Способ получения о-ацилированных глюкозаминогликанов

Способ получения о-ацилированных глюкозаминогликанов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: в медицине. Сущность изобретения: -о-ацилированные глюкозаминогликаны получают ацилированием глюкозаминогликанов в виде триили тетрабутиламмониевых солей ангидридами карбоновых кислот при комнатной температуре , в полярном органическом растворителе в присутствии акцептора кислоты с последующей очисткой целевых продуктов. Акцептор кислоты - пиридин, диметиламинопиридин, триэтиламин и трибутиламин. После ацилирования продукты осаждают с помощью раствора ацетата натрия в этаноле , осадок растворяют в воде, и раствор диализуют против воды. Диализ осуществляют в присутствии слабого основания. 3 з.п,ф-лы, 8 табл., 8 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4614804/05 (22) 21.07.89 (46) 30.07.93. Бюл. М 28 (31) 8809885 (32) 21,07.88 (33) FR (71) Санофи (FR) (72) Морис Петиту и Жан Шоай (FR) (56) Патент США 1Ф 4692435, кл, С 08 В 37/10, 1987.

ЕР 37319, кл, С 08 В 37/10, 1981.

Патент США гк 4686288, кл. С 08 В 37/10, 1987..

ЕP 244235, кл. С 08 В 37/10, 1987.

EP 244236, кл. С 08 В 37/10, 1987

ЕР 40144, кл. С 08 В 37/10, 1981.

ЕР 121067, кл. С 08 В 37/10, 1984, Патент США М 4281 1.08, кл. С 08 В 37/10, 1981.

Патент Франции М 2159724, . кл, С 08 В 37/10, 1987.

EP 2 15453, кл, С 08 В 37/10, 1987.

EP 44228, кл. С 08 В 37/10, 1982.

Патент Франции % 2100735, кл. С 08 В 37/08, 1987.

EP 256880, кл. С 08 В 37/10, 1988.

Изобретение относится к получению биологически активных полисахаридов, которые могут быть использованы в медицине.

Под термином "глюкозаминогликан" понимают вещества. образованные последовательностями уроновых кислот(0-глюкуроновая кислота или L-идуроновая кислота) и аминосахаров, причем эти последние представляют собой глюкозамины или галактазамины.

„„5Q 1831487 А3 (я)ю С 08 В 37/10, А 61 К 31/725 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-АЦИЛИРОВАННЫХ ГЛЮКОЗАМИНОГЛИКАНОВ (57) Использование: в медицине. Сущность, изобретения: -о-ацилированные глюкозаминогликаны получают ацилированием глюкозаминогликанов в виде три- или тетрабутиламмониевых солей ангидридами карбоновых кислот при комнатной температуре, в полярном органическом растворителе в. присутствии акцептора кислоты с последующей очисткой целевых продуктов.

Акцептор кислоты — пиридин, диметиламинопиридин, триэтиламин и трибутиламин.

После ацилирования продукты осаждают с помощью раствора ацетата натрия в этаноле, осадок растворяют в воде, и раствор диализуют против воды. Диализ осуществляют в присутствии слабого основания.

3 з.п.ф-лы, 8 табл., 8 ил.

Глю коза мино гл ика н ы и риродного и роисхождения образованы более или менее однородными смесями последовательно соединенных дисахаридных единиц: образованных уроновой субъединицей (глюкороновая кислота или идуроновая кислота) и озаминной субъединицей (глюкозамин или галактозамин), объединенных связью 1 - 4 или 1 -"3;

В глюкозаминдиканах гидроксильные группы по разному замещены функциональ1&31487 сн2Он

О- (A) в известных случаях 2-сульфатированной;

50 — метод окислительной деполимеризации(7, 8), который разрезает молекулу путем окисления, сохраняя "природные" окончания.

Другие гепарины н.м.в., которые имеют

55 молекулярное распределение, отличающееся от тэкового природного гепэрина, обладают особыми биологическими свойствами, могут быть получены иодным окислением природного гепарина, с последующей депоными группами, в особенности сульфатными группами, причем амино-группы озаминов замещены сульфатными и/или ацетильными группами..

Глюкозаминогликаны, рассматриваемые здесь, включают 6 типов продукта: гепарин, гепарин-сульфат, хондроитинсульфат А, хондроитин-сульфат С, хондроитинсульфат В, более точно называемый дерматан-сульфат, и гиалуроновая кислота.

Они характеризуются двумя следующими основными дисахаридными структурами (А) и (В); в которой R обозначает группу 30з и/или ацетильную группу и знак указывает, что карбоксильная группа может быть ниже плоскости цикла (идуроновое звено) или выше плоскости цикла (глюкуроновое звено), и

Глюкозаминликаны, обладающие основной структурой (А), представленной выше, называют глюкоэаминогликанами (или

GAGS) гепаринового типа и включают гепэрины и гепарин-сульфаты, а глюкозаминогликаны, имеющие структуру основания (В), представленную выше, называют GAGS типа хондроитин-сульфата и включают хондроитин-сульфаты А и С и дерматан-сульфат.

Гиалуроновэя кислота имеет основную структуру (В), в которой галактоэамин заменен на глюкозамин.

Кэк указано выше, как в GAGS гепаринового типа, так и в GAGS типах хондроитин-сульфата, более или менее высокое процентное содержание гидроксильных групп в "и" дисахаридных единицах находится в форме сложных эфиров серной кислоты.

Так, гепарин может быть представлен основной структурой (А), указанной выше, в которой "и" может изменяться от 1 до 80..R в большинстве "и" единиц обозначает группу 80з, и, в остальных случаях, ацетильную группу; группы OH в положении 6 глюкоээмина и в положении 2 уроновой кислоты в большинстве случаев сульфатированы, тогда как группа ОН в положении 3 глюкозами5

30 нэ сульфатирована только в меньшинстве случаев; ОН в положении 3 уроновой кислоты практически не сульфатирована, причем вышеуказанная уроновая кислота в большинстве случаев представляет собой идуроновую кислоту.

Продукты, имеющие основную структуру (А), включают также N-десульфатированный N-ацетилированный гепарин. Этот гепарин представлен формулой (А), в которой R обозначает ацетильную группу.

Гепарин также содержит формы, имеющие структуру (А), с "и" изменяющимся от 3 до 15; и тот же самый химический профиль, Вышеуказанные формы могут быть выделены фракционно согласно известным методам и называются гепаринами низкого молекулярного веса (н.м.в.).

Гепарины н.м.в„имеющие молекулярное распределение и обладающие биологическими свойствами, по существу идентичны таковым гепаринов н.м.в., получаемыми путем фракционирования, могут быть получены фрагментацией гепаринэ согласно следующим методам: — метод азотистокислой деполимеризации и восстановления (2, 3), который разрезает молекулу, атакуя субьединицы глюкоэамин-N-сульфата, чтобы дать концевой 2,5-ангидроманнитол: сн,сн сн он в известных случаях сульфатированных

h0 первичной гидроксильной группе в положении 6. — метод ферментативной деголимеризации (4, 5) или щелочной деполимеризации (6), который разрезает молекулу, атакуя уроновые субъединицы, чтобы дать окончание в виде а, Р-ненасыщенной уроновой кислоты: СОО

1831487

СОО

15

30

40

О (cl

55 лимеризацией, путем /3-элимирования или кислотного гидролиза, Иодное окисление разрезает несульфатированные звенья урановой кислоты между углеродами в положении 2 и 3. Известно, что такие звенья присутствуют в участке связи с антитромбином lit (AT ill), плазматическом ингибиторе коагуляции различных серин-протеаз, и активность которых сильно увеличивается за счет гепарина, действующего как кофактор, Иодное окисление, следовательно, позволяет получать продукты, лишенные участка связи с AT ill, и, следовательно, по существу лишенные антикоагулирующей активности.

Гепарины н.м.в. этого типа могут быть получены в особенности при осуществлении способа, включающего следующие стадии: — осторожное окисление гепарина, реализуемое путем введения в реакцию гепарина, в виде водного раствора с конечной концентрацией 0,5-5 (вес/объем), с солью . иодной кислоты при конечной концентрации 0,5-1 (eec/объем), при рН, равном

4,5 — 6 5, предпочтительно при рН 5, при температуре 0-10 С, в течение 15 — 48 часов, в отсутствие света; — деполимеризация полученных гепариновых цепей путем присоединения сильного основания, такого как гидроксид натрия при рН выше примерно 11, а именно от 11 до 12, предпочтительно при 11,2-.11,6, предпочтительно вблизи 11,5; — восстановление фрагментов деполяризации с помощью восстановителя и, после удаления, в желательном случае, восстановителя, который не прореагировал; — рекуперация восстановленных фраг. ментов гепарина путем осаждения с помощью растворителя, в котором они нерастворимы; — выделение искомых фрагментов путем фракционирования с помощью спирта, в присутствии неорганической соли, полученного водного раствора; снова растворяя в воде, выделенный ранее осадок, и рекуперируя образовавшийся осадок.

Эти гепарины н.м.в. отвечают формуле (С) сн,он

3 NHQ в которой "и" может изменяться от 6 до 15;

R по.крайней мере в 90;ь "и" единиц представляет собой группу 50з, и, в остальных случаях, ацетильную группу, причем группы

ОН в положении 3 глюкоэамина могут быть сульфатированы, а группы 0Н в положении

6 глюкозамина сульфатированы на 70 . Более того, по 1 звену на 2 цепи по крайней мере этого гепарина н.м.в. имеют замену идуроноаой кислоты на звено уроновой кислоты (D-глюкуроновой или 1=идуроновой), не сульфатированной, раскрытой между углеродами в положениях 2 и 3, следующей формулы:

Такие гепарины н.м.в. могут быть еще фракционированы гель-фильтрацией согласно известным способам, чтобы получить смеси фар фрагментов, однородных с точки зрения их молекулярной массы, лишенные участка связи с AT И1.

20 Другие глюкозаминогликаны гепариноваго типа образованы GAGS формулы(А) или (С), в которых карбоксильная функция урановой кислоты этерифицирована, например, путем конденсации со спиртом в присутствии агента конденсации карбодимидного типа (9) или путем алкилирования карбоксила с помощью алкилгалогенида в присутствии слабого основания, Точно также, глюкозаминогликаны типа хондроитин-сульфата образованы глюкозамингликанами формулы (8), в которых карбоксильные функции урановых кислот этерифицированы, например, путем алкилирования карбоксила с помощью алкилгалогенида в присутствии слабого основания, Такие сложные эфиры для гиалуроновой кислоты получают путем обработки гиалуроновой кислоты в форме соли четвертичного аммония спиртом в присутствии катализатора или этерифицирующего (превращающего в простой эфир).агента (10), Гепаргн-сульфат представлен вышеприведенной формулой (А), в которой "и" может изменяться от 1 до 80, R обозначает в большинстве видов ацетильную группу и в меньшинстве видов группу S з. Кроме того, в преобладающем большинстве форм, группы ОН в положении 6 глюкозамина сульфатированы, причем урановая кислота в большинстве форм представляет собой глюкуроновую кислоту.

Хондроитин-сульфаты А и С представлены вышеприведенной формулой (В), в которой "и" изменяется от 1 до 80, соответственно, группы 4-0Н и 6-0Н глюкозамина сульфатированы, причем уроновая кислота в большинстве форм представляет собой глюкуроновую кислоты.

Дерматан-сульфат имеет структуру, по существу идентичную таковой хондроитин7

1831487 сульфата А, но субъединица уроновой кислоты представляет собой идуроновую кислоту в большинстве случаев.

Фрагменты дерматан-сульфата, отвечающие вышеприведенной формуле (В), в которой "и" может изменяться от 1 до 20, могут быть получены иодным окислением с последующим восстановлением боргидридом натрия и кислотным гидролизом, как описано у FRAN.

Глюкозаминогликаны обладают многочисленными биологическими активностями, среди которых можно назвать их активности по отношению к факторам коагуляции, которые могут осуществляться через посредство различных плазматических протеинов. В том, что касается гепарина, также из литературы известно, что гепарин или некоторые из его.производных, обладающие или нет антикоагулирующей активностью, могут иметь регуляционную активность пролиферации гладких мышечных клеток сосудистой стенки или еще ингибирующую активность гепараназы, фермента, принимающего участие в механизмах метастазного распространения. Кроме того, глюкозамингликаны составляют часть более широкого семейства сульфатированных полисахаридов, причем некоторые в более или менее значительной степени обладают противовирусной активностью и в особенности анти-NH-активностью (вирус человеческого иммунодефицита) ВАВА и др.

В нижеследующем тексте используется термин GAGS для обозначения глюкозаминогликана. который либо имеет природную структуру, такую, которая получается зкстракцией, полусинтетическую или синтетическую, либо имеет химически мо..дифицированную структуру на функциональных карбоксильных или аминогруппах, сначала по реакции ацилирования, дающей

GAGS, селективно О-ацилированные.

Несмотря на большой интерес к их фармакологическим активностям. природные

GAGS обладают тем недостатком, что имеют относительно короткий период полураспада, что приводит к необходимости повторных введений. Этот недостаток отчасти временно сглаживается за счет использования, для предохранения и лечения венозных тромбоэов, производных гепарина незначительной молекулярной массы, подкожно. уменьшая таким образом частоту введения инъекций в день.

Тем не менее, большой интерес представляет воэможность иметь в распоряжении производные, обладающие пролонгирующим действием, что позволяет еще снижать частоту введения этих продуктов, увеличивая продолжительность их действия.

Также может представлять большой интерес располагать пролонгированными, не5 антикоагулирующими производными, такими, как производные N-десульфатированного N-ацетилированного гепарина, активность которых как ингибитора гепараназы, фермента, вовлекаемого в метастаз10 ные явления распределения, оценивается очень высоко.

Известны многочисленные производные модифицированных глюкозаминогликанов, чтобы улучшить их фармакокинетику, 15 а именно сложные эфиры с карбоксильной функцией уроновых кислот или с гидроксильными функциями, В особенности используют частичную или полную этерификацию карбоксильных

20 функций гепарина, обрабатываемых в форме соли четвертичного аммония, в инертном растворителе. спиртом или галогенированным производным, в присутствии, в известных случаях, агента конденсации.

25 Производные гиалуровой кислоты, полученные этерификацией с помощью спирта в присутствии катализатора или путем реакции с этерифицирующим агентом до получения простого эфира, также описаны.

30 Кроме того, известны различные способы для этерификации GAGS no первичным и вторичным гидроксильным функциям.

Известен способ получения неполных гидролиэуемых эфиров гепарина и неток35: сичной органической кислоты, например, 4хлорфеноксиизомасляной, 4-хлорфеноксиуксусной, холиновой, никотиновой, пиридилуксусной и др.

При этом указанные соединения получа40 ют реакцией четвертичной соли гепарина с кислотой, активированной карбодиимидом.

Эта реакция дает не только о-ацилированное производное, но и вторичный стабильный продукт в виде сложноэфирного

45 о-ацилиэомочевинного производного. Кроме того условия реакции благоприятны для образования пангидридов и межмолекулярных реакций между кислотными и гидроксильными функциями гепарина, 50 Наиболее близким к предлагаемому является способ этерификации гепарина или низкомолекулярного гепарина воздействием хлорангидрида кислоты в формамиде в присутствии пиридина при температуре

55 40 С, втечение 3-4ч. Получаемые продукты обладают повышенной трансмембранной прони цаемостью.

По окончании реакции добавляется вода и осуществляется диалиэ против йаС! и воды, и последующая миофилиэация.

1831487

Недостатком этого способа является то, что получаемые продукты претерпевают частичную десульфатацию, Кроме того, они Ои N-ацилированы. В связи с этим соотношение групп сульфат/карбоксил в получаемом глюкозами нагл икане изменено.

По указанным причинам получить продукты, обладающие нужными и воспроизводимыми биологическими свойствами, известным способом нельзя.

Цель изобретения — обеспечение селективности. О-ацилирования и получение продуктов с воспроизводимыми биологическими свойствами.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения О-ацилированных глюкозаминогликанов, включающем обработку глюкозаминогликанов ацилирующими агентами в присутствии акцептора кислоты, в среде полярного органического растворителя, с последующей очисткой целевых продуктов, глюкозаминогликаны используют в виде три- или тетрабутиламмониевых солей, в качестве ацилирующих агентов применяют ангидриды карбонавых кислот, и обработку осуществляют при комнатной температуре, При этом в качестве акцептора кислоты используют одно.или несколько соединений, выбранных из группы, включающей пиридин, диметиламинопиридин, триэтиламин и трибутиламин, После ацилирования продукты могут быть осаждены с помощью раствора ацетата натрия в этаноле; осадок растворен в воде, а полученный раствор диализован против воды, Диализ может быть осуществлен в присутствии слабого основания, В частности, в качестве слабого основания может быть ис.пользован бикарбонат натрия.

Введением во взаимодействие растворимой в органической среде соли GAGS, такой, как соль третичного или четвертичного аммония, с ангидридом карбоновой кислоты в апратоннам полярном органическом растворителе, получают селективное ацилирование свободных гидраксидов, без изменения функциональных карбоксильных или аминных групп используемого GAGS. Ис-. пользование GAGS в форме растворимой в органической среде сали позволяет предпочтительно контролировать реакцию ацилиравания с большой точностью. Более того, степень ацилиравания легко модулируется и может быть увеличена, не вызывая при этом изменения остальной части молекулы. Особенна можно достигать степени ацилирования 0,1-3-ацильных групп на дисахаридную единицу, в особенности 0,5-2ацильные группы.

20. изводные гепарина, полученные либо путем

30 ции

35 учаемый путем синтеза, однородный в том, чта касается его молекулярной массы, а так45 когда эти участки разрушены, например, де50 полимеризацией периадатом с последуюния могут быть получены из соединений, 5S приготовленных па способу, использующему иодного окисление с последующим щелочным Р-злиминираванием, васстанов5

Найдено, что при этом не образуется низкое N-ацилированнае производное и что, когда ангидриды образуются на уровне карбоксильных функций, использование слабого основания позволяетлегка их снова превратить в свободную кислоту,, Предпочтительно, селективное ацилиравание GAGS согласно способу изобретения позволяет осуществлять модулиравание их биологических активностей, которые в некоторых случаях сильно увеличиваются.

Наконец, найдено, что О-ацилированные GAGS, полученные таким образом, обладают более проЛонгированной фармакологической активностью.

В предпочтительном способе изобретения, выбранные глюкозаминогликаны представляют собой глюкозаминагликаны гепаринового типа, а именна гепарин, профракцианирования, либо полусинтетическим или синтетическим путем; гепаринсульфат и его производные, полученные путем фракцианирования. полусинтетическим или синтетическим путем, Для получения cMecзй фрагментов гепарика, имеющих молекулярную массу ниже

10000 дальтанов, также можно использовать метод ферментативнай депалимеризаВ другом предпочтительном аспекте изобретения, можно использовать смесь фрагментов гепарина, однородных по их молекулярной массе; фрагмент гепарина, полже в тьм. что касается ега функционализации.

В другом интересном аспекте изобретения, в качестве глюказаминогликана можно выбирать производные гепарина, лишенные участков связи с антитрамбинам

1И (AT III), либо когда гепариновые цепи фракцианированы, чтобы удалить олигосахаридные цепи, включающие участок связи с AT III, прибегая, например, к афинной хроматографии на смоле Сефараза-АТ III или к ионоабменным хроматографиям, либо щим Pэлиминираванием или кислотным гидрол изом.

Особенно предпочтительные саединелением и фракционираванием.

Другими предпочтительными соединениям, отвечающими формуле VI, являются

1831487 смеси соединений, гомогенных по их молекулярной массе, получаемые путем гельфильтрации, в которых "и" обозначает целое число.2-12, Из соединений с гепариновой структурой, лишенных участка фиксации с AT III, и следовательно, лишенных антикоагулирующей активности, семейство предпочтительных соединений соответствует N-десульфатированным N-ацетилированным селективно 010 ацилированным.производным гепарина.

В другом предпочтительном аспекте изобретения, выбираются глюкоэамингликаны типа хондроитин-сульфата, а именно хлондроитин-4 и 6-сульфаты, дерматансульфат, и их фрагменты.

Способ настоящего изобретения отли. чается тем, что глюкозаминогликаны превращают в растворимую в органической

20 среде соль и эту соль обрабатывают ацилирующим агентом, способным селективно ацилировать первичные и вторичные гидроксильные группы этого глюкозаминогликана, не затрагивая функциональные группы

NHRz, или COOR; присутствующие в этом 25 глюкозаминогликане до реакции ацилирОвания, причем реакция осуществляется в апротонном полярном растворителе в присутствии катализатора и в присутствии основания, способного улавливать выделяющуюся

30 бавлять добавку, благоприятствующую осаждению, такую как минеральную соль, О-Ацилированный глюкозаминогликан выделяют путем растворения в воде осадка и

40 предпочтительно диалиэиравания в присутствии слабого основания, Предпочтительно, способ изобретения . осуществляется согласно следующим стади- ям: (1) Гл окозаминогликан предотвращают 45 в соль вышеуказанного глюкозаминогликана, растворимую в апротонном полярном органическом растворителе; . (2) эту соль обрабатывают ангидридом формулы: ацил-О-ацил, в вышеуказанном апротонном полярном органическом растворителе, в присутствии каталитических количеств пиридина, диметиламинопиридина, или триэтиламина или трибутиламина, (3) таким образом полученный продукт осаждают воздействием раствора ацетата натрия в этанола; и (4) селектиено-0-ацилированный глюкоэаминогликан выделяют путем растворения во время ацилирования кислоту, при комнатной температуре.

Продукт затем осаждают. с помощью смешивающегося с водой растворителя, такого как этанол, к которому можно до- 38 в воде таким образом полученного осадка и путем диализа в присутствии слабого основания, и в известных случаях натриевую соль таким образом полученного селективно 0-ацилированного глюкозаминогликана превращают в другую фармацевтическую совместимую. соль.

8 предпочтительном аспекте способа .изобретения, используемый в стадии (1) глюкоэаминогликан. выбирается в группе, образованной. гепарином, смесью фрагментов гепарина„имеющих молекулярную массу ниже 10000 дальтонов, смесью фрагментов гепарина,. имеющих среднюю моле-. кулярную массу 2000-7000 дальтонов, смесью фрагментов гепарина, имеющих среднюю молекулярную массу около 4500 дальтонов, смесью фрагментов гепарина, имеющих среднюю молекулярную массу около 2500 дальтонов, смесью фрагментов гепарина, гомогенных по своей молекулярной массе: фрагментом гепарина, полученным путем синтеза, гомогенным в том, что касается.его молекулярной массы, и в том, что касается.его функционалиэации.

8 другом предпочтительном аспекте способа изобретения, используемым в стадии (1) глюкоэаминогликаном является гепарин, фракция или фрагмент гепарина, лишенные участка связи с антитромбином

И!.

Глюкозаминогликан, используемый в стадии (1} способа изобретения, предпочтительно может быть еще выбран в группе, образованной дерматансульфатом и его фрагментами, или 4- и 6-сульфат-хондроитинами и их фрагментами, Предпочтительно. соль глюкозаминогликана, используемая в стадии (1), способа изобретения, представляет собой соль третичного амина соль трибутиламмония, или соль четвертичного аммония соль тетрабу.тиламмомия, 8 другом предпочтительном аспекте способа изобретения, используемым в стадии (2) ангидридом. является ангидрид алкановой кислоты, содержащей 2-10 С-атомов, предпочтительно. 4-10, особенно 4 или 6

С-атомов. Апротонный полярный растворитель, в котором осуществляется стадия (2) способа изобретения, предпочтительно может быть выбран иэ группы, включающей диметилформамид, гексаметилфосфортриамид, пиридин, или еще смесь этих растворителей друг с другом или с дихлорметаном, и катализатор выбирается в группе, образованной аминами, такими, как пиридин, и диметиламинопиридин.

1831487

Предназначенным для нейтрализации кислотности основанием может быть пиридин (который может служить одновременно растворителем, катализатором и основанием), триэтиламин или трибутиламин.

Предпочтительно, диализ, осуществляемый в стадии (4), проводится в присутствии слабого основания, такого, как бикарбонат натрия, чтобы удалить возможные вторичные продукты, такие, как ангидриды.

Продолжительность реакции может меняться в зависимости от желательной степени ацилирования, например, 1 — 24 ч.

Соединения изобретения,- селективно

О-ацилированные,обладают ин виво пролонгированной активностью. Например, когда эти соединения представляют собой соединения гепаринового типа, обладающие участком связи с А Т III, и следовательно, способны проявлять антитромботическую активность, то эта активность четко пролонгирована во времени по сравнению с таким же соединением, не подвергнутым селективному О-ацилированию, Селективно О-ацилированные гепариновые производные, согласно изобретению, имеющие или нет участок связывания с AT П1, причем эти последние практически лишены антикоагулирующей активности, обладают также различными биологическими активностями, а именно: — ингибирование пролиферации гладких мышечных клеток, которое представляет большой интерес для избежания рецидивов стеноза при вмешательствах, таких, как ангиопластика, обходы и сшивка вен и артерий, трансплантация органов, в особенности трансплантации сердца: — ингибирование гепариназы и гепаритиназы, ферментов, принимающих участие в метастазных диссеминированиях; — противовирусные свойства, в особенности по отношению к ретро-вирусу, а именно по отношению к различным НУ(вирус человеческого иммунодефицита), что представляет большой интерес при лечении СПИДа. — свойства ингибирования лейкоцитарной эластаэы, повышения имеющегося процента ингибиторов эластазы, также как селективного ингибирования синтеза коллагена типа III и фибронектина, что представляет большой интерес для лечения заболеваний, в которых наблюдается нарушение равновесия системы эластазантиэластаза, таких, как эмфизема, также для лечения дегенеративных заболеваний инъюнктивной ткани, таких, как артериосклерози диабет.

Селективно-0-ацилированные глюкоэминогликаны изобретения. следовательно, могут образовывать действующее начало лекарств большого интереса в многочисленных показаниях.

Изобретение также позволяет получить биологические объекты (селективно О-ацилированные глюкозаминогликаны), которые могут быть использованы в качестве стандартов или этанолов в сравнительных изучениях для исследований отношений структура/активность в различных физио10 логических системах, в которых могут содержаться глюкозаминогликаны.

Изобретение будет лучше понятно с помощью нижеследующих примеров.

15 Пример 1. Получение О-ацетилированного гепарина (1С 1938) из тетрабутиламмониевой соли гепарина. а) Получение тетрабутиламмониевой соли гепарина

20 Натриевую соль гепарина (10 г) растворенную в воде (500 мл), перколируют через колонну с катионообменной смолой (Dowex

50 W х 4., в форме Н ); Полученный раствор нейтрализуют гидроксидом тетрабути25 ламмония, После лиофилизации получают тетрабутиламмониевую соль гепарина (19,55 г). б) Ацитили рова н ие:

1,05 г Тетрабутиламмонийгепарината растворяют в безводном диметилформа30 миде (5 мл), После охлаждения до 0 С прикапывают уксусный ангидрид (1 мл:

10:46 ммоль), затем триэтиламин (1,45 мл, 10:46 ммоль) и диметиламинопиридин (64 мг, 0,5 ммоль). Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре. После добавления воды (5 мл), раствор диализуют в течение 72 ч против дистиллированной воды. Тетрабутиламмониевую соль и ревраща40 ют в натриевую соль пропусканием через смолу Dowex 50, Н+, при 0 С, с последующей нейтрализацией.1н. раствором гидроксида натрия. После лиофилизации получают 0,49 г гепарината натрия, селективно 0-ацетили45 рован ного и имеющего следующие характеристики.: соотношение сульфат/карбоксил: 2,28 мэкв/г (исходный продукт 2,20 мэкв/г).

Титр APTT: 91 nllìã

50 C-ЯМР-спектр (метанол. 51,6 м,д., 1з. внутренний стандарт): сигнал при 23,4 м„д.: СНз от СНзСОО; сигнал при 24,5 м,д.: (слабый): СНз от СНзСО-NH- (идентичен исходному продукту), 55 ЯМР-спектр указывает на наличие около двух ацетильных групп на дисахаридную единицу.

Пример 2. Получение 0-ацетилированного гепарина (IC 1938) из трибутиламмониевой соли гепарина.

1831487 а) Получение трибутиламмониевой соли гепаринэ:

Натриевую соль гепаринэ.(10 r) раство- ряют в воде (500 мл), затем перколируют через колонну с катионообменной.смолой 5 (Dowex 50 W х 4, в Н -форме). Раствор нейтрализуют добавлением 10$-ного раствора трибутиламина в зтаноле. После промывки и лиофилизации, получают тетрабутиламмониевую соль гепарина (14,77 г). 10 б) Ацетилирование

К охлажденному до 0 С раствору вышеуказанной соли(4 г) в безводном диметилформамиде (50 мл), добавляют диметиламинопиридин (250 мг), уксусный 15 ангидрид (3,9 мл) и трибутиламин (9,7 мл).

После выдерживания 24 ч при комнатной температуре, добавляют воду(1,5 мл). Смесь затем выливают в насыщекный раствор э зтаноле ацетата натрия. После промывки 20 этанолом, осадок растворяют в воде, после чего диализуют против 57-ного бикарбокатэ в воде, затем против воды. После лиофилизации получают гепаринат натрия, который О-ацетилирован (1,81 i), - 25

ИК-спектр имеет сильную полосу, относимую к сложному эфиру, при 1730 см, После омыления, продукт имеет: соотношение сульфат/карбоксил

2,38 мэка/г (исходный продукт; 2,40 мэка/r), 30 — титр АРТТ: 85 и!/мг, Пример .3. Получение О-ацетилированного гепарина (IC 1938), используя катализ пиридином, Тетрабутиламмониевую соль гепарина 35 (0,58 r) растворяют в смеси (1/1 от объема) пиридина и диметилформамида (10 мл). Добавляют уксусный ангидрид (О 5 мл). затем смесь выдерживают при комнатной температуре, Спустя 24 часа добавляют водный 40 раствор ацетата натрия (1М, 15 мл), затем смесь выливают в этанол (80 мл) охлажденный до 0 С. После центрифугировэния осадок растворяют в воде (10 мл), затем добавляют этанол (160 мл), э после него- 45 водный ацетат натрия (1М, 10 мл), Осадок затем обрабатывают водной и лиофилизуют, получая О-ацетилированкый гепарин (0,22 r).

П р и м. е р 4. Получение О-пропионили- 50 рованного гепаринэ (! С 1939) с различными степенями пропионилирования.

К охлажденному до 0 С раствору гепе-. . рината тетрабутилэммония (1,85 г), полученному как описано в примере 1, в 55 диметилформамиде (10 мл) прикапывают пропионовый ангидрид (2,1 мл), затем триэтиламик (2,9 мл) и диметиламинопиридин (128 мг). Во время 1 ч, 2 ч, 4-ч, 8 ч и 24 ч отбирают часть реакционной смеси. разбэв ляют равным объемом воды и диализуют в течение 24 ч в дистиллированной воде, После пропускания через смолу Dowex 50, Н . и нейтрализации раствором гидроксида натрия, полученные продукты лиофилизуют и они имеют характеристики, представленные в табл.1.

ПМР-спектр продуктов зарегистрирован в воде с 3,3,3-триметилсилилпропионатом (ТСП} в качестве внутреннего стандарта. Он имеет сигналы при: 1,1 м.д. и

2,4 м.д., характерные относительно остатков СНз и СН2. СНз-СН2-СО-О, и сигналы

5-5 м.д., характерные для протонов озидиевого скелета.

Сравнение интенсивности сигналов припиолила и скелета между обработанным.в течение 1 часа продуктом и таковым, подвергнутым- в течение 24-х часов реакции, иллюстрирует влияние продолжительности реакции. в самом деле, наблюдают. уменьшение сигналов протонов скелета, что указывает на увеличение степени замещения.

С-ЯМР-спектр (метанол, 51,6 м.д., внутренний стандарт), имеет сигналы при

10,8 и 30 м.д„характерные для радикалов

СНз и СНз пропионатов.

Пример 5. Получение О-бутилированкого гепарина (fC 1940) .. А) Использование тетрабутиламмониевой соли гепарина:

К раствору соли тетрабутиламмония гепарина (0.55 г), полученной как описано в примере 1, в диметилформамиде (5 мл) добавляют при 0 С масляный ангидрид и диметиламинопиридин. После выдерживания

24 ч при комнатной температуре, добавляют воду (5 мл), затем реакционную смесь диализуют в течение 12 ч против дистиллированной воды. После пропускания через ионообменник Орех 50, Н+, нейтрализации раствором гидроксида натрия и лиофилизации получают О-бутилированный гепарин в форме соли натрия (0,32 г).

Соотношение сульфат/карбоксил:

2,15 мэкв/г(исходный продукт: 2.20 мэка/г), Титр АРТТ: 59 nl./ìr.

ПМР-спектр(ТСП в качестве внутреннего стандарта) показывает наличие сигналов при 0,9 м.д„1,6 м.д, и 2,4 м.д., характерные для групп СНз-СНз из СНз-СНг-СНт-CO-О-, и сигнэлы между 3 и 6 м.д., характерные для озидиевого скелета.

Анализ ЯМР-спектра указывает на нали-. чие около. одной бутирильной цепи на дисахэридную единицу.

Б) Использование трибутиламмониевой джоли гепарика:

18

1831487

17 диметиламинопиридин. После стояния 24 примере 1, в диметилформамиде (5 мл), добавляют, при 0 С, капроновый ангидрид(1 мл, 6 ммоль), триэтиламин (0,84, мл, 6 ммоль) и диметиламинопиридин. Спустя 24 часа стояния при комнатной температуре добавляют воду (5.мл), затем реакционную смесь часа. при комнатной температуре добавляют воду (5 мл), затем реакционную смесь диа30 лизуют в течение 72-х часов против 5 -ного раствора бикарбоната, затем против дистиллированной воды. После ионообмена на смоле Dowex 50, Н, нейтрализации раство35 ром гидроксида натрия и лиофилизации, получают .О-деканоилированный гепарин в форме натриевой соли (0,30 г).

RMP-спектр (ТСП в качестве внутреннего стандарта} имеет два сигнала при 0,8, 1,2, 40 1,5 и 2,4 м,д, характерные для СНз и СН2 от

СНз-(СН2)анСO-О-.

Б) Использование трибутиламмониевой диализуют в течение 72 ч против 5 -ного раствора бикарбоната, затем против дистиллированной воды. После ионнообмена . на смоле Sowex 50, Н, нейтрализации раствором гидроксида натрия и лиофилизации, получают О-гексаноилированный гепарин в форме натриевой соли (0,30 r).

Титр АРТТ: 25 и1! мг

ПМР-спектр (TCfl, внутренний стандарт), показывает сигналы при 0,8; 1,2, 1,5 и

2,3 м.д. характерные дл я СНз-СН2 из

СНз(СН2)в-СО-О-.

Б) Использование трибутиламмониевой соли гепарина:

К охлажденному до 0 С раствору гепарината трибутиламмония (4 г), полученного как описано в примере 2, в диметилформами- 50 де (50 мл), добавляют диметиламинопиридин (0,25 r), трибутилвмин (9,7 мл) и ангидрид гексановой кислоты (10,6 мл). Спустя 24 часа, стояния при 20 С, добавляют воду (1,5 мл), затем насыщенный раствор ацетата натрия 55 в этаноле. После промывки этанолом, диализа и лиофилизации, получают О-гексаноилизированный гепарин (2,5 г).

Пример 7. Получение О-октаноилированного гепарина (1С 1942). соли гепарина.

К охлажденному до 0 C раствору трибу45 тиламмонийгепарината (4 r), полученного как описано в примере 2, в диметилформамиде (50 мл), добавляют диметиламинопиридин (0,25 г), ангидрид декановой кислоты (13,3 г), растворенный в 20 мл диметилформамида) и трибутиламин (9,1 мл). После стояния 24 часа при комнатной температуре, добавляют воду (5 мл), затем насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле. Осадок растворяют в диметилсульфоксиде, затем диализуют против воды, бикарбоната натрия и снова воды. После лиофилизации, получают О-деканоилированный гепарин (2,38 г).

Пример 9. Получение О-олеоилироааннего гепарнна (IC 20\3).

К охлажденному до 0 С раствору трибу- . К охлажденному до 0 С раствору гепатиламингепарината (4 г), полученного как рината трибутиламмония (4 г), полученного описано в примере 2, в диметилформамиде как описано в примере 2, в диметилформа(50. мл), добавляют диметиламинопиридин, миде (50 мл), добавляют диметиламинопи(0,25 г), масляный ангидрид (6,7 мл) и трибу- 5 ридин (0,25 г), ангидрид октановой кислоты тиламин (9,7 мл). Оставляют реакционную (12н1 мл) и трибутиламин (9,7 г), Спустя 24 смесь на 24 часа при комнатной температу- часа стояния при комнатной температуре, ре. Добавляют воду (1,5 мл), затем, спустя добавляют воду, затем, спустя 30 минут, на30 минут, насыщенный раствор ацетата на- сыщенный раствор ацетата натрия в этанотрия в этаноле (250 мл). Осадок затем про- 10 ле. После диалиэа против 207-ного мывают три раза этанолом, затем раствора ацетата натрия в этаноле, затем диализуютпротив57-ного растворабикар-. против дистиллированной воды, и ультрабоната, затем против воды. Получают, после фильтрации, продукт подвер