Штамм гриба tolypocladium inflatum subsp. blastosporum - продуцент циклоспорина а и способ биосинтеза циклоспорина а

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Штамм Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum 1069 получен путем селекции и депонирован под номером ВНИИА N 319А. Для реализации способа кроме штамма 1069 используют штаммы ВНИИА N 331А или ВНИИА N 330А. Продуцент выращивают в посевной среде следующего состава, мас.%: соевая мука 2 - 3, глицерин 2,5 - 3,5, меласса 2,0 - 2,5, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,3 - 0,6, натрий хлористый 0,3 - 0,6, вода - остальное, рН среды 6,5 - 6,7. Полученный мицелий используют в качестве инокулята при биосинтезе. Для ферментации, проводимой в условиях аэрации и перемешивания при температуре 23 - 25oС, используют ферментационную среду следующего состава, мас.%: меласса 12 - 20; глицерин 0,5 - 1,5; источник органического азота 0,4 - 1,5 (в качестве которого используют БВК 0,4 - 0,8 мас.%, соевую муку 0,5 - 1,5 мас. %, кукурузный экстракт 0,5 - 1,0 мас.% или их смесь общей концентрации 0,8 - 1,5 мас. %); калий фосфорнокислый однозамещенный или аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,5 - 0,8; кобальт хлористый 0,0003 - 0,0006, вода - остальное, рН среды 6,0 - 6,5. Активность культуральной жидкости при использовании штамма 319А 750 - 800 мкг/мл, штамма 330А 550 - 800 мкг/мл, штамма 331А 120 - 600 мкг/мл. 2 с. и 2 з. п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретения повышение выхода целевого продукта. Штамм Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum N 1069 получен в результате последовательных мутагенных воздействий УФ-лучами с последующим отбором активных вариантов исходного штамма N 2223, Штамм N 1069 депонирован под номером ВНИИА N 319А и характеризуется следующими признаками. Культурально-морфологические признаки. Хорошо развивается на большинстве агаризованных сред, образуя колонии размером 4-15 мм песочно-кремового цвета. Колонии неправильной формы, сильно складчатые, медленно покрывающиеся спорообразующим слоем белого цвета. На наиболее типовой среде с 2% солодового экстракта штамм через 14 суток роста при 24оС образует колонии диаметром 10-12 мм, приподнятые, кремовые, слабо опущенные, с приподнятым краем, неправильно-складчатые. Характерен землистый запах. В процессе развития у штамма почти не образуется типичного нитевидного мицелия, он фрагментируется и представлен, в основном, цепочками бластоспор. Мутовки встречаются редко. Бластоспоры прорастают короткой гифой, на которой образуются фиалиды со сферическими спорами, собранными в рыхлые головки. Часто мицелиальная стадия редуцирована, и в этом случае на бластоспоре сразу образуется фиалида с рыхлой головкой спор. Конидии шаровидные, соединенные в рыхлую головку. Хламидоспоры отсутствуют. На границе агара и воздуха бластоспоры прорастают типичным вытянутым конидиофором. Солодовый агар. Рост хороший, колонии 10-12 мм, приподнятые, кремовые, слабо опушенные, с неровным краем, неправильно-складчатые, диффузного пигмента не образуют. Среда N 6 с кукурузным экстрактом. Рост умеренный, колонии 7-9 мм, беловатые, мучнистые с неровным краем, кремовые диффузного пигмента не образуют. Гаузе 2. Рост хороший, колонии 10 мм, кремовые, сильно выпуклые с обрубленным краем, складчатые. Агар с тирозином. Рост хороший, колонии 10-11 мм, белые изрытые, с ровным краем, с обратной стороны желтые. Агар глюкозодрожжевой. Рост обильный, колонии 15 мм, белые, слабо опущенные, с приподнятым центром и неровным крем, кремовые. Агар овсяный. Рост умеренный, колонии 7 мм, белые слабо опушенные, с ровным краем, обратная сторона желтая. Агар Райстрик. Рост обильный, колонии 10 мм, белые, мучнистые, высоко приподнятые, с неровным краем, обратная сторона желтая, складчатая. Агар Чапекa с глюкозой. Рост обильный, колонии 10-12 мм, белые, плоские, с неровной поверхностью, обратная сторона желтая. Агар Ваксмана. Рост умеренный, колонии 7-10 мм, белые, приподнятые, с неровным краем, обратная сторон желтая. Агар глюкозоаспрагиновый. Рост умеренный, колонии 7 мм, белые, приподнятые, с неровным краем, обратная сторона кремовая. Агар Гaузе 1. Рост хороший, колонии 8 мм, беловатые, слабо опушенные, с ровным краем, обратная сторона белая. Агар крахмальный. Рост слабый, колонии 4 мм, белесые, слабо ростущие. Агар СР-1 с глюкозой. Рост обильный, колонии 10-12 мм, кремово-белые приподнятые, с неровным краем, обратная сторона желтая. Физиологические признаки. Аэроб. Максимум роста при 24-26оС. Молоко коагулирует, крахмал гидролизует очень слабо, желатин разжижает. Гетеротроф и прототроф. Хорошо растет в присутствии глюкозы, ксилозы, маннита, сорбита, усваивает арабинозу и мальтозу, слабо усваивает сахарозу, гелактозу, раффинозу и не усваивает лактозу и рамнозу. Штамм хранится на скошенных агаризованных средах при 5оС в течение 6 месяцев. Антагонистические свойства. Штамм N 1069 при культивировании в жидкой питательной среде в колбах на качалках или в ферментерах образует антигибридной антибиотик в количестве до 800 мкг/мл, спектр действия которого приведен в табл. 1. П р и м е р 1. Агаровым блоком 15-20-суточной культуры Tolypocladium inflatum subsp, blastosporum N 1069, выращенной на среде Райстрик при 24оС, засевют посевную среду следующего состава, мас. Соевая мука 3,0 Глицерин 3,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,6 Натрий хлористый 0,6 Меласса 2,5 Вода Остальное pH 6,5 Объем среды в колбах 50 мл. Выращивание проводят в колбах на качалках при 240 об/мин и при 24оС в течение 48 ч. Мицелий из маточной колбы переносят в посевные колбы, содержащие 100 мл среды указанного состава. Культивирование в посевных колбах ведут также, как и в маточных. Мицелий из посевных колб используют в качестве инокулята при биосинтезе циклоспорина в колбах на качалках. Количество вносимого посевного материал 10% Для ферментации используют среду следующего состав, мас. Меласса 14 БВК 0,6 Глицерин 1,0 Аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,6 Кобальт хлористый 0,0004 Вода Остальное pH 6,5. Ферментацию продолжают 6 сут. Наполнение среды в колбах 50 мл. Рост при 24оС на качалках при 240 об/мин. Активность культуральной жидкости при этом составляет до 800 мкг/мл. П р и м е р 2. Биосинтез циклоспорина А ведут, как в примере 1, с использованием посевной среды следующего состава Вариант А, мас. Меласса 12-20 Глицерин 0,5-1,5 БВК 0,4-0,8 Аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,5-0,8 Кобальт хлористый 0,0003-0,0006 Вода Остальное pH 0,6-6,5 Соевая мука 2,0 Глицерин 2,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,3 Натрий хлористый 0,3 Меласса 2,0 Вода Остальное pH 6,7 состав ферментационный среды, как в примере 1. Активность культуральной жидкости через 6 суток культивирования составляет 800 мкг/мл. П р и м е р 3. Биосинтез циклоспорина А ведут, как в примере 1, с использованием посевной среды, как в примере 1, и ферментационной среды следующего состава, мас. Меласса 12 Глицерин 0,5 БВК 0,4 Аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,5 Кобальт хлористый 0,003 Вода Остальное Ферментация ведется, как в примере 1, активность культуральной жидкости 750 мкг/мл. П р и м е р 4. Биосинтез проводят, как в примере 1, но с использованием штамма 392, ВНИИА N 331А, полученного параллельно со штаммом 1069. Активность культуральной жидкости в конце ферментации 600 мкг/мл. П р и м е р 5. Биосинтез ведут, как в примере 1, но c использованием штамма 106 ВНИИА N 330А. Активность культуральной жидкости в конце ферментации 700 мкг/мл. П р и м е р 6. Биосинтез циклоспорина А ведут, как в примере 1, с использованием различных штаммов и следующих вариантов ферментационных сред: Вариант А1: все компоненты среды в минимальных концентрациях. Вариант А2: все компоненты среды в оптимальных концентрациях. Вариант А3: все компоненты среды в максимальных концентрациях. Вариант Б, мас. Меласса 12-20 Глицерин 0,5-1,5 Соевая мука 0,5-1,5 Аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,5-0,8 Кобальт хлористый 0,0003-0,0006 Вода Остальное pH 6,0-6,5 Вариант В, мас. Меласса 12-20 Глицерин 0,5-1,5 Кукурузный экстракт 0,5-1,5 Аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,5-0,8 Кобальт хлористый 0,0003-0,0006 Вода Остальное pH 6,0-6,5 Вариант Г, мас. Меласса 12-20 Глицерин 0,5-1,5 БВК+соевая мука 0,3-0,5+0,3-1 +кукурузный экстракт 0,3-0,8 (общее содержание 1,0-1,5) Аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,5-0,8 Кобальт хлористый 0,0003-0,0006 Вода Остальное pH 6,0-6,5 Результаты представлены в табл. 2 П р и м е р 7. Биосинтез циклоспорина А ведут, как в примере 1, с варьированием температуры. Результаты приведены в табл. 3. Использование изобретения позволяет повысить выход антибиотика циклоспорина А. Вариант Б1: все компоненты среды в минимальных концентрациях. Вариант Б2: все компоненты среды в оптимальных концентрациях. Вариант Б3: все компоненты среды в максимальных концентрациях. Вариант В1: все компоненты среды в минимальных концентрациях. Вариант В2: все компоненты среды в оптимальных концентрациях. Вариант В3: все компоненты среды в максимальных концентрациях. Вариант Г1: все компоненты среды в минимальных концентрациях. Вариант Г2: все компоненты среды в оптимальных концентрациях. Вариант Г3: все компоненты среды в максимальных концентрациях.

Формула изобретения

1. Штамм гриба Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum ВНИИА N 319А - продуцент циклоспорина А. 2. Способ биосинтеза циклоспорина А путем выращивания продуцента Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum в посевной среде, содержащей источник углерода, источник азота, минеральные соли и воду, с последующей инокуляцией ферментационной среды, содержащей источник углерода, источник органического азота, соль фосфорной кислоты, соль соляной кислоты и воду, и проведением процесса ферментации в условиях аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, посевная среда в качестве источника углерода содержит глицерин и мелассу, в качестве источника азота - соевую муку, в качестве минеральных солей - калий фосфорнокислый однозамещенный и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%: Соевая мука - 2 - 3 Глицерин - 2,5 - 3,5 Меласса - 2,0 - 2,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,3 - 0,6 Натрий хлористый - 0,3 - 0,6 Вода - Остальное а ферментационная среда содержит в качестве источника углерода мелассу и глицерин, в качестве соли фосфорной кислоты она содержит калий фосфорнокислый однозамешенный или аммоний фосфорнокислый двузамещенный, в качестве соли соляной кислоты - кобальт хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%: Меласса - 12 - 20 Глицерин - 0,5 - 1,5 Источник органического азота - 0,4 - 1,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный или аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 0,5 - 0,8 Кобальт хлористый - 0,0003 - 0,0006 Вода - Остальное а процесс ферментации ведут при температуре 23 - 25oС. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum ВНИИА N 319А, ВНИИА N 331А или ВНИИА N 330А. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве источника органического азота ферментационная среда содержит БВК в концентрации 0,4 - 0,8 мас. %, или соевую муку 0,5 - 1,5 мас.%, или кукурузный экстракт 0,5 - 1,0 мас.%, или их смесь общей концентрации 0,8 - 1,5 мас.%.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2