Способ получения натриевой соли пировиноградной кислоты

Патент 1707983

Авторы

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения пировиноградной кислоты (ПВК) в виде Na-соли из культуральной жидкости. ПВК используется при получении лекарств для лечения туберкулеза и средств против анемии, биологической очистке сточных вод, изготовлении пластификаторов для полимеров, применяется при ферментативном способе получения тирозина, триптофана и цистеина. Целью изобретения является повышение чистоты препарата. Изобретение заключается в том, что фильтрат культуральной жидкости концентрируют упариванием в вакууме до начала выпадения осадка, подкисляют избытком моногидрата кислого сульфата натрия, затем при пониженном давлении отгоняют водную ПВК, к полученному раствору ПВК добавляют кристаллический бикарбонат натрия до рН 4,0-5,3, далее раствор упаривают и Na-соль ПВК осаждают этиловым спиртом, осадок отфильтровывают, промывают спиртом и сушат в вакуум-спирте и сушат в вакуум-эксикаторе под P₂O₅. Способ выделения Na-соли ПВК обеспечивает получение чистого (99%) продукта с высоким выходом (58-63%) от исходного содержания в культуральной жидкости.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения микробиологическим методом органических кислот, которые могут найти применение в микробиологической, химической и медицинской промышленности. Пировиноградная кислота (ПВК) используется при получении лекарств для лечения туберкулеза и средств против анемии, биологической очистке сточных вод, изготовлении пластификаторов для полимеров, применяется при ферментативном способе получения тирозина, триптофана и цистеина. Целью изобретения является повышение степени чистоты продукта. Способ заключается в том, что фильтрат культуральной жидкости, полученной при выращивании дрожжей Сandida lipolytica на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода глицерин, концентрируют упариванием в вакууме до начала выпадения осадка, добавляют моногидрат кислого сернокислого натрия, взятый в избытке для перевода пировиноградной кислоты из солей в свободную форму, затем отгоняют воду и пировиноградную кислоту, подщелачивают отогнанный раствор для перевода пировиноградной кислоты в соль и выделяют целевой продукт известными способами. Получают Na-соль ПВК с содержанием основного вещества 99% и общим выходом 58-63% (от исходного в культуральной жидкости). Способ применим ко всем культуральным жидкостям, а также растворам, не содержащим других летучих кислот, кроме пировиноградной, при химических способах получения. В данном способе оптимальным является концентрирование фильтрата культуральной жидкости до начала выпадения осадка. При более глубоком концентрировании начинают выпадать в осадок присутствующие в культуральной жидкости соли, что создает значительные сложности при выгрузке концентрата. При меньшей степени концентрирования увеличиваются объемы растворов, подлежащих дальнейшей обработке. Концентрирование фильтрата культуральной жидкости в целях предотвращения самоконденсации ПВК желательно проводить при пониженном давлении и температуре <50^{C. Для перевода ПВК из солей в свободную форму используют мягкий подкисляющий реагент моногидрат кислого сернокислого натрия, который хорошо растворяется в концентрате культуральной жидкости, плавясь в кристаллизационной воде при температуре 58^oC, что удовлетворяет наиболее полному протеканию обменной реакции. В культуральной жидкости дрожжей, помимо солей ПВК, присутствуют соли других органических кислот. ПВК является наиболее сильной кислотой из них и, следовательно, переходит из солей в свободную форму последней. Чтобы выход ПВК не снижался за счет неполного образования кислой формы, необходима альтернатива: либо для каждой партии культуральной жидкости определять точный состав всех кислых компонентов, что весьма затруднительно, либо брать в избытке подкисляющий реагент. При получении ПВК химическими и микробиологическими способами избыток кислого неорганического реагента разрушается ПВК и, следовательно, способствует снижению ее выхода. К тому же, избыток соляной кислоты будет отгоняться вместе с водной ПВК и загрязнять конечный продукт хлористым натрием. Оптимальным является 1,9 2,1-кратный мольный избыток моногидрата кислого сернокислого натрия в расчете на ПВК, содержащуюся в культуральной жидкости. При использовании 2,2-кратного мольного избытка подкисляющего реагента выход продукта не увеличивается и составляет 57,4% от исходного содержания ПВК. При снижении избытка подкисляющего реагента до 1,7-кратного выход продукта снижается до 54,2% В культуральной жидкости дрожжей Candida lipolytica, выращенных на питательной среде с глицерином, помимо пировиноградной кислоты присутствуют такие соединения, как -кетоглутаровая кислота (a-КГТ) (3-10 г/л), глицерин (0-9 г/л), g-метил-g-гидрокси-a-кетоглутаровая кислота (парапируват), тиамин, неорганические соли. Отгонка ПВК из подкисленного концентрата позволяет освободиться от всех примесей, содержащихся в культуральной жидкости, так как только ПВК обладает летучестью. При атмосферном давлении ПВК кипит с разложением (165^oC). Поэтому для получения чистой ПВК отгонку проводят в вакууме (при 10 мм рт.ст.). При получении Na-соли ПВК для подщелачивания используют разбавленные водные растворы гидроксида натрия (0,5n) или растворы карбоната натрия. В данном способе используют кристаллический бикарбонат натрия, применение которого позволяет получать чистые препараты, не приводит к увеличению объема обрабатываемых растворов и не требует дополнительного охлаждения при проведении реакции нейтрализации, так как растворение бикарбоната натрия в воде эндотермический процесс. Для получения солей с содержанием основного вещества 99% оптимальной является область рН 4,0-5,3. При более высоких значениях рН выход Na-соли ПВК не увеличивается, но значительно ухудшается чистота препарата. При рН 5,5 содержание основного вещества в Na-соли составляет 98% а выход продукта 59,7% При рН 6,0 получается продукт лишь с 96%-ным содержанием основного вещества. Уменьшение конечного значения рН ниже 4,0 приводит к снижению выхода Na-соли. Так, при добавлении к водному раствору ПВК кристаллического бикарбоната натрия до рН 3,8 получают Na-соль ПВК с содержанием основного вещества >99% с выходом 56,8% П р и м е р 1. Фильтрат культуральной жидкости, полученной при выращивании дрожжей Сandida lipolytica BKM У-2378 на питательной среде с глицерином (400 мл), питательной среде с глицерином (400 мл), содержащий, г/л: ПВК 37,5, a-КГК 5,3, глицерин 0, упаривают при пониженном давлении и температуре не выше 45^oC, приблизительно в 5,5 раза (по объему) до начала выпадения осадка. Остаток переносят в круглодонную колбу емкостью 200 мл, добавляют 49,3 г (2,1-кратный мольный избыток в расчете на ПВК) моногидрата кислого сернокислого натрия, 3,5 г стеклянной ваты (для уменьшения вспенивания и разбрызгивания) и прогревают при 74-80^oC в течение 20-30 мин для полного растворения кислого сернокислого натрия. Продолжая нагревание, постепенно понижают давление до 10 мм рт.ст. и отгоняют воду с частью ПВК, охлаждая приемник (0^oC). Остатки ПВК отгоняют, повышая нагрев до 100^oC. Перегонку продолжают до полного прекращения отгонки ПВК. К полученному водному раствору добавляют кристаллический бикарбонат натрия до рН 4,0 при постоянном перемешивании. Водный раствор Na-соли ПВК упаривают при пониженном давлении и температуре не выше 5^oC пастообразного состояния. К остатку добавляют 120 мл технического абсолютного этилового спирта при перемешивании и выдерживают 2 ч при 0^oC. Осадок отфильтровывают, промывают 20 мл 95% -ного этилового спирта и сушат в вакуум-эксикаторе над Р₂O₅. Получают 11,40 г (61,3%) Na-соли ПВК с содержанием основного вещества >99% П р и м е р 2. Аналогично примеру 1 обрабатывают 400 мл фильтрата, содержащего, г/л: ПВК 37,2, a-КГК 5,3, глицерин 0. К водному раствору ПВК добавляют кристаллический бикарбонат натрия до рН 4,5. Выделяют 11,68 г (62,8% Na-соли ПВК с содержанием основного вещества >99% П р и м е р 3. Проводят опыт аналогично примеру 2, но при рН водного раствора ПВК 5,3. Выделяют 11,32 г (60,9%) Na-соли ПВК с содержанием основного вещества 99% П р и м е р 4. Как в примере 1, при рН 5,5 выделяют 11,2 г (59,7%) Na-соли ПВК с содержанием основного вещества 98% П р и м е р 5. Повторяют пример 1, но при рН 3,8. Выделяют 10,65 г (56,8) Na-соли ПВК с содержанием основного вещества 99% П р и м е р 6. Фильтрат культуральной жидкости, полученной при выращивании дрожжей Candida lipolytica ВКМ У-2407Д на питательной среде с глицерином (400 мл), содержащий, г/л: ПВК 41,0, a-КГК 6,0, глицерин 4,5 упаривают при пониженном давлении и температуре ниже 45^oC до начала выпадения осадка. К остатку добавляют 48,9 г (1,9-кратный мольный избыток в расчете на ПВК) моногидрата кислого сульфата натрия и отгоняют воду и ПВК в вакууме. К полученному водному раствору ПВК добавляют кристаллический бикарбонат натрия до рН 5,3 и упаривают при пониженном давлении и температуре не выше 45^oC. Выделяют 11,93 г (58,2%) Na-соли ПВК с содержанием основного вещества 99% П р и м е р 7. Фильтрат культуральной жидкости дрожжей Сandida lipolytica ВКМ У-2407Д (400 мл), содержащий, г/л: ПВК 39,5, a-КГК 5,0, глицерин 4,5, концентрируют при пониженном давлении. Остаток подкисляют 42,1 г (1,7-кратный мольный избыток в расчете на ПВК) моногидрата кислого сульфата натрия и выделяют продукт аналогично примеру 1. Получают 10,7 г (54,2%) Na-соли ПВК с содержанием основного вещества >99% П р и м е р 8. Фильтрат культуральной жидкости дрожжей Сandida lipolytica ВКМ У-2399 (400 мл), содержащий, г/л: ПВК 36,2, a-КГК 5,2, глицерин 4,0, концентрируют при пониженном давлении. Остаток подкисляют 50 г (2,2-кратный мольный избыток в расчете на ПВК) моногидрата кислого сульфата натрия и выделяют продукт аналогично примеру 1. Получают 10,4 г (57,4%) Na-соли ПВК с содержанием основного вещества >99% П р и м е р 9. Фильтрат культуральной жидкости дрожжей Candida lipolytica ВКМ У-2399 (5,8 л), содержащий, г/л: ПВК 35,6, a-КГК 8,9, глицерин 8,0, концентрируют в вакуумном роторном испарителе (ROTAVAPOR 150 фирмы "Buchi", Швейцария) в отгонной колбе на 6 л при температуре бани 45^oC до первых признаков появления осадка. В колбу добавляют 2,0-кратный мольный избыток в расчете на ПВК моногидрата кислого сульфата натрия и смесь прогревают на водяной бане при 80^oC в течение 20 мин при перемешивании. Горячую воду в бане заменяют холодной. Включают вакуум (1 кгс/см²) и отгоняют сначала воду, а затем ПВК, повышая температуру бани до 95^oC. Отгонку ведут до полного прекращения поступления ПВК в приемник. Водный раствор ПВК сливают и обрабатывают аналогично примеру 1. Получают 153 г (59,3%) Na-соли ПВК с содержанием основного вещества 99% Способ получения Na-соли ПВК обеспечивает получение чистого ($E>=>99%) продукта с высоким выходом (58 63%).}

Формула изобретения

Способ получения натриевой соли пировиноградной кислоты, предусматривающий обработку фильтра культуральной жидкости, полученной выращиванием штамм-продуцента пировиноградной кислоты Candida lipolytica, кислым неорганическим реагентом для перевода пировиноградной кислоты в свободную форму с последующим подщелачиванием раствора и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты продукта, перед обработкой фильтрата кислым неорганическим реагентом осуществляют его концентрирование до начала выпадения осадка, в качестве реагента используют моногидрат кислого сернокислого натрия, который вводят в избытке, перед подщелачиванием проводят отгонку пировиноградной кислоты с последующим ее переводом в соль, при этом культуральную жидкость используют после выращивания штамма-продуцента на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода глицерин.