Штамм streptomyces aureofaciens - продуцент хлортетрациклина

Штамм streptomyces aureofaciens - продуцент хлортетрациклина

Реферат

 

Использование: микробиологическая промышленность, производство хлортетрациклина, применяемого в качестве кормовой добавки для стимуляции роста животных. Сущность изобретения: штамм Streptomyces aureofaciens позволяет в течение 144 часов ферментации достичь уровня накопления антибиотика 18000 ед/мл. Высокий уровень антибиотикообразования сохраняется при повышении температуры до +32С 1 табл. 2 пр.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотика тетрациклинового ряда - хлортетрациклина, используемого в качестве кормовой добавки для стимуляции роста животных. Известны штаммы S. aureofaciens - продуценты антибиотика хлортетрациклина (ХТЦ), полученные с применением мутагенов (а. с. СССР N 187242). В качестве прототипа рассматривают штамм S. aureofaciens ТБ-633-ФУ (а. с. СССР N 431789), который в лабораторных условиях на регламентной среде N 1 с кукурузной мукой и кукурузным экстрактом образует от 8000 до 14000 мкг/мл ХТЦ за 168 ч ферментации. Указанный штамм в настоящее время применяется в СССР для промышленного производства ХТЦ и является также базовым образцом. Штамм-прототип имеет следующие недостатки: длительный срок ферментации и недостаточно высокий уровень антибиотикообразования, а также характеризуется сниженным уровнем антибиотикообразования при повышении температуры выше 30^оС. Цель изобретения - сокращение сроков ферментации, повышение уровня образования ХТЦ, а также сохранение уровня антибиотикообразования при повышенной температуре. Поставленная цель достигается путем получения нового штамма S. aureofaciens "ВНИИгенетика 737", депонированного во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеющего регистрационный номер ВКПМ S-859. Новый штамм S. aureofaciens ВКПМ S-859 получен из штамма S. aureofaciens ТБ-633-ФУ путем обработки мутагенами следующим способом: на чашки с минимальной средой наносят слой полужидкого агара того же состава, содержащий споровую суспензию культуры S. aureofaciens ТБ-633-ФУ и раствор нитрозогуанидина в концентрации 5 мкг/мл. На стадии прорастания спор смесь центрифугируют, отмывают физиологическим раствором или дистиллированной водой и рассеивают на чашки с полноценной средой N 12, содержащей антибиотик ХТЦ в концентрации 3000 мкг/мл. Выросшие на чашках колонии вторично проверят на устойчивость к ХТЦ, перенося их на ту же среду с указанной концентрацией антибиотика. Устойчивые колонии переводят на скошенную полноценную среду N 12 без антибиотика и доводят до стадии споруляции. Сопоставление предлагаемого штамма с известным (таблица) позволяет сделать следующие выводы. Данный штамм S. aureofaciens ВКПМ S-859 образует на регламентной среде N 1 до 15000 мкг/мл ХТЦ, а на модифицированной ферментационной среде с кормобактерином N 2 (заявка N 4748864) - до 18000 мкг/мл ХТЦ в отличие от прототипа, максимальный уровень накопления которого на среде N 1 не превосходит 14000 мкг/мл ХТЦ. Одновременно использование предлагаемого штамма приводит к сокращению сроков процесса ферментации с 168 до 144 ч и изменению границ температурного оптимума процесса антибиотикообразования с 28-30 до 31-32^оС. Характеристика штамма S. aureofaciens ВКПМ S-859. Культурально-морфологические признаки. На регламентной агаризованной среде N 12 с кукурузным экстрактом и крахмалом (см. пример 1) штамм образует на 8-10 день роста при 30^оС субстратный мицелий темно-коричневого цвета. Воздушный мицелий имеет серо-бежевую окраску. Колонии складчатые, диаметром 5-7 мм. Споруляция колоний обильная. На среде с кукурузным экстрактом N 6 (Генетика, 1972, т. 8, N 5, с. 94-100) штамм образует на 6-8 день роста при 30^оС слабо выпуклые, лишенные кратера колонии со слабоскладчатой поверхностью. Воздушный мицелий в центре слабо развит субстратный мицелий темно-каштановый, споруляция слабая, диаметр колоний 4 мм. На среде с пептоном и кукурузным экстрактом (ПКА-2) (Генетика, 1971, т. 7, N 6, с. 110-116) на 8-10 день роста при 30^оС штамм образует плоские, слабоскладчатые колонии диаметром 2 мм. Субстратный мицелий бурый, воздушный мицелий развит слабо, споруляция фактически отсутствует. Физиологические и биохимические свойства. В качестве источника азота предлагаемый штамм использует аммонийные соли и нитраты, обладает высокой протеолитической активностью, благодаря чему использует азот органических соединений (кукурузный экстракт, кормобактерин, соевая мука и др. ). Наиболее интенсивно синтез ХТЦ идет в присутствии минерального и органического источников азота. Штамм устойчив к 3000 мкг/мл ХТЦ, тогда как штамм прототип только к 200 мкг/мл ХТЦ на среде N 12. Оптимальная величина рН всех использованных сред для штамма ВКПМ S-859 составляет 6,8-7, оптимальный температурный режим 31-32^оС. Антагонистические свойства. Продуцируемый штаммом антибиотик ХТЦ подавляет рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: стафилококков, стрептококков, кишечной палочки, псевдомонад, бацилл, дифтерийной палочки. Штамм непатогенен: продукт, получаемый при использовании этого штамма нетоксичен. Продуктивность штамма иллюстрируется следующими примерами. П р и м е р 1. Колонии штамма ВКПМ S-859 выращивают в течение 8-10 сут на агаризованной среде N 12, затем пересевают на косяки с этой же средой следующего состава, мас. % : Кукурузный экстракт (техническая масса) 1 Картофельный крахмал 1,5 Фосфорнокислый дву- замещенный аммоний 0,4 Фосфорнокислый дву- замещенный калий 0,2 Сернокислый магний 0,025 Углекислый кальций 0,1 Агар 2 Выращивание ведут в течение 12-14 сут при 30^оС. Для получения посевного материала культуру с косяков переносят в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл с 50 мл среды (рН 6,75) следующего состава, мас. % : Кукурузный экстракт (техническая масса) 5 Кукурузная мука 6 Водопроводная вода До 100 Выращивают на круговой качалке в течение 24 ч при 200 об/мин и температуре 32^оС. Посевной материал используют для засева в колбы с ферментационной средой N 1 следующего состава, мас. % : Кукурузный экстракт (техническая масса) 1 Кукурузная мука 8 СаСО₃ 0,8 NH₄Cl 0,4 (NH₄)₂HPO₄ 0,035 NH₄NO₃ 0,6 Роданистый бензил 0,0003 Жир 3,0 Водопроводная вода До 100 Ферментацию проводят на круговой качалке при 200 об/мин и температуре 32^оС в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл с 30 мл среды и 5% посевного материала. Антибиотическую активность оценивают фотоколориметрически. Через 144 ч ферментации штамм S. aureofaciens ВКПМ S-859 синтезирует 15000 мкг/мл антибиотика ХТЦ. П р и м е р 2. Выращивают посевной материал и проводят ферментацию аналогично примеру 1. Однако в качестве ферментационной используют среду N 2 следующего состава, мас. % : Кукурузный экстракт (техническая масса) 0,84 Кормобактерин 0,25 Кукурузная мука 8,0 СаСО₃ 0,8 NH₄Cl 0,4 (NH₄)₂HPO₄ 0,035 NH₄NO₃ 0,6 Роданистый бензил 0,0003 Жир 3 Водопроводная вода До 100 Через 144 ч ферментации штамм S-859 синтезирует 18000 мкг/мл антибиотика ХТЦ. Таким образом, применение штамма S. aureofaciens ВКПМ S-859 в отличии от штамма прототипа S. aureofaciens ТБ-633-ФУ позволяет в течение более короткого времени ферментации (144 вместо 168 ч) достичь более высокого (28% ) уровня накопления антибиотика ХТЦ и обеспечивает сохранение высокого уровня накопления антибиотика ХТЦ при повышении температуры до 32^оС. Следовательно, использование предлагаемого штамма в промышленных условиях позволяет значительно повысить экономичность процесса получения антибиотика ХТЦ. (56) Авторское свидетельство СССР N 187242, кл. С 12 Р 25/00, 1966. Авторское свидетельство СССР N 431789, кл. С 12 Р 25/00, 1975.

Формула изобретения

Штамм Streptomyces aureofaciens ВКПМ S-859-продуцент хлортетрациклина.

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины заподдержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 22.02.2009

Дата публикации: 27.08.2011