью точности путем варьирования интервалов между наблюдениями, концентрации ферментного раствора и температуры проведения реакции. Таким образом, чувствительность метода предусматр; вает требуемую реальность условиями степень точности.

Пример 2. 1 г ферментного препарата иэ креветки, взвешенный с точностью до 0,01 r диспергируют в

9 мл воды, настаивают 30 мин в холодильнике и фильтруют через бумажный фильтр в стеклянную пробирку.

Определяют разведение

1 + 9

С = — — — - — — = 10

1 (удельную массу воды принимают равной 1,0 г/см ) .

Э

Из фильтровальной бумаги вырезают с помощью канцелярского дырокола кружки диаметром 5 мм.

Кружки берут пинцетом, смачивают в фильтрате ферментного раствора, накладывают на матовую сторону фотопластины, расположенной на горпэон5

15 тальной поверхности. На одну фотопластину накладывают пять вертикальных кружков (по три кружка в .одном ряду). Фотопластину с кружками накры-, вают чашкой Петри во избежание высы-, хания экстракта протеинаэ.

Для остановки реакции точно через

10 мин пинцетом снимают первый ряд бумажных кружков. Последующие ряды кружков снимают через каждые 5 мин.

Прозрачные пятна под кружками появились в 4 ряду, т.е. через 25 мин.

По табл. 1 определяют активность протеиназ в единице объема ферментного раствора (ПА 2,3 — 3,5 ед/см ). В пересчете на 1 г препарата ПА 23—

35 ед/г.

Пример 3. 0 5 мг препарата трипсина, взвешенного с точностью до

0,01 r диспергируют в 10 мл воды, настаивают 30 мин при 4 С, фильтруют через бумажный фильтр.

Определяют разведение 10000 +

+ О, 5/О, 5 = 20000, Определение активности проводят также, как описано в примере

Прозрачные пятна под кружками смоченной ферментным раствором бумаги появляются через 45 мин. По таблице определяют активность протеинаэ в единице объема раствора трипсина (ПА О, 4 — О, 6 ед/см ) . В пересчете на 1 г трипсина ПА 8000 — 12000 ед/г.

Пример 4. 5 r измельченных внутренностей зубана, взвешенных с точностью до 0,01 г, растирают в фарфоровой ступке с 10 мл воды. Гомогенат настаивают 30 мин в холодильнике и фильтруют.

Разведение 5 - 10/5 = 3 °

Определение активности проводят . также, как описано в примере 1. Прозрачные пятна под кружками смоченной экстрактом фильтровальной бумаги появились в 9 ряду, т.е. через 50 мин.

По таблице определяют активность протеиназ в 1 см : 0,3 — 0,4 ед/см, что

Ъ. 9 составляет с учетом разведения внутренностей зубана ПА 0,9 — 1,2 ед/г.

Пример 5. 1 г протосубтилина растворяют в 9 мл воды, диспергируют, настаивают и фильтруют в пробирку.

Определение активности проводят также, как в примере 1.

Прозрачные пятна появились в t ряду, т.е. через 10 мин. Это значит, 64545 6 что ПА В 8,37 ед/см . С учетом раз .ведения определяют ПА 83,7 ед/г.

Пример 6 (контрольный). На матовую (платиновую) сторону фотопластины, расположенной на поверхности рабочего стола, наносят микропипеткой

0,2; 0,4; 0,6 мл биологической жид" кости креветки. На одну сторону фотопластины наносят пять вертикальных рядов капель (по три капли в одном ряду) и наблюдают за появлением прозрачных пятен под каплями, Через 50 мнн наблюдают образование прозрачных пятен. К этому моменту биологическая жидкость подсыхает, сохраняя постоянный диаметр пятна, соответствующий диаметру растекшейся капли. °

20 В табл. 2 приведены результаты определения протеолитической активности ферментного препарата креветки по методу Аструпа (субстрат — желатин).

25 Ход анализа по известному способу позволяет определить присутствие протеингз в биологической жидкости креветки, но не дает основание судить о ее величине. Растворы различной концентрации гидролиэуют желатину за разное время, диаметр пятна под каплей сохраняет стабильные режимы.

Таким образом, преимуществом предлагаемого способа по сравнению с известным является возможность не только качественной, но и количественной оценки протеолитической активности.

Способ прост и применим в судовых

40 условиях, позволяет определять активность протеиназ без использования специального оборудования и с достаточной точностью.

45Формула изобретения

Способ определения активности протеиназ, включающий получение ферментного раствора, проведение фер50 ментативной реакции с твердым субстратом с последующей регистрацией степени гидролиза субстрата, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения процесса, полученным ферментным раствором пропитывают куски фильтровальной бумаги одинаковой площади и толщины, реакцию проводят путем взаимодействия пропитанной ферментным раствором, 1564545 8 дут по образованию прозрачнык пятен на фотопластине под фильтровальной бумагой. фильтровальной бумаги с желатиновым слоем, нанесенным на фотопластины, а регистрацию степени гидролиза ве1

Таблица 1

Протеолитическая активность препарата, мкмоль THposH на/см мин з

Продолжительност растворения жела тина, мин

Концентрация препарата, мг/мл

Ряд

У 5

Таблица 2

Диаметр, мм

Наносимый объем

Концентрация препарата, мг/мл капли пятно под каплей раствора,мл

0i 2

0,4

0,6

Составитель А. Карякин

Редактор Т,Парфенова Техред Л.Сердюкова, Корректор С.Шекмар

Тираж 514

Подписное

Заказ 1156

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

2

4

6

8

1,5

1,0

0,75

0,5

0,25

0,16

О, 125

0,1

1 ф 5

0,75

0,25

0,1

0,75

0» 25

0,1

1,5

0,75

0,25

0,1 .

14

14

14

14

17

17

17

«8,4

5,4-8,4

3,5-5,4

2,3-3,5

1,5-2,3

1, 0-1,5

0,6-1, О

0,4-0, 6

0,3-0,4

14

14

14

14

17

17

17