Штамм бактерий bacillus acidocaldarius, используемый для силосования соломы

Штамм бактерий bacillus acidocaldarius, используемый для силосования соломы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: биотехнология и может быть использовано при производстве биомассы бактерий, используемой в качестве закваски для биоконверсии (силосования) соломы. Сущность изобретения: полученный штамм бактерий Bacillus acidocaldarius

СОК33 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4865128/13 (22) 10.09.90 (46) 28.02.93. Бюл. М 8 (71) Институт микробиологии и вирусологии

АН КазССР: (72) М.Г, Саубенова, О.М. Пузыревская, Р.LU.

Галимбаева, M.P. Балагутина и А.Н. Илялетдинов (73) Институт микробиологии и вирусологии

АН КазССР (56) Авторское свидетельство СССР

М 1221240, кл. С 12 М 9/42, 1983. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАС! LUS

AClD0CALDARlUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ

СИЛОСОВАНИЯ СОЛОМЫ (57) Использование; биотехнология и может быть использовано при производстве биомассы бактерий, используемой в качестве

Изобретение относится к сельскому xo" эяйству и может быть использовано в кормопроиэводстве для микробной конверсии соломы или других целлюлозосодержащих субстратов с целью получения корма с повышенными по сравнению с исходным сырьем поедаемостью и питательностью, Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, ассимилирующих целлюлозу.

Это достигается применением Вас}Ицз

acidocaldarius 17 — штамма, отличающегося от штамма-прототипа С.flavigena более высокой популяционной устойчивостью и технологичностью, что способствует снижению затрат и получению стабильных результатов как при производстве закваски, так и при биоконверсии субстрата, осуществляемой по методу силосования. Преимуществом

„„Я „„1799395 А3 (gi)s С 12 и 9/42, 1/20, А 23 К 3/00 закваски для биокон версии (силосования) соломы. Сущность изобретения: полученный штамм бактерий Bacillus acidocaldarius (17), ВКПМ B-5250 отличается высокими показателями скорости роста, интенсивностью накопления биомассы и ферментной активностью, а также популяционной устойчивостью, обусловливающей его технологичность. Ацидо- и термотолерантность

В.acldocaldarius 17обеспечиваеттакже его конкурентоспособность и высокую активность в процессе анаэробной ферментации соломы. Использование В.acidocaldarius 17 в смешанной культуре со Streptococcus

lactis diastaticus способствует углублению процесса расщепления целлюлозы, повышению сохраняемости корма и повышению эффективности ферментации соломыл 3 табл. предлагаемого штамма перед ранее известным является отсутствие полиморфности и популя ционная устойчивость. Способность B.acidocaldarius17 к спорообразованию, его К. ) термоустойчивость и ацидотолерантность (1 обеспечивает более высокую выживаемость в экстремальных условиях, в частности при приготовлении сухих препаратов методом раслылитальной или лиофильнои сушки, а ) ь также ir процессе созревания силоса, когда (а температура силосуемой массы возрастет до 60 С и выше. Эта температура s сочетании с кислыми значениями рН среды вызывает гибель штамма-прототипа и прекращение процесса расщепления целлюлозы, тогда как В,acidocaldarius 17 в этих условиях остается жизнестойким и активным, B.acldocaldarius 17 отличается от

C;flavigena 22 значительно более высокими

1799395 показателями скорости роста, активности накопления биомассы и экономического коэффициента, что снижает затраты на производство бактериальных зэквасок.

Высокая технологичность штамма

В,acldocaidarius, установленная в лабораторных опытах, в процессе наработки заквасок на опытно-промышленной установке

Института микробиологии и вирусологии

АН республики Казахстан, а также в производственных исйытаниях показала перспективность его широкого; внедрения в кормопроизводстве, Этот штамм рекомендован для получения заквасок в условиях промышленного производства. На Степногорской научной опытно-промышленной базе (СНОПБ ПО "Прогресс" ) отработан опытно-промышленный регламент получения его биомассы.

Предлагаемый штамм бактерий

В.acidocaldarius 17 имеет следующую морфологическую и физиологическую характеристику.

Грамположительные бактерии относятся к температура- и кислотоустойчивым. .Представляют собой палочки с закругленными койцами, размер 0,8 х 3,5 микрон; с возрастом они по форме приближаются к коккам. Располагаются поодиночке, парами и короткими цепочками, Концевые споры.

Подвижны, факультативный аэроб.

Ферментативные свойства. а) сахэролитические:

1. Расщепляют глюкозу, арабинозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу до кислоты. При сбраживании углеводов газы не образуют, 2. Гидролизуют полисахариды; крахмал, декстрин и целлюлозу, 3, Из спиртов гидролизуют маннит, дульцит нет, б) протеолитические:

1. На МПБ аммиак образуют хорошо, а индол и сероводород слабо, 2. Желатину разжижают, 3. Вызывают подщелочение и протеолиз молока.

1. Ацетоин не образуют, 2. Каталэзу образуют, 3, Тирозин не расщепляют, 4. Казеин не гидролизуют.

5. Нитраты восстанавливаются в нитриты.

6. На 0,001% лизоциме роста нет, 7. На МПБ образуют щелочь.

8. Нэ l-10% NaCl рост хороший.

9. На среде Сабуро рост хороший. Колония серого цвета с легким розовым оттенком.

10. Рост на МПБ — пленка тонкая. Среда прозрачная, Осадок средний, рыхлый.

10 ное, очень медленное.

UJTaMM синтезирует конститутивно комплекс целлюлаз, характерных для целлюлолитических бактерий. При концентрации

15 10 бэктериальных клеток в.1 мл среды:целлюлолитическая активность равна 7 — 9 мг рв/мл (на фильтровальной бумаге). Культуру хранят на скошенном суслоагаре или 0,7 соломенном агаре при 5 С, 20 пересев необходим через два месяца, Для культивирования штамма применяют жидкую среду следующего состава. r/n:

МаМОз 20

К НРО4 1,0

25 MgS04 0,3.

NaCl . 10

Дрожжевой автолизат 1,0

Глюкоза или крахмал 10 г

Культивирование 24 ч 30 — 35 С, рН вЂ” 6 — 7, 30 Штамм выделен из прелой соломы путем пересевов на среду с соломенным агаром. Способен развиваться на соломе в анаэробных условиях при значениях рН силоса 3,8,— 4,7, 35

11. Рост на РПА — поверхность мозговидная. Матовая (мучнистая). Бежево-серого цвета, Край колонии лопастной, Структура крупнозернистая, консистенция плотная, легко снимается с агара пленкой, не тянется за петлей (не слизистая). Способность эмульгироваться — взвесь в виде обрывок пленки.

12. Желатина уколом, Светло-бежевый поверхностный рост. Разжижение послойДля углубления процесса бактериальной конверсии целлюлозы В.acidocaldarius

17 (ЦЛБ) используется в смешанной культуре со Streptococcus lactis diastaticiis (АМС), который ассимилирует продукты метабо- . лизма целлюлолитических бактерий, устраняя явление катаболитной репрессии и стимулирует его рост какими-то (неидентифицированными) продуктами своего метаболизма, не оказывая антагонистического воздействия. Наличие у этих микроорганизмов предпосылок к симбиотическому сосуществованию позволяет выращивать их биомассу, используемую для приготовления заквасок в одной ферментации, что повышает его экономическую эффективность.

Пример 1, Предложенный нами штамм . целлюлолитических бактерий

В.acidocaldarius 17 и штамм-прототип

Celiulomonas flavigena 22 выращивали в лаборэторном ферментере с рабочим объемом

2 л На видоизмененной среде Гетчинсона (г/л): ИайОз 2,0; К2НРО4 1.0; MgS04 0,3;

NaCI 1,0; дрожжевой автолизаг 1.0; глюкоза

1799:395 полученных образцах силоса показало, что при использовании предложенного штамма . бактерий B.acidocaldarius 17 процесс деструкции их происходит глубже. Так, содержание целлюлозы снизилось íà 10%, тогда как в случае С.flavigena на 8,5%.

Поскольку гидролиз трудногидролизуемых полисахаридов осуществляется с помощью ЦЛБ, способствуя улучшению

10 г. Культивирование осуществляли с перемешиванием при 32 С, рН вЂ” 6-7.

Удельная скорость роста

В.acidocaldarius составила 0,42 ч

-1

С.flavigena — 0,10 ч . Стационарная фаза 5

-1 роста у первого штамма наблюдается через

17 ч культивирования, максимальный синтез ферментов целлюлозного комплекса— через 24 ч. Количество биомассы составила

4,1 г/л, экономический коэффициент пере- 10 работки субстрата 0,51, продуктивность

1 72 г/л в час, Время генерации 1 ч 39 мин, Время культивирования СЛ ач»оепа до начала стационарной фазы составляет 6 ч, накопление биомассы 3,6 г/л, экономиче- 15 ский коэфф. циент переработки субстрата

0,40, продуктивность 0,36 г/л в час, время генерации 6 ч.56 мин.

С помощью того и другого штаммов целлюлолитических бактерий была проведена 20 твердофаэная ферментация пшеничной соломы, Солому измельчают до размера 3-10 см, Применяется обычная технология силосования кормов. Осуществляется послойное ув- 25 лажнение соломы водным раствором до влажности ее 65%. Раствор равномерно раэбрызгивается по всей поверхности силосуемой массы из цистерны с помощью насоса.через шланг с распылителем на конце. 30

Рабочий раствор состоит из закваски ЦЛ Б и

АМС (1:1) из расчета 3 г сухого препарата титр 10 клеток в мл на 1 т соломы в 1,0% поваренной соли. После тщательной трам. бовки трактором, траншея герметически за- 35 . крывается пленкой, Анализ полученного продукта провОдили через 30 дней. Органолептические показатели того и другою силоса хорошие, При использовании .В.acidocaldarius 17 силос 40 имеет запах хлебной опары, при силосовании С,flavigena 22 — квэшенных овощей, рН в том и другом случае 4,3 — 4,4, сумма органических кислот 1,6 г/кг, Таким образом, можно сделать вывод о том, что 45 органолептические показатели, определяющие поедаемость силоса при использовании различных целлюлолитических бактерий практически не различаются. Определение количества трудногидролизуе- 50 мых полисахаридов (целлюлозы) в перевэримости корма, следует пГ»иэнэт». преимущество заявляемого штамма над штаммом-прототипом.

Пример 2. Как показали наши ранее приведенные исследования, благоприятное влияние на развитие С.flavigena 22 оказывает штамм молочнокислых бактерий

1 .pentoaceticum В(б)-23. Рост В.acidocaldarius

17 стимулируется другим штаммом молочнокислых бактерий Str. lactis diastaticus. Проведена твердофазная ферментация пшеничной соломы с использованием отобранных смешанных культур целлюлолитических и молочнокисг»ь»х бактерий.

Культуры были выращены в лабораторных условиях (см. пример 1) и перед применением целлюлолитические бактерии смешаны с молочнокислыми в соотношении

1 1.

Полученные результаты показали, что при применении смешанных культур целлюлолитических и молочнокислых бактерий в том и другом варианте для силосования соломы полученный продукт незначительно отличается от силоса, приготовленного с заквасками из монокультур целлюлолитических бактерий, 8 нем определяется лишь немного больше молочной кислоты (на 0,1-.

0,2% в зависимости от варианта опыта) и несколько меньшее количество связанной масляной кислоты, По-видимому, при использовании монокультуры целлюлолитических бактерий органические кислоты продуцируются представителями спонтанной молочнокислой флоры в изобилии встречающейся в доброкачественной соломе. Для подтверждения этого предположения в следующей серии опытов силосовэли пшеничную солому, предварительно подвергнутую щелочной предобрэботке, которая с одной стороны способствует делигнификации ее, а с другой убивает спонтанную микрофлору (табл.2). Полученные данные показали, что использование в этом случае монокультуры целлюлолитических бактерий приводит.к получению продукта с отрицательными органолептическими показателями (неприятный запах и вкус), который не поедается животными. Кроме того, в щелочных условиях при этом возможно разв»:тие гнилостной микрофлоры. Показано, что для получения полноценного продукта из предобработанной щелочью соломы необходимо введение в состав закваски молочнокислых бактерий, В результате их развития накапливаются молочная и уксусная кислоты, снижающие рН среды и обеспечивающие консервируемость продукта, а также улучшающие органолептические показатели.

1799395 через 24 ч культивирования. При рг(6.0 и температуре 50 С активность эндоклюкэнэзы (КМЦэзы) достигается 140 мг РВ/мл, эктивность нэ фильтровэльной бумаге(АФБ)—

9 мг РВ/мл, целлобиэзы — 3 мг глюк/мл.

Полученные в промышленных ферментерэх (СНОПБ ПО "Прогресс" ) опытные пэртии, закваски (сухэя и пэстообрэзнэя)

В.acidocaldarius (Кэльдэрин) имеет следующую характеристику

Приведенные результаты позволяют сделать заключение о том, что для обеспечения нужной направленности процесса в случэе использовэния для биоконверсии нестандартного сырья необходимо введение в 5 состав закваски помимо целлюлолитических также и молочнокислых бактерий, Приведенные ниже данные позволяют сделать заключение о преимуществе смешэнной культуры ЦЛБ и АМС. 10

Словообразование

Через. 60 дней

60-80 С

Терноустойчивость рН-устойчивость

Скорость роста

Зкономичвскнй козффициент переработки субстрата глюкоза 0 51 крахмал 0,40

0,40

0,26

Ra-карбокснлметилцеллюлоза

0,21

0,32

Способность сбраю ватьг пентозы (ксилозу и арабинозу) Сбраиивают

Не сбратаевают

Активность ферментов целлюлозного измплексл: зндоглюканаза (КНЦаза) 3„0-4,0 ед/нл

140 w РО/мл - 13,1 ед/мп на фильтровальн и бумаге

9 иг РЗ/мл - 0,83 вд/мл 1 мг глюк,/мл - 0,28 ад/нл целгобиаза

Лзтреь есть в факторах роста

Онотин, тнамик

Не нуидается

П р и м в р 3, Биомасса С.fiavlgena Культура однородная, чистая, представ(прототип), выращенная нэ опытно-про- лена наличием грэмположительных паломышленнойустэновкеинститутэ,титрее0,2 чек, в нэчэле стационарной фазы роста млрд.кл/ г. Микроскопировэние и высевы 15 нэблюдэется появление единичных спор. культуры нэ питательные среды показало Целлюлолитическэя активность обнарувысокую полиморфность ее. Клетки пред- жена кэк при наличии в среде целлюлозосо стэвляют собой смесь кокков и палочек держащих источников углерода, тэк и грэмположительных и грэмотрицэтельных, 1„умоносэхэров. Конститутивныйтип ферменЦеллюлолитичеакую активность получен- 20 тэ у В.acidocaldarlus позволяет в отличие от ной биомассы трудно контролировать, т,к. прототипа получить активную биомассу нэ для проявления ее в составе среды необхо- любом утилизируемом субстрэте. димо иметь индуктор (источник целлюлозы), Таким обрэзом, предложенный штэмм который вызывает более низкую скорость целлюлолитических бактерий роста культуры, но обеспечивэет синтез 25 B,acldocaidarius 17 отличэется от известнокомплекса целлюлаз. По этой причине био- го более высокой технологичностью, что помасса СЛ!эч!оепэ,полученнэя нэсредэх,со- зволяет успешно испольэовать .его для держащих в качестве источника углерода стабильного производства зэквэсок,. обеслегкоусвояемые сахара зачастую имеют печивэющих высокое качество получаемого очень низкую целлюлолитическую актив- 30 кормового продуктэ, ность или не имеют вообще. Формула изобретения

При культивировании B.acidocaldarius Штамм бактерий Bacillus acidocaldarius нэ среде, описанной выше, максимальная ВКПМ В-5250, используемый для силосовэцеллюлолитическэя активность отмечается ния соломы.

Таблица1

Сравнительная характеристика производственно-ценьых свойств предлагаемого штамма бактерий и штамма прототипа

Показатели Штанин

Нзрфоло гни Неполинорф ый, граи- Полиморфнй, смесь полоиительнюе палоч- грамполоиительных и ки размером 0,8х3,5 икм грамотрнцательных клеток, палочкоеидная

0,5х2 мкм

Слоговые Неспоровые

Пересев Через 20 дней

35 С

4,0-8,5

Время культивирования 96 часов ,0,1

1799395

Таблицэ2

Таблица3

Характеристика опытных партий закваски

Составитель М.Саубенова

Техред M.Моргентал Корректор: М.Демчик

Редактор А.Хода кова

Заказ 789 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113О35, Москва, Ж-35, Раушская. наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Показатели биохимического анализа силоса из нативной пшеничной соломы иизпредобработанной О, 5 раствором шелочи