Способ получения последовательности днк, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин а-1

Способ получения последовательности днк, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин а-1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: генетическая инженерия , рекомбинантная технология получения . Сущность изобретения: способ получения последовательности заключается в том, что в вектор р BR322 клонируют фрагмент ДНК. полученный путем сшивки Batl-Pstt фрагмента, кодирующего аминокислоты + 15-+24 с фрагментом ДНК, кодирующим аминокислоты от -6 до +14 полипептида и включающим кодом инициации трансляции, а также модифицированные кодоны для аминокислот: -6, -1, +1, +3, +4,+5,+6,+7.+10,+11 и+1 , получают клоны и отбирают клоны, кодирующие человеческий проаполигтопротеин А-1. 7 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РеспУБЛик (si)s С 12 N 15/12

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4356123/13 (22) 26,05.88 (31) 8712540 (32) 28,05.87 (33) GB (46) 15.08.93. Бюл. N 30 (71) ЮЦБ, С,А, (BE) (72) Алекс Боллен, Жан Гобер (BE) и Эрнст

Вюльферт (ND) . (56) IP, N 96998/86, С 12 N 15/00, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЛЕДОВА-.

ТЕЛЬНОСТИ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ ФРАГМЕНТ КОДИРУЮЩИЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ

ПРОАПОЛИПОПРОТЕИН А-1

Изобретение касается способа получения новой последовательности дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин А-l.

Человеческий аполипопротеин А-1 (апо

А-I) является основным белковым составляк1щим липопротеинов высокой плотности (LH0) и хиломикронов лимфы. Печень и тонкая кишка являются основными центрами синтеза эпо А-I, Апо А-I синтезируется в этих органах в форме белкового предшественника(препроапо А — 1). Совместное трансляционное расщепление препептидэ происходит внутри клетки. и проапо А — I секретируется в плазме и в лимфе.

Проапо А — I содержит шесть дополнительных аминокислот (Arg — His — Phe — TrpGln-Gin), которые присоединяются к концевой эминогруппе апо А — I. Достигнув

„„5Ц „„1834904 АЗ (57) Использование: генетическая инженерия, рекомбинантная технология получения, Сущность изобретения: способ

- получения последовательности заключается в том, что в вектор р BR322 клонируют фрагмент ДНК, полученный путем сшивки

Ball — Рзт1 фрагмента. кодирующего аминокислоты+ 15 — +24 с фрагментом ДНК, кодирующим аминокислоты от -6 до +14 полипептида и включающим кодом инициации трансляции, а также модифицированные кодоны для аминокислот: -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 и+1 1, получают клоны и отбирают клоны, кодирующие человеческий проаполипопротеин А — 1. 7 ил, области расположения сосудов, проапо А-I расщепляется в условиях "ин вива" специфическим протеолитическим ферментом (апо А — 1 пропептидаза), образуя зрелый апо

А — I.

Этот зрелый апо А-1 представляет собой уникальный негликозилировэнный полипептид известный пос:едовэтельности, состоящий из 243 аминокислот (Н, В. Brewer и др., Biochem Biophys. Res. Commun 80, 1978 г., с. 623 — 630); он служит в качестве кофактора для плазматического фермента лицитинэ:холестеролацилтран рсферазы, которая ответственна за образование в плазме большинства сложных эфиров холестерина. Дефекты в структуре или биосинтезе аполипопротеина могут привести к нарушению в системе переноса плазматических липидов и к развитию заболевания коронарных артерий. Показано, что низкие

1834904 плазматические концентрации апо А-I и которым предшествует кодон ATG иницииLHD составляют значительный фактор рис- рования трансляции. Это приводит в река для сердечных припадков(инфаркт мио- зультате к тому, что полученный продукт карда) и для других заболеваний, связанных депрессии содержит N-терминальный метис атеросклерозом сосудов, В частности, му- 5 онин (соответствующий кодону ATG), кототации в гене, кодирующем апо А — I, связаны рый может вызвать побочные эффекты при со снижением концентрации LHO, а также с его использовании в терапии. преждевременными заболеваниями коро- Изобретение касается способа полученарных артерий, Апо А-I u LHQ являются ния человеческого проаполипопротеина А— основными составляющими плазмы. кото- 10 I, то есть зрелого белка проапо А — I, который рые участвуют в переносе холестерина пе- способен расщепляться специфическим риферических тканей (артерий) к печени. протеолитическим ферментом пропептида(иазываемый также обратным переносом зойапоА-I.Ïîäïîíÿòèåì "зрелый".испольхолестерина), экстретируясь организмом. зуемым в данном контексте, имеется в виде

Принимая во внимание то, что накопление 15 не только человеческий проапо А-I как такохолестерина в артериях является наиболее вой, но также и соответствующий белок, важной особенностью и механизмом этеро- первая аминокислота которого предстаалясклероза, стимуляция обратного переноса ет собой метионин, и присутствие которого холестеринапосредствомапоА-I можетзэ- обусловлено ATC кодоном инициирования медлить и преобразовать атеросклеротиче- 20 трансляции в построении вектора экспресский процесс и тем самым снизить случаи сии. сердечных припадков. Благодаря данному способу получения, Созревание проэпо А-1 a ano А-1 может человеческий проапо А-I полностью освоосуществляться количественно вне клетки божден от обычных эндогенных белков и по мере нахождения в крови в течение ме- 25 других исходных материалов или продуктов. нее i 2 часов. Принимая во внимание то, что Изобретение относится к способу полпроапо А-I является основным, если ие учения последовательности ДНК, содержаединственным, предшественником зрелого щей фрагмент, кодирующий человеческий апо А-l, он может быть использовэи в заме- проаполипопротеина А — I, предусматривая стительиой терапии каждый рээ. когда сии- 30 получение клонов ДНК путем клонирования жается концентрация LHD, например, при двунитевой комплементарной ДНК в наследственных или приобретенных поро- РВЙ322, выбор клона, кодирующего преках, Ввиду терапевтической цЬинвсти апо проэполипопротеии А — I, выделение послеА-I, исследователи делали попытки paspa- довэтельности ДНК из выбранного клона и ботать способы, позволяющие продуциро- 35 характеризуется тем, что в целях обеспечевать апо А-t в больших количествах. Такие ния наилучшей экспрессии человеческого общеизвестные способы включают очистку проэполипопротеина А-I, при помощи ДНК апа А-t, полученного в кровяной плэаме. — лигазы Т4, связывают фрагмент ДН К Bai 1

Из публикаций (Р. Cheung u L Chan, - Pst1 кодирующий аминокислоты с+15 по

NucIelc Acids Res., 11, 1983 г., 3703-3715; 40 +243 препроаполипопротеина А-I, в конце

Л. ЯеИЬаяег и др., l3MA, 3. 1984 г., 309-317. синтетического фрагмента, имеющего пои японская патентная заявка М 96998/86) следовательность ДНК (указана одинарная известно, что комплементарная ДНК, кади- цепочка): рующая препроапо A-1, может быть получе- 5 -ATGAGACATTTCTGGCAG CAGGACG на способами генетики. 45 AACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTA

Так, R, Lorenzetti и др. (FEBS Iett 194, А66АСТТ6 — 3

1986 г., 343-346) показали, что апо А-I мо- кодирующую аминокислоты с -6 до+14 полжет быть экспрессирован в Е. сой в форме ипептида и содержащую кодом инициации белка, слитого с нерасщепляемой бета-га- трансляции и модифицированные кодоны лактозидазой. Однако попытки экспресси- 50 для аминокислот -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, ровать зрелый апо А-I в форме неслитого +10,+11и+14.Последовательностьмодифибелка остались безуспешными. В японской цированной ДНК, полученной. согласно патентной заявке N. 96998/86 описывается способу настоящего изобретения. находит экспрессия белка подобного человеческому важное применение в конструировании векаполиполротеину А-1, е Е. call которнй оо тора клонирования и зкспрессии. содержатрансформируется плазмидой pHAIE I, со- щего зту последовательность ДН К, держащей ген со структурой апо А — I, под кодирующую человеческий проапо А-i, что контролем промоторэ я с, Однако данный дает амплификацию, а, следовательно, эксструктурный ген является неполным и со- прессию зрелого человеческого проапо А-I стоит из кодонов аминокислот от+4 до+243, и мет-npoan0 A — I; его конъюгатов слияния

1334904 или его коньюгатов с N-концевым сигналом, культурами жизнеспособных клеток или генетически модифицированных микроорганизмов,. содержащих такие векторы, и способных продуцировать полипептиды человеческого проапо А — I в физическом состоянии, отличном от того, который обнаруживают или выделяют из. источника или естественного окружения. Полученный человеческий проапо А — I в значительной мере освобожден от обычных эндогенных белков и других исходных материалов и продуктов.

Белок, продуцируемый клетками или микроорганизмами, модифицированными последовательностью ДН К, полученной согласно способу настоящего изобретения, состоит из или содержит зрелый человеческий проапо А — I, который в таком случае может быть превращен в условиях 1п иш>. или i cvivо а арелии челоееческии ало А-! путем протеолитического действия апо А — t пропептидазы. Полученный человеческий проапо А-1 может быть использован как таковой в терапевтических целях; может быть также использован мет-проапо А — 1, если присутствие метионилового радикала фармацевтически приемлемо, т.к. данный продукт может быть естественным образом и эффективно превращен в ток циркулирующей крови натуральной пропептидазой, в аутентный зрелый человеческий апо А — 1.

При желании, человеческий проапо А-1 может быть продуцирован в отобранных микроорганизмах или клеточных культурах, которые способны воздействовать на Nконцевой метионин, и, следовательно, способны продуцировать человеческий проапо

А-1 в форме, не содержащей N-концевой метионин. Другими словами, человеческий проапо А — I содержит или не содержит Nконцевой метиониловый радикал, может быть расщеплен в условиях in vitro с обра зованием зрелого человеческого апо А-I, который может быть использован в терапевтических целях. Это же относится и к конъюгатам слияния и коньюгатам, включающим сигнальный N-терминал проапо Аi; расщепление этого продукта приводит к образованию аутентного человеческого апо

А — I, лишенного N-концевого метионина.

Установлено, что эффективная экспрессия может гарантироваться за счет соответствующей модификации некоторых кодонов в последовательности, кодирующей аминокислоты от -6 до +14 человеческого проапо

А — !. Понятие "соответствующая модификация" в данном контексте означает, что некоторые естественные кодоны заменяются другими кодонами, которые. согласно гене50 контролем промотора Fh фага лямбда. Эти плазмиды представляют собой векторы экспрессии. которые пригодны для Е. co!I u направляют синтез человеческого проапо

А-1, который может быть расщеплен пропептидазой с образованием зрело-о аутентного человеческого апо А — 1. При вводе в =„.

coli плазмида puL B9296 направляет зкспресслитого белка, содержащего бета-галактозидазу и человеческий проапо А-!, под контролем зоны стимулятора IBc. Е. coli. Ecли учесть То. что данный продукт слияния содер>кит еще последовательность расщептическому коду, предстэвляют собой те же аминокислоты и, кроме того, это понятие означает, что все взятые совместно модификации приводят к снижению или даже к полному устранению образования булавочных структур. Следует подчеркнуть. что такие модификации последовательности ДНК не оказывают никакого влияния на тип точки расщепления -пропептидазы ввиду того, что аминокислотная последовательность, распознаваемая пропептидазой, сохраняется в данном построении.

Продуцируемый белок, является продуктом культуры клеток или генетически модифицированного микроорганизма и может быть представлен в форме зрелого проапо

А — 1, в форме зрелого проапо А — 1, которому предшествует радикал метионина, в форме слитого белка, такого как, например, бета20 галактозидаза-проапо А-I, и в форме соединения препроапо А-l.

Культура клеток или микроорганизмов, используемые для данного продуцирования, не ограничиваются клеточными линия25 ми и специфическими организмами: могут использоваться как прокариотические клетки, так и эйкариотические клетки, включая линии клеток животных и человека, Лишь с целью иллюстрации ниже дается пример экспрессии в бактерии Е coli (как представителя прокариотических клеток) и в дро>кжах Sa cchacomóààh CCCCrisicg, a также а клетках насекомых, зараженных бакуловирусом (как представителей эйкаристических клеток).

Реплицируемыми векторами клонирования и векторами экспрессии, содержащими последовательность ДНК, полученную согласно изобретению, и используемыми в

40 примерах являются рекомбинантные плазмиды PUL В9291, ри1 Â9292, ри1 Б9296, ри1

В9299, pN !Убl2 и pN 1т 1613, построение которых будет представлено ниже. Первые названные плазмиды, ри1 В9291 и pv1

В9292 содержат ген с модифицированной структурой проапо А — 1, которому предшествует кодон ATG, и который находится под

1834904 пения пропептидазы, то он может быть расщеплен с образованием аутентного зрелого человеческого апо А-.I.

Плазмида puL В9299 представляет собой вектор экспрессии, пригодный для дрожжей и содержащий зоны промотора и терминатора транскрипции AR ющий гарантировать эффективную экспрессию в дрожжах, Полученный человеческий проапо А-1 может быть снова расщеплен пропептидазой с образованием аутентного зрелого человеческого апо А-I, Плаэмида pN 171612 содержит ген со структурой проапо А-1, слитый с последовательностью ДНК сигнального пептидэ белка

0mpA Е. соП и под контролем промотора 1ро (лииопротеина) и промотора-оператора lac.

В данном построении последовательность, кодирующая сигнальный пептид сппрД предшествует последовательности проапо

А-1 без ATG кодона инициирования трансляции, Эта плазмида представляет собой вектор секреции подходящий для Е. со11 и направляет синтез человеческого проапо А1, который может быть секретирован в периплазме без N-терминального метионина.

Плазмида pN IY1613 представляет собой вектор переноса для ввода последовательности ДНКс человеческого проапо А-1 в бакуловирус. Она включает полигедриновый промотор бакуловируса и ген со структурой проапо А-I, включая ATG кодон инициирования трансляции.

Совместно с естественным источником бакуловируса (вирус ядерного полигедриозиса Аиiо9гарйа caiiforr)ICa AcNPN), плазмида pNIY1613 направляет синтез проэпо А — I в клетках насекомых и может снова освобождаться от метионина после пост-трансляционных модификаций в клетках насекомых.

В зависимости от типа используемого вектора и от выбранного хозяина может ис. пользоваться любой прием генетики, пригодный для достижения желаемой генетической модификации. включая трансфекцию. трансдукцию и др.

Данное изобретение осуществляется со штаммом ММ 294 микроорганизма Е,соИ

K12 ((no АЩ, Наса, s uE); этот штамм был сдан на хранение был сдан на хранение в

Коллекцию культур американского типа (АТСС М 33625) без ограничения в отношении его доступности.

Тем не менее, могут быть использованы другие микробные втэммы, включающие известные штаммы Есо11, такие как 1=.„арЦ

В, х 1776 (ATCC М 31537, депонирован 3 июля 1979 года, без ограничения),Д=,.

colt AR 88. ороиоводиоо от СС 00 (ATCC )k

40 пликации для обеспечения гарантии амплификации в хозяине. Эта гетерологическая вставка может быть снова экспрессирована таким образом, чтобы получить экспрессию одновременно с предыдущей слитой последовательностью, происходящей, например, от генов системы lас.

Эти векторы экспрессии бакуловируса, например pAcRP6 и pAcYMI (J, Matsuura u другие. J, Gen. virof, 68, 1987 r., стр. 12331250) и бакуловирус дикого типа (вирус гитик со)1)ого)рд AcNPV) широко исоольэуютск s настоящее время. Они подробно описаны в литературе и могут быть получены в основном согласно способу, используемому на

Техасской экспериментальной сельскохозяйственной станции.

8 качестве хозяина можно использовать также различные клетки насекомых для совместимых векторов экспрессии, напри33956) с clll, cl 857, bio функции дельта Н, лишенные лямбда, поставляемый PLPHARMACIA(YEM0++ и др., Proc. Nr)ti. Acad

Sci, США, 82, 1985r., стр. 88-92; G Devare u

Б др.. Cell, 38 1984 г., стр. 43-49), Е, coll l M

101(AT CGA 33878)(1. Messing и др.. Nuclels

Acids Res 9, 1981 г., стр. 309 — 321), или Е, coll

J А221(lрр-. hacM+. trp Е5, leu Вб, lac Y, гес

А1!Р, lас i, lac+, рго+) (J. Ghrayeb и др., 10 ЗМВО J6 3. 1984 г„стр. 2437 — 2442), или другие микробные штаммы, многие из которых депонированы и доступны согласно положению о депонировании известных микроорганизмов, таких как микроорганиз15 мы культур американского типа (АТСС) —— смотри перечни каталога ATCC. Эти микроорганизмы включают, например, ВасИ11, такие как Basillus subtllis и другие кишечные бактерии, из которых можно назвать, напри20 мер, Sslm oneltð Tu3Lhrimurium и Serrsrls

)т)агсеээапз с использованием плазмид, которые могут реплицироваться и выражать последовательности гетерологических ненов.

Плаэмиды экспрессии для применения

25 в отношении бактерий, например. E cöÖ, обычно получаются из плазмиды pBR322, используемой в качестве вектора (депонирована в ATCC под номером 37017) и путем вставки соответствующим образом после30 довательности гетерологического гена одновременно с сигналами инициирования и завершения трансляции, в фазе считывания, точно соответствующей функциональному промотору, с преимущественным отбором естественных или искусственно образованных ограничительных точек, Данный вектор будет являться носителем одного или нескольких характеристических генов отбора по фенотипу и источника ре1834904

10 мер клетки Едобо тега frugiperde Sf9 (M.D.

Summer u G.Å. Smith, Справочное руководство по методам для векторов бакуловирусов и по обработке клеточных культур насекомых, Техасский университет, Колледж Стэшн, 1987 г., ATCC СК1 1711).

Могут быть использованы различные штэммы дрожжей, заключающие в себе совместимые векторы экспрессии, такие как плазмида YR р7 (Р,T, Stlnchcomb и др., Nature, 282, 1979, стр. 39-43), которая способна к отбору и репликации одновременно в Е. coli и в дрожжах, в частности, Еасс(тагошусев cerevie iaä.

Штаммы дрожжей, которые могут быть использованы, представляют собой штамм

PH218 (G. Mlozzari и др., J. Bacteriol, 134;

1978 г., стр. 49 — 59), депонированный в Коллекции культур американского типа без огрэничения (АТСС № 44076), штамм 10S44c (T. Cabezon и др., Proc. Natl. Acad. Sci, США, 81, 1984 г., стр. 6594 — 6598), который имеет генотип leu 2-3, leu 2-112, рер 4-3. (M.

Hoylaerts и др., FEBS lett, 204, 1986 г., стр.

83-87) и штамм Ic 1697 d (erg J, leu 2-1 брадитрофныи для ергинин ATCC N.

20631).

Для экспрессии гетерологического гена, такого как ДНКс для человеческого проапо А-I в дрожжах, необходимо построение плазмидного вектора, включающего четыре составляющих компонента. Первым составляющим компонентом является фрагмент, который обеспечивает трансформацию одновременно Е. coll и дрожжеи, и которыи должен, следоеателвно, содержать ген отбора, происходящий от raæäoro организма.

Это может быть ген, ответственный за стойкость к ампициллииу, происходящий от Е.

cali (см. "Ampa") и ген leu 2, происходящий, от дрожжей. Этот составля ющий компонент требует также источника репликации, происходящего от каждого организма. для того чтобы сохраняться как плазмидная ДНК в этих двух организмах. Это может быть источник E coli, происходящий от pBR322 и источник «ад((хромосомы 1И дрожжей или источник репликации круговой ДНК 2,и.

Вторым составляющим компонентом плэзмиды является последовательность, расположенная в положении 5 сильно экспрессированного гена дрожжей для осуществления транскрипции помещенного ниже структурного гена. Данная последовательность, расположенная в положении 5, может быть последовательностью, происходящей от генов ТОН 1 или ARG3 дрожжей, Этот фрагмент построен таким образом, что исключает структурные последовательности TDH3 или ARG3, которые за55 дин; 1, изолейцин; К, лизин; L, лейцин; М, метионин; N, аспарагин; Р, пролин; 0. глутамии; R, аргинин; S, серии; Т, треонин; Ч, валин; W. триптофан; и У, тирозин.

На фиг. 2 представлена схема синтеза олигонуклеотидного адаптера для построе5

50 менены последовательностью, содержащей альтернативные Ограничительные точки. например ограничительные точки Ncol или

BamHl äëÿ благоприятного связывания этой последовательности, расположенной в положении 5 . со структурным геном.

Третьим составляющим компонентом системы является структурный геи, построенный таким образом, что содержит одновременно ATG сигнал инициирования трансляции и сигнал завершения трансляции.

Четвертым составляющим компонентом является ДНК последовательность дрожжей, содержащая последовательность, расположенную в положении 3 дрожжевого гена, которая заключает B себе соответствующие сигналы прекращения транскрипции и полиаденилирования. Так, например, плазмиды, направляющие продуцирование человеческого проапро А — I в дрожжах, могут быть построены путем вставки фрагментов гена полипептида человеческого провора Д-l в точку BAmHI плавмиды выражения pRIT 10774. оп исаи пои в евролеяскои патентной заявке ¹ 151102.

Дополнительные отличительные особенности настоящего изобретения будут ясны из последующего описания предпочтительных пост(оений векторов, включающих последовательность ДНК, отвечающей данному изобретению, и условий, в которых эти векторы могут быть полезно использованы. Далее будет дана ссылка на рисунки, В которь(х:

На фиг. 1а и б показана последователь- ность нуклеотидов и аминокислот человеческого препроапо А — I. Последовательность нуклеотидов информационной PHK человеческого препроапо A-(определена, исходя из анализа ДНК последовательности ДНКс клона pULB1609. Аминокислоты, имеющиеся в сигнальном пептиде, в пропептиде и в полипептиде зрелого апо А-1, идентичны и имеют нумерацию от первой аминокислотной группы белка апо А — I.

Подчеркнута область, соответствующая отобранной пробе синтетической ДНК, используемой для выделения данного клона.

Буквенные аббревиатуры. используемые для обозначения аминокислот, имеют следующие значения: А, алании; С, цистеин; D, аспаргиновая кислота; Е, глутаминовая кислота; F, феиилаланин; G, глицин; Н, гисти1834904 ния фрагмента ДНК, кодирующего 6 аминокислот пропептида и 14 первых аминокислот полипептида зрелого апо А-! с ATG кодоном инициирования. Стрелки показывают олигонуклеотиды, используемые для синтеза фрагмента Ncoi ВАО на 66/61 основных пар (вр,), На фиг. 3 показано построениеплазмиды рЯ 89291, которая несет регуляторные

10 зоны лямбда Р1 и последовательность нуклеотидов проапо А-l; на фиг. 4 — построение плазмиды pUL B9296, которая несет промотор lac u E. coll и последовательность нуклеотидов бетагалактоэидаэы. слитой с последовательностью проапо A-l; на фиг. 5 — построение плазмиды pUi В9299, которая несет регуляторные зоны ABG3 дрожжей и последовательность нуклеотидов проапо А—

l; на фиг.:6а,б,с — построение плазмиды

pNlY1612, которая несет регуляторные зо- 20 ны lac и 1щ последовательность, кодируюпГулг сигнальный пепгид алга А, н последовагельность нуклеотидов проапо А—

i; на фиг. 7 — построение плаэмиды

pN1Y1613, которая заключает в себе регуляторную зону гена полигедрина и последовательность нуклеотидов проапо A-l. той же обратной транскриптазы в качестве фермента. Препараты ДНКс db, обычно в количестве 1 мкг, обрабатываются Sl нуклеазой. с образованием явных концов. Эти процедуры хорошо известны для специалистов в данной области и подобно описаны

Maniatis и др., указывалось выше, Затем

ДНКс бЬ вытягивается путем удлинения олиго (dC) согласно способу, описанному L.

Получение рибонуклеиновых кислот:

Общая рибонуклеиновая кислота печени 30 получается из хлористого соединения гуанидина (R.À. Сох, Методы в энзимологии, ХП, часть В, 1968 г„стр. 120 — 129), Данный препарат общей рибонуклеиновой кислоты

{РНК) затем пропускается через колонку с 35 олиго (бТ)-целлюлозой для получения общих поли А РНК (Т. Maniatis и др., Молекулярное клонирование, Cold Spring Harba

Laboratory Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1982 г.), Из 10 граммов человеческой печени 40 получается 200 мкг поли А РНК.

Синтез дополнительной ДНК (ДНКс) в условиях ин витро.

Реакции обратной транскрипции, с использованием в качестве исходного продук- 45 та 0.1-5 мкг поли А PHK осуществляются с участием олиго (dT)12-18 (примерно 1 мкг; источник: BOEHRlNGER). Затем эта однониточная ДНКс преобразуется в молекулу с двойной нитью (ДНКс db) с использованием 50

Villa — Komaroff и др, (Proc. Natl. Acad Scl, США, 75, 1978 г., с. 3327 — 3731). Обычно осуществляется обработка 100 нг ДНКс db ферментом терминальной деоксинуклеотидилтрансферазой.

Обычно удлинения, соответствующие

15основаниям, присоединяются к 3 концам молекулы ДНКс db, Клонирование вытянутой ДНКс db в плазмидный вектор pBR 322.

ДНК плазмиды pBR 322 линейно выравнивается посредством фермента Pstl и вытягивается посредством удлинений олиго (dG) согласно способу, описанному R,M.

Lawh и др., (й ис1е 1с Асй з Res. 9, 1981 r., стр.

6103-6114).

ДНКс db. вытянутые удлинениями олиго (dC), смешиваются в равномолекулярных пропорциях сДНК плазмиды pBR 322, вытянутой. посредством олиго (dG).

Обычно для рециркуляризации плазмиды гибоидизируются 50 мкг смеси. Эти условия хорошо известны для специалистов в данной области и подробно описываются в работе R.Ì, Lawn и др., см. выше, Затем эта смесь гибридизации используется для трансформации компетентных клеток, например, штамма ММ294 Е. coil, согласно способу. описанному R,M. Lawn и др., см. выше. Несколько сотен трансформант получается путем ростового отбора в среде тетрациклина, причем стойкость к этому антибиотику сообщается плазмидой pBR

322. Трансформанты были испытаны также на их чувствительность к ампициллину. Те

413 них, которые проявляли чувствительность, содержали химеровую плазмиду, поскольку вставка инородной ДНК в вектор инактивирует ген ампициллина. и от

Трансформанты E. cali отсеиваются посредством синтезированных олигонуклеотидов, меченых у конца 5 изотопом 32Р. соответствующих фрагменту гена апо А-1.

Такая последовательность нуклеотидов человеческого апо А-1 уже известна (см. P.

Chetng u L. Chan. cM. вьiше. и J.1. Seiihamer и др.. см. выше); таким образом, осуществляют практически химический синтез по способу N.О. Slnda и др, (Nucleic Acids, Res.

12, 1984 г.. стр, 4539-4557) фрагмента олигонуклеотидов длиной, соответствующий 22 основаниям, соответствующих 5 концу гена. Отобранная последовательность представляет собой:

5 — G CTGCGGTG CTGACCTTGG CCG — 3 .

Перед использованием для гибридизации синтезированной олигонуклеотид фосфорилируется у его 5 конца

14

1834904

13 полинуклеотидокиназой Т4 (P

8iochemlcals и (гамма — 32P) аденозинтиофосфатом. Условия мечения и гибридизации хорошо известны для специалистов в данной области и подробно описаны в работе Т, Maniatis и др„см. выше, а также в работе

Ва11еп А. и др„(ОНА, 2, 1983 г„стр. 255-264).

Построение плазмиды выраженьищя, Способы получения ДНК для выделения фрагментов ДНК, а также условия анализа посредством ограничительных ферментов и условия сшивки фрагментов харашо известны для специалистов в данной области и подробно описаны в работе R.M. Lawn и др„ см, выше, и в работе Т. Cabezon и др., см. выше, и применяются в настоящей работе.

Синтез фрагментов NCOI-Ball.

На рисунке 2 показаны в деталях принципы, лежащие в основе концепции 35— мерных, 30 — мерных, 18 — мерных и 43— мерных олигонуклеотидов, используемых в синтезе фрагмента НСО1-ВАИ на 65/61 основных пар (рВ). Эти сйнтезированные 30мерные и 18 — мерные фрагменты фосфорилируются у них 5 концов посредством полинуклеотидокинаэы Т4 (Р— L 8 iochemicals), 1 мкг каждого олигонуклеотида, включая нефосфорилированные 35 — мер и 43 — мер. гибридизируются в течение трех минут при

95 С в 300 мМол ацетата натрия (рН =- 7,0); затем медленно охлаждаются при 4 С, Смесь гибридизации используется как таковая в операции клонирования для построения плаэмид выражения, Определение последовательности аминокислатных остатков ЛНК

Анализ последовательности ДНК осуществляется согласно способу. описанному

A.M. Maxim u W. Gilbert (Proc Matt. Асад Sci

США, 74, 1977 r., стр. 560 — 564 и Г. Sanger u др. (Proc. Natl. Асад, Sci, США. 74. 1977 r„ стр, 5463-5467), Анэлизбелкав, Скопление клеток, имеющих оптическую плотность в пределах от 1 до 630 нм (100630) получали в различных этапах в ïðîцессе брожения штаммав, несущих плазмиды выражения человеческого проапо А-l, риl 89291, pul 89292, pul 89296 и pul 89299 (трансформированы соответственно в штаммах AR58 и IM101 Ecoii и в штамме

10S44c дрожжей). Каждый образец переводился в суспензи а в 50 мМол Трис-НС! буфера, рН вЂ”.: 6,8. содержащем 2

50 дадецилсульфата натрия (DSS), 6 Мол, моче- 55 вины, 10 глицерина и 5 2-меркэптоэтанала, и этот буферный раствор нагревался при кипении в течении трех минут, Образцы подвергались электрофареэу на полиакриламидных гелях (IJ.K. Lacmmli. Nature?27.

1970 г, 680-685), Общие белки обнаруживались путем окрэшивания синим Комассье, и синтезированный человеческий праапо А †идентифицировался путем иммунологического распознавания после электрофорестического переноса (сматри А, Bollen и др„ см. выше).

Построение рекомбинантных векторов для экспрессии человеческого проапо А-i в бактериях, в дрожжах и в клетках насекомых, зараженных бакуловирусом

1, Клон ДНКс для человеческого препроапо А — 1: ри1 В1609 (фиг. 1).

Было отобрано несколько сотен трансформант, получаемых при клонировании

ДНКс db, соответствующей поли А+ РНК человеческой печени, а точку PStl плаэмиды

pHR322, с помощью синтезированного пробника 22 — мерного апо А — 1, описанного выше. Один из клонов дает интенсивный сигнал гибридизации в ходе выделен, и данная вставка ДНК, присутствующая в рекомбинантной плазмиде, была охарактеризована путем анализа последовательности данной ДНК, Ее длина соответствует 878 парам оснований (Ьр); ана кодирует полный палипептид препраапо А-!. Кэк показано на рисунке 1, данный клонированный фрагмент ДНКс несет некодирующие зоны в 5 и 3 положениях (19

sp и 55 вр, соответственно), последовательность на 54 вр, кадирующу о пептидный предшественник (от аа — 24 до аа-7), последовательность нэ 18 бр, кодирующую пропептид (от аа-6 до аа-1) и последовательность на 732 Ьр, кадирующую зрелый апо А-1 (от аа+1 до аа+243), и включает кодан завершения трансляции. Данная последовательность белка, взятая иэ последовательности ДНК, абсал отно точно соответствует обнаруженным аминокислотам для препраапо Л-I из данного белка и иэ клонов ДНКс, выделенных изолированно друг от друга (W.Ñ, Na" кег и др., Сап;р.

Piochem. PhysioI 578, 1977 r., стр. 309-315;

Патентная заявка Японии ¹ 96998/86; Р .

Cheung u L. Chan, cM. выше, и.I.J. Seiihamer и др.. см. выше).

2, Построение бактериального вектора экспрессии, включающего последогательность ДНКс человеческого праапо А--I: puI

89291 (фиг. 2 и 3), Была построена pul 89291, плазмида, нрадуцирующэя человеческий t1poal10 А — I путем расположения сегмента. происходящего от клона р0(81609, за регуляторным праматаром лямбда Р1 (рис. 3). Построение этой плаэмиды экспрессии требует сингеза

1834904 фрагментов ДНК, включающих ограничительную точку ЙЯДЯТО кодон инициирования трансляции и последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислоты от аминированного конца гена со структурой человеческого проапо А-l, до первой уникальной ограничительной точки, ВаП (фиг.

2).

Такой адаптер синтезируется химическими методами (N.D. Slnha и др., см. выше), Получено четыре синтезированных олигонуклеотида; после гибридизации они кодируют метионин, соответствующий ATG кодону инициирования трансляции, для шести аминокислот, соответствующих пропептиду, и для 14 первых аминокислот зрелого ,человеческого апо А — I (рисунок 2). Этот синтезированный адаптер служит для снижения до минимума образования вторичных структур у конца 5 гена. Для этого кодоны, отобранные для кодирования аминокислотных групп -6, -1, 1, 3, 4, 5. 6, 7, 10, 11 и 14, не соответствуют естественным кодонам. имеющимся в ДНКс клона рЫ 81609.

Описанный выше синтезированный адаптер используется для присоединения фрагмента ДИК на 744 рЬ, происходящего от pul 81609, к промотору яямбда Р1 в плазмиде экспрессии pul 81221.

Построение вектора экспрессии pul

81221 описано в европейской патентной заявке М 186.643. Оно включает три основных этапа. начиная от плазмиды рСОЧ g. Плазмида pCQV2 описана Queen С. в!. Мо!, Арр1.

Genet. 2, 1983 н.. стр. 1-10, и легко доступна.

Выбор данного типа вектора необязателен: может быть использован любой другой вектор, имеющий промотор, и расположенную ниже от него подходящую точку NC01.

Примерно 0,1 мкг синтезированных фрагментов, таких как описаны выше, сшиваются посредством ДНК лигазы Т4, примерно с

1 мкг фрагмента ВаИ вЂ” PSti на 744 рЬ, происходящего от pui 81609 и примерно с мкг плазмидного вектора pUL 81221, отсеченного МСО! и ВаП. До осуществления операции сшивки фрагмент Ва11 — РЫ на 744 рЬ основных пары обрабатывается ДНК полимеразой Т4 таким обра ом. чтобы происходило преобразование вытянутых концов в положении 3 в свободные концы. Данная процедура хорошо известна для специалистов в данной области и подробно описана

Т. Maniatis и др., см. выше.

После амплификации в компетентных клетках штамма AR58 Е. соИ перестроенные плазмиды характеризуются путем анализа ограничительных точек и анализа последовательности ДНК синтезированных фрагментов и точек соединения, Рекомбинантная плазмида pUL 89291 отвечает всем критериям, поскольку она имеет фрагменты в правильной ориентации и в правильном по5 рядке. Она используется для изучения выражения.

3. Построение бактериального вектора экспрессии, содержащего слитые последовательности, соответствующие бета-галак10 гозидазе и человеческому проапо А-1: pul

89296 (фиг. 4).

8 данном построении последовательность ДНК, кодирующая человеческий проапо А-1, сливается в фазе правильного

15 считывания ниже последовательности ДНК бета-галактоэидазы. Ген бетагалактозидазы присутствует в плаэмиде экспрессии Е. col!

pUR288, являющейся легко доступной (О.

Ruther и Мо11ег-HI!I, EMBO 3, 2, 1983 г„

20 1971-1794), которая несет эффективно индуктируемый промотор lас с соответствующие ограничительные точки в последовательности бета-галактозидаэы, Была построена соответствующая рекомби25 нантная плазмида, как показано на рисунке

4. Прежде всего ДНК плазмиды puR228 отсекается BAMHI, затем обрабатывается

ДНК полимеразой Т4 и снова отсекается

SAII. Затем фрагмент ДНК на 805 рЬ отделя30 ется от pUL 89291 путем последовательных операций выравнивания с Крп1, обработки

ДНК полимеразой Т4 и конечного выравнивания с SaH. Эти два фрагмента сшиваются друг с другом s молярных пропорциях по35 средством ДНК лигазы Т4, и полученная плазмида используется для трансформации компетентных клеток штамма J M101 ЕЕ. сф1, который является широко распространенным и легко доступным штаммом (АТСС N

40 33876). Трансформанты характеризуются путем ограничительного анализа на правильную ориентацию последовательности человеческого препро А-1 по отношению к гену бета-галактозидазы и на присутствие

45 воспроизводимой точки ВааЮ на стыке двух последовательностей. Это показывает, ° что последовательность человеческого проапо А-1 хорошо слита ниже последовательности ДНК бета-галактозидазы и в фазе

50 правильного считывания. Одна из трансфармант, содержащая плазмиду pul89296, отвечает всем критериям и используется в экспериментах на определение выражения.

4. Построение алазмиды экспрессии

55 дрожжевого носителя последовательности

ДНКс человеческого npoaito А-1: pul 89299 (фиг. 5).

В данном построении последовательность ДНКс, кодирующая человеческий про1834904

10

20

50 апо А-l, клонируется между сигналами промотора и терминатора, которые несет плээмида выражения дрожжей. Для настоящего эксперимен-.а выбран данный вектор выражения дрожжей pRIT 10774, Такое построение алаэмиды выражения pRIT 10774 описано в европейской патентной заявке

151.102. Она построена, с одной стороны, из плэзмиды pRTI 10749, депонированной в

АТСС под номером 39133, в соответствии с положениями Будапештского соглашения, и, с другой стороны, иэ челночного вектора

УЕ р13 для Е. со!! — S cerevligl+, описанного

J.R. Breach и др., à Gem 8, 1979 г., стр.

121-133, и который хранится в ЛТСС под номером 37115 и легко доступен. Вектор

pRIT 10774 может реплицироваться одновременно в Е. coli и в дрожжах и несет промотор и терминатор транскрипции орнитинкарбамаилтрансфераэы (ARG3), разделенных уникальной ограничительной точкой BamHI, приемлемой для вставки инородной ДНК, имеющей свой собственной

ATG кодон инициирования трансляции. КроМе того, данный вектор несет последовательности 2 дрожжей, метаболические маркеры для отбора в дрожжах и марке отбора AmpA для челночного вектора в Е. coli.

Это не единственный вектор, который Может быть использован для выражения человеческого проапо А-! в дрожжах: может быть использован любой другой вектор для дрожжевого носителя рег/ляторного сигнала, и это приводит к качественно одинаковым результатам. Построение. иллюстрированное на фиг. 5. осуществляется следующим образом. ДН К плазмиды pRIT

10774 линейно вь. равнивэется посредством фермента B am Hl и обрабатывается ДН