Микрошарики микронного или субмикронного размера с полимерной оболочкой и способ их изготовления

Микрошарики микронного или субмикронного размера с полимерной оболочкой и способ их изготовления

Реферат

 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и относится к микрошарикам микронного или субмикронного размера с полимерной оболочкой, заполненным воздухом или газом, и способу их изготовления. Заполненные воздухом или газом микрошарики окружены нанесенной на поверхности раздела фаз полимерной оболочкой, которая выполнена из синтетического полимера, для инъекцирования в живые организмы или вводимые орально, реактально или уретрально для терапевтических или диагностических целей (эхография). Свойства полимерной мембраны микрошариков (эластичность, проницаемость, биоразлагаемость) могут регулироваться путем выбора полимера, условий осаждения на поверхности раздела фаз и полимерных добавок. Конденсация полимера в суспензии составляет от 0,00004 до около 400 мг/мл, толщина оболочки составляет 50 - 500 нм и количество воздуха или газа составляет от 0,00003 до около 500 мнл/мл суспензии. Способ изготовления микрошариков осуществляют путем осаждения на поверхности раздела фаз полимерного вещества, при этом готовят эмульсию масло в воде, добавляют полимер, нерастворимый в водяной фазе, осаждают полимер, удаляют закапсулированную гидрофобную фазу, при этом гидрофобную фазу выпаривают одновременно с водной фазой при замещении воздухом или газом. 3 с. и 19 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и относится к микрошарикам, заполненным воздухом или газом, включенным в органическую полимерную оболочку, которые могут быть диспергированы или суспендированы в водной среде и использоваться в этой форме для оральных, ректальных и уретральных случаев применения или для инъецирования в живые существа, в частности для целей ультразвуковой эхографии и других медицинских случаев применения.

Изобретение также включает способ изготовления указанных микрошариков в сухом состоянии, причем последние способны немедленно диспергироваться в водном жидком носителе для получения суспензий с улучшенными свойствами по отношению к существующим подобным продуктам. Следовательно, суспензии из микрошариков в жидком носителе, готовые для введения, также является частью изобретения.

Хорошо известно, что микротела или микрошарики воздуха или газа, например микросферы, такие как микропузырьки или микрошарики, суспендированные в жидкости, представляют собой исключительно эффективные ультразвуковые отражатели для эхотерапии. В этом описании выражение "микропузырек" специально обозначает микросферы воздуха или газа в суспензии в жидкости-носителе, которую обычно получают в результате введения в нее воздуха или газа в разделенной форме, при этом жидкость предпочтительно также содержит поверхностно-активные вещества для регулирования поверхностных свойств и стабильности пузырьков. В микропузырьках поверхность раздела газа с жидкостью главным образом содержит свободно связанные молекулы жидкости-носителя. Выражение "микрокапсула" или "микросфера" предпочтительно обозначает воздушные или газовые объемы с материальной границей раздела или оболочкой из молекул, иных чем жидкость-носитель, т.е. стенка полимерной мембраны. Как микропузырьки, так и микросферы полезны в качестве средств ультразвукового контрастирования. В частности, при инъекцирования в кровоток живых тел суспензий из микропузырьков или микросфер газа (в диапазоне от 0,5 до 10 мкм) в жидком носителе в значительной степени усилится получение изображения с помощью ультразвуковой эхографии, способствуя таким образом визуализации внутренних органов. Получение изображения сосудов и внутренних органов может значительно помочь при медицинской диагностике, в частности при обнаружении сердечно-сосудистых и других заболеваний.

Образование суспензий из микропузырьков в инъецируемом жидком носителе, пригодном для эхографии, может быть осуществлено высвобождением газа, растворенного под давлением в этой жидкости, или путем химической реакции, выделяющей газообразные продукты, или путем смешивания с жидкостью растворимых или нерастворимых твердых веществ, содержащих воздух или газ, увеличенные или поглощенные ими.

В частности, в патенте США N 4446442 (Шеринг) раскрыт ряд различных технологий для производства суспензий из микропузырьков газа в стерилизованном инъецируемом жидком носителе, использующем: а) раствор поверхностно активного вещества в жидком носителе (водный) и б) раствор средства увеличения вязкости в качестве стабилизатора. Для создания пузырьков раскрытая здесь технология включает пропускание при высокой скорости смеси а), б) и воздуха через малое отверстие; или инъецирование а) и б) незадолго до использования вместе с физиологически приемлемым газом; или добавление кислоты к а) и карбоната к б), при этом оба компонента смешивают вместе как раз перед употреблением, и кислота реагирует с карбонатом для создания пузырьков CO₂; или добавлением газа под избыточным давлением к смеси из а) и б) при хранении, причем указанный газ высвобождается в микропузырьки в момент, когда эта смесь используется для инъецирования.

Одна проблема с микропузырьками заключается в том, что они обычно имеют кратковременный срок жизни даже в присутствии стабилизаторов. Поэтому в Европейском патенте N 131540 (Шеринг) раскрыто приготовление суспензий из микропузырьков, в которых стабилизированный инъецируемый жидкий носитель, например физиологический водный раствор соли, или раствор сахара, такого как мальтоза, декстроза, лактоза или галактоза, смешивается с твердыми микрочастицами (в диапазоне от 0,1 до 1 мкм) тех же самых сахаров, содержащих удерживаемый ими воздух. С целью получения суспензии из пузырьков в жидком носителе как жидкие, так и твердые компоненты перемешивают вместе в стерильных условиях в течение нескольких секунд и как только суспензия получена, она должна быть использована немедленно, т.е. она должна быть инъецирована в течение 5-10 мин для эхо - графических измерений; в самом деле из-за того, что пузырьки недолговечны, их концентрация становится слишком низкой, чтобы иметь практическое значение спустя этот период времени.

Другая сложность с микропузырьками для эхографии после инъецирования - это размер. Как обычно признано, полезный размер пузырьков для обеспечения легкого переноса через малые кровеносные сосуды находится в пределах примерно от 0,5 до 10 мкм; при более крупных пузырьках существует опасность образования тромбов и последующей эмболии. В частности, в суспензиях с пузырьками, описанных в патенте США N 4446442 (Шеринг), в котором водные растворы поверхностно-активных веществ, таких как лецитин, сложных и простых эфиров жирных кислот и жирные спирты с полиоксиэтиленом и полиоксиэтилированными полиолами, таким как сорбитол, гликоли и глицерин, холестерол, или полиокси-этилен-полиоксипропиленовые полимеры, энергично встряхивают с растворами повышающих вязкость и стабилизирующих соединений, таких как моно- и полисахариды (глюкоза, лактоза, сахароза, декстран, сорбитол); полиолы, например глицерин, полигликоли; полипептиды, такие как белки, желатин, оксополижелатин и белок плазмы, только примерно 50% микропузырьков имеет размер ниже 40-50 мкм, что делает такие суспензии непригодными для многих случаев применения в эхографии.

Микрокапсулы или микрошарики были разработаны с целью устранения некоторых из вышеуказанных недостатков. Как сказано ранее, в то время как микропузырьки имеют только нематериальную или исчезающую оболочку, т.е. они только окружены стенкой жидкости, поверхностное натяжение которой изменяется от наличия поверхностно-активного вещества, микрошарики или микрокапсулы имеют осязаемую оболочку, выполненную из реального материала, иного, чем сам носитель, например полимерной мембраны с определенной механической прочностью. Иными словами, они представляют собой микросферы из твердого материала, в которых воздух или газ более или менее плотно заключен в капсулы.

В частности, в патенте США N 4276885 (Тикнер и др.) описывается применение микрокапсул с поверхностной мембраной, содержащих газ, для усиления ультразвуковых изображений, при этом мембрана включает множество нетоксичных и неантигенных органических молекул. В описанном варианте осуществления эти микропузырьки имеют желатиновую мембрану, которая предотвращает слипание, и их предпочтительный размер составляет 5-10 мкм. Мембрана этих микропузырьков достаточно стабильна для проведения эхографических измерений; однако спустя некоторый период времени газ, заключенный внутри, будет растворяться в потоке крови и пузырьки постепенно исчезнут, что, по-видимому, вызвано медленным растворением желатина. До применения микрокапсулы хранят в желатиновых растворах, в которых они стабильны при хранении, но желатин требует разогрева и расплавления, чтобы стать жидким в момент, когда суспензия используется для выполнения инъецирования.

Микросферы с улучшенной стабильностью при хранении, хотя без желатина, описаны в патенте США N 4718433 (Фейнштейн). Эти микрошарики получают обработкой ультразвуком (от 5 до 30 кГц) вязких белковых растворов, таких как 5%-ный сывороточный альбумин, и имеют диаметры в диапазоне от 2 до 20 мкм, главным образом от 2 до 4 мкм. Микросферы стабилизируют путем денатурации мембраны, образующей белок после обработки ультразвуком, в частности, путем использования тепла или химических средств, например, с помощью реакции с формальдегидом или глутарового альдегида. Концентрация стабильных микросфер, полученная по этой технологии, составляет примерно 8 10⁶ мл в диапазоне 2-4 мкм, примерно 10⁶ мл в диапазоне 4-5 мкм и менее 510⁵ в диапазоне 5-6 мкм. Время стабильности этих микросфер составляет 48 ч или больше, и они позволяют легкое получение изображения левой половины сердца после внутривенной инъекции. В частности, обработанные ультразвуком микропузырьки из альбумина при их инъецировании в периферийную вену способны пройти через легкие. Это приводит к эхорадиографическому помутнению полости левого желудочка так же как и тканей миокарда.

Недавно еще более усовершенствованные микропузырьки для ультразвуковой эхотерапии с инъекцией были описаны в Европейском патенте N 324938 (Виддер). В этом документе описаны высокие концентрации (свыше 10⁸) или заполненные воздухом, связанные с белком микросферы менее чем 10 мкм, которые сохраняются в течение нескольких месяцев или более. Водные суспензии этих микропузырьков получают ультразвуковой кавитацией растворов денатурируемых белков, например, сывороточного альбумина человека, причем эта операция также приводит к степени пенообразования мембрано-образующего белка и к его последующему отверждению с помощью тепла. Другие белки, такие как гемоглобин и коллаген, также подходят.

Совсем недавно М.А. Уитли и др. (Биоматериалы 11, (1990), 713-717) описали приготовление микросфер с полимерным покрытием путем ионотропной желатинизации альгината. В этой публикации упомянуто несколько технологий для приготовления микрокапсул; в одном случае раствор альгината пропускали под давлением сквозь иглу в потоке воздуха, что создавало струю выделяющегося воздуха, заполняющего капсулы, которые отверждали в ванне, 1,2%-ного водного CaCl₂. Во втором случае использовалась соэкструзия газа и жидкости, газовые пузырьки вводили в образующиеся капсулы с помощью трехбарабанной головки, т. е. воздух вводили под давлением в центральную капиллярную трубку, в то время как раствор альгината пропускали под давлением сквозь более широкую трубку, расположенную коаксиально с капиллярной трубкой, и продували стерильный воздух вокруг нее через рубашку, охватывающую эту вторую трубку. Таким же образом в третьем случае газ захватывался в раствор альгината до распыления путем использования гомогенизатора или путем обработки ультразвуком. Полученные таким образом микропузырьки имели диаметры в пределах от 30 до 100 мкм, однако они все еще были слишком велики для легкого прохождения через легочные капилляры.

Высокая стабильность при хранении суспензий микропузырьков, описанных в Европейском патенте N 324938, позволяет им продаваться на рынке в таком виде, т. е. с фазой жидкого носителя, что является ценным коммерческим качеством, так как приготовление перед употреблением уже не является необходимым. Однако белковый материал, используемый в этом документе, может вызвать аллергенные реакции у чувствительных пациентов и, кроме того, необычайная прочность и стабильность мембранного материала имеет несколько недостатков, в частности, из-за их жесткости мембраны не могут выдержать внезапные колебания давления, которым могут быть подвергнуты микросферы, в частности, во время перемещения по потоку крови, причем эти изменения давления вызваны пульсациями сердца. Таким образом, при практических ультразвуковых опытах часть микросфер будет прорвана, что делает затруднительной воспроизводимость получения изображения; таким же образом эти микропузырьки непригодны для орального применения, так как они не будут выдерживать пищеварительные ферменты, присутствующие в желудочно-кишечном тракте. Кроме того, известно, что микросферы с гибкими стенками являются более эхогенными, чем соответствующие микросферы с жесткими стенками.

Наряду с этим в случае инъекций чрезмерная стабильность материала, образующего стенки микросферы, будет заземлять его биодеградацию испытываемым организмом и может привести к проблемам метаболизма. Следовательно, является более предпочтительным разработать выдерживающие давление микропузырьки, окруженные мягкой и эластичной мембраной, которая может временно деформироваться под воздействием изменений давления и наделена повышенной эхогенностью; таким же образом можно было бы показать, что микропузырьки с регулируемой способностью к биодеградации, в частности, выполненные из полупроницаемых биодеградируемых полимеров с регулируемой микропористостью для способствования медленному проникновению биологических жидкостей, могли бы быть высокоцелесообразными.

Эти желательные свойства теперь были достигнуты с помощью микрошариков согласно настоящему изобретению, как определено в пп. 1 и 2 формулы и в последующих ее пунктах. Кроме того, хотя такие микросферы могут обычно быть изготовлены с относительно коротким сроком хранения, т.е. способными к биодеградации для преодолевания вышеуказанных проблем метаболизма в результате использования выбранных типов полимеров, этот признак (который в настоящее время регулируется параметрами изготовления) не является недостатком в коммерческом плане, так как либо микропузырьки могут храниться и транспортироваться в сухом виде, что представляет собой условие, при котором они стабильны неопределенно долгое время, или же мембрана может быть выполнена практически непроницаемой для жидкости-носителя, когда разложение начинает происходить только после инъецирования. В первом случае микрошарики, поставляемые в форме сухого порошка, просто смешивают с частью носителя в водной фазе до применения, причем эта часть выбирается в зависимости от необходимости. Отметим, что это является дополнительным преимуществом по сравнению с веществами по уровню техники, так как концентрация может быть выбрана по желанию, и начальные значения, далеко превосходящие вышеуказанные 10⁸ мл, т.е. в диапазоне от 10⁵ до 10¹⁰, легко доступны. Необходимо отметить, что предложенный способ позволяет регулировать пористость в широких пределах; следовательно, микросферы с практически непроницаемой мембраной могут быть легко приготовлены, являясь стабильными в форме суспензий в водных жидкостях, могут продаваться на рынке также в таком виде.

Микросферы с мембранами из осажденных на поверхности раздела полимеров, как определено в п.1 формулы, хорошо известны в данной области, но при заполнении их жидкостью. Они обычно могут получаться в результате эмульгирования в капельки (размер которых регулируется в зависимости от параметров эмульгирования) первой водной фазы в органическом растворе полимера, с последующим диспергированием этой эмульсии во второй водной фазе и последующим выпариванием органического растворителя. Во время выпаривания летучего растворителя полимер осаждается на поверхности раздела на границе капелек и образует микропористую мембрану, которая эффективно ограничивает заключенную в капсулу первую водную фазу от окружающей второй водной фазы. Эта технология, хотя и возможная, не является предпочтительной в настоящем изобретении. В качестве альтернативы, можно эмульгировать с помощью эмульгатора гидрофобную фазу в водной фазе (обычно содержащей повышающие вязкость вещества в качестве стабилизаторов эмульсии), в результате чего получают водно-масляную эмульсию из капелек этой гидрофобной фазы и после этого к ней добавляют мембранообразующий полимер, растворенный в летучем органическом растворителе, несмешиваемом с водной фазой.

Если этот полимер нерастворим в гидрофобной фазе, он осядет в виде поверхности раздела на границе между капельками и водной фазой. В противном случае испарение летучего растворителя приведет к образованию указанной нанесенной в виде поверхности раздела мембраны вокруг капелек эмульгированной гидрофобной фазы. Последующее выпаривание заключенной в капсулу летучей гидрофобной фазы приводит к получению заполненных водой микросфер, окруженных нанесенными в виде поверхности раздела полимерными мембранами. Эта технология, которую целесообразно использовать в настоящем изобретении, описана К.Уно и др. в Microencapsolation 1 (1984), 3-8 и K.Makino et al., Chem. , Pharm. Bull. 33 (1984), 1195-1205. Как сказано выше, размер капелек может регулироваться изменением параметров амульгирования, т.е. природы эмульгатора (чем более гидрофильно-липофильный баланс, тем меньше капельки) и условий перемешивания (чем быстрее и более энергично перемешивание, тем меньше капельки).

В другом варианте полимер, образующий стенку на поверхности раздела, растворяется в самой исходной гидрофобной фазе; последняя эмульгируется в капельки в водной фазе, и мембрана вокруг капелек образуется после последующего выпаривания этой заключенной в капсулу гидрофобной фазы. Пример этого приведен авторами J.R. Farnand et al. Poweler Technology 22 (1978), 11-16, которые эмульгируют раствор полимера (например, полиэтилена) в нафталине в кипящей воде, затем после охлаждения они извлекают нафталин в виде суспензии заключенных в полимер микрошариков в холодной воде и, наконец, они удаляют нафталин, подвергая микрошарики сублимированию, в результате чего получают микропузырьки размером 25 мкм. Существуют другие примеры, в которых полимер растворяется в смешанной гидрофобной фазе, содержащей летучий гидрофобный органический растворитель и водорастворимый органический растворитель, затем этот раствор полимера эмульгируют в водной фазе, содержащей эмульгатор, посредством чего водорастворимый полимер диспергирует в водную фазу, способствуя таким образом получению эмульсии из микрокапелек гидрофобной фазы и побуждая полимер осаждаться на поверхности раздела; это описано в Европейском патенте N 274961 (Х.Фесси).

Вышеупомянутая технология может быть приспособлена для приготовления заполненных воздухом или газом микропузырьков, пригодных для ультразвукового получения изображений, при условии, что будут найдены соответствующие условия для регулирования размера сферы в требуемых пределах, проницаемости или непроницаемости и замены заключенной в капсулу жидкой фазы воздухом или выбранным газом. Регулирование общего размера сфер важно для приспособления микропузырьков к целям применения, т.е. инъецированию или оральному приему. Условия размеров для инъецирования (средний размер от 0,5 до 10 мкм) были обсуждены ранее. Для орального применения диапазона может быть намного шире, при этом считается, что пригодность к эхографии возрастает с размером; следовательно, можно использовать микропузырьки в нескольких диапазонах в пределах от 1 до 1000 мкм в зависимости от необходимости и при условии, что мембрана достаточно эластична, чтобы не прорваться во время прохождения в желудке и кишечнике. Регулирование проницаемости стенки ячейки важно для обеспечения того, что инфильтрация инъецируемой фазой водного носителя отсутствует или достаточно медленна для того, чтобы ухудшить эхографические измерения, но в ряде случаев еще существенна для обеспечения относительно быстрой способности к биологическому разложению после испытания, т.е. легкую метаболизацию суспензии организмом. Таким же образом микропористая структура оболочки микропузырьков (поры от нескольких нанометров до нескольких сотен нанометров для оболочки микропузырьков) с толщиной в пределах от 50 до 500 нм) является фактором упругости, т.е. микросферы могут легко воспринимать колебания давления без разрушения. Предпочтительный диапазон размеров пор составляет примерно 50-2000 нм.

Условия для достижения этих результатов удовлетворяются в результате использования метода, описанного в пунктах 17, 18 и в последующих пунктах формулы изобретения.

Один фактор, который позволяет регулировать проницаемость мембраны микропузырьков - это скорость выпаривания гидрофобной фазы относительно скорости выпаривания воды в ходе этапа (4) способа по п.17 формулы, например, в условиях сушки из замороженного состояния, что является случаем варианта осуществления, изложенного в п.20 формулы изобретения. В частности, если выпаривание осуществляется между примерно -40 и 0^oC и используется гексан в качестве гидрофобной фазы при полистироле, представляющем собой нанесенный на поверхности раздела полимер, получают шарики с относительно большими порами; это происходит потому, что давление пара углеводорода в выбранном температурном диапазоне значительно больше, чем давление пара воды, это значит, что разность давлений между внутренним и наружным в сферах будет стремиться к повышению размера пор в мембране сфер, в результате чего заключенный внутрь материал будет выпарен. Напротив, использование циклооктана в виде гидрофобной фазы (при - 17^oC давление пара такое же, что и давление воды) приведет к получению шариков с очень маленькими порами, так как разность давлений между внутренним и внешним сфер при выпаривании сведена к минимуму.

В зависимости от степени пористости микропузырьки по данному изобретению могут оставаться стабильными в водном носителе от нескольких часов до нескольких месяцев и давать воспроизводимые эхографические сигналы в течение длительного периода времени. В настоящее время в зависимости от выбранного полимера мембрана микропузырьков может быть выполнена практически непроницаемой при суспендировании в жидких носителях с соответствующими осмотическими свойствами, т. е. содержать растворенные вещества в соответствующих концентрациях. Необходимо отметить, что существование микропор в оболочке микропузырьков по данному изобретению, как оказывается, также находится во взаимосвязи с эхографической реакцией, т.е. если все другие факторы постоянны, микропористые пузырьки обеспечивают более эффективный эхографический сигнал, чем соответствующие непористые пузырьки. Причина неизвестна, но можно предположить, что когда газ находится в резонансе в замкнутой структуре, амортизирующие свойства последней могут быть различны, если она пористая или непористая.

Другие неводные растворимые органические растворители, которые имеют давление пара того же порядка при температурах между примерно -40^oC и 0^oC, пригодны в качестве гидрофобных растворителей в данном изобретении. Они включают углеводороды, такие как, в частности, н-октан, циклооктан, диметил-циклогексан, этил-циклогексан, 2-, 3- и 4- метил-гептан, 3-этил-гексан, толуол, ксилол, 2-метил-2-гептан, 2,2,3,3- тетраметилбутан и т.п. Сложные эфиры, такие как пропил- и изопропилбутират и изобутират, бутил-формиат и т. п. также пригодны в данном ряду. Другое преимущество сушки из замороженного состояния заключается в работе при пониженном давлении газа вместо воздуха, в результате чего будут получены микропузырьки, заполненные газом. Физиологически приемлемые газы, такие как CO₂, N₂O, метан, фреон, гелий и другие редкие газы, являются возможными. Газы с активностью радиоактивного индикатора могут быть рассмотрены.

В качестве летучего растворителя, нерастворимого в воде, который должен использоваться для растворения полимера, который должен осаждаться на поверхности раздела, можно привести галоидные соединения, такие как CCl₄, CH₃Br, CH₂Cl₂, хлороформ, фреон, низкокипящие сложные эфиры, такие как метил, этил и пропилацетат, такие как и низкие простые эфиры, и кетоны с низкой водорастворимостью. Когда используются неполностью нерастворимые в воде растворители, например простой диэтиловый эфир, в качестве водной фазы целесообразно использовать водный раствор, насыщенный указанным ранее растворителем.

Водная фаза, в которой эмульгируется гидрофобная фаза, так как масляно-водная эмульсия предпочтительно содержит 1-20 вес.% водорастворимых гидрофильных соединений, таких как сахара и полимеры в виде стабилизаторов, например поливиниловый спирт (ПВС), поливинил-пирролидон (ПВП), полиэтиленгликоль (ПЭГ), желатин, полиглутаминовая кислота, альбумин и полисахариды, такие как крахмал, декстран, агар, ксантан и тому подобное. Подобные водные фазы могут быть использованы в качестве жидкости-носителя, в которой микропузырьки переводят в суспензию до применения.

Часть этого водорастворимого полимера может остаться в оболочке микропузырьков, или же он может быть удален промывкой шариков до воздействия на них конечным выпариванием заключенной в капсулу фазы из гидрофобной сердцевины.

Эмульгаторы, которые должны использоваться (0,1-5% мас.) для получения водно-масляной эмульсии гидрофобной фазы в водной фазе включают большинство физиологически приемлемых эмульгаторов, в частности яичный лецитин, или лецитин из соевых бобов, или синтетический лецитин, такой как насыщенные синтетические лецитины, например димиростоил-фосфатидил-холин, дипальмитоил-фосфатидил-холин, или дистеароил-фосфатидил-холин, или ненасыщенные синтетические лецитины, такие как диолеил-фосфатидил-холин или дилинолеил-фосфатидил-холин. Эмульгаторы также включают в себя поверхностно активные вещества, такие как свободные жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот с полиоксиалкиленовыми соединениями, такими как полиоксипропиленгликоль и полиоксиэтиленгликоль; простые эфиры жирных кислот с полиоксиалкилированным сорбитаном; мыла; глицерин-полиалкилен-стеарат; глицерин-полиоксиэтилен-рицинолеат; гомо- и сополимеры полиалкиленгликолей; полиэтоксилированное соевое масло и касторовое масло, также как и гидрогенизированные производные; простые и сложные эфиры сахарозы или других углеводов с жирными кислотами, жирными спиртами, причем последние могут быть полиоксиалкилированы; моно-, ди- и триглицериды насыщенных и ненасыщенных жирных кислот; глицериды или соевое масло и сахароза.

Полимер, который составляет оболочку или ограничивающую мембрану инъецируемых микропузырьков, может быть выбран из большинства гидрофильных, биоразлагаемых физиологически совместимых полимеров. Среди таких полимеров можно привести полисахариды с низкой водорастворимостью, полилактиды и полигликолиды и их сополимеры, сополимеры лактидов и лактонов, таких как -капролактон, -валеролактон, полипептиды и белки, такие как желатин, коллаген, глобулины и альбумины. Большая разносторонность в выборе синтетических полимеров - это другое преимущество настоящего изобретения, так как, в случае с пациентами-аллергетиками может возникнуть необходимость избежать использование микропузырьков, выполненных из натуральных белков (альбумин, желатин), как в патентах США N 4276885 или Европейском патенте N 324938. Другие подходящие полимеры включают поли-(орто) эфиры (см., в частности патент США N 4093709; патенты США N 4131648; 4138344; N 4180646); полимолочная и полигликолевая кислоты и их сополимеры, в частности ДЕКCOН (см. I. Heller, Biomaterials (1980), 51; поли(DL- лактид-ко- -капролактон), поли(DL -лактид- со- -валеролактон), поли (DL - лактид-со- - бутиролактон), полиалкилцианоакрилаты; полиамиды, полигидроксибутират; полидиоксаноне; поли- - аминокетоны (Polymer 23 (1982), 1693); полифосфазены (Science 193 (1976), 1214); и полиангидриды. Ссылки на биоразлагаемые полимеры могут быть найдены в R. Langer et. al, Macromol. Chem. Phys. C23 (1983), 61-126). Полиаминокислоты также, как полиглутамовая и полиаспаргиновая кислоты, также могут быть использованы вместе с их производными, т.е. частичные сложные эфиры с низшими спиртами или гликолями. Полезным примером таких полимеров является поли-(трет. бутил-глутамат). Сополимеры с другими аминокислотами, такими как метионин, лейцин, валин, пролин, глицин, аламин и т.д. также возможны. Недавно несколько новых производных полиглутамовой кислоты и полиаспаргиновой кислоты с регулируемой биоразлагаемостью были описаны (см. WO87/03891; патент США N 4888398 и Европейский патент N 130935, включенные в данную заявку в виде ссылки). Эти полимеры (и сополимеры с другими аминокислотами) имеют формулу следующего типа: -(NH-CHA-CO)_x(NH-CHX-CO)_y где X обозначает боковую ветвь аминокислотного остатка, а A обозначает группу формулы - (CH₂)_пCOOR¹R²-OCOR (II), где R¹ и R² обозначают H или низшие алкилы, а R обозначает алкил или арил; или R и R¹ соединены вместе с помощью замещенного или незамещенного связывающего элемента для получения колец с 5 или 6 элементами.

Также может обозначать группу формулы: -(CH₂)_nCOO-chr¹COOR (I) и -(CH₂)_nCO(NH-CHX-CO)_mNH-CH(COOH)- (CH₂)_pCOOH (III) и соответствующие ангидриды. Во всех этих формулах n, m и p являются низшими целевыми числами (не превышающими 5), а x и y также являются целыми числами, выбранными как имеющие молекулярные веса не ниже 5000.

Вышеупомянутые полимеры пригодны для получения микропузырьков согласно данному изобретению и в зависимости от природы заместителей R, R¹, R² и X свойства мембраны могут регулироваться, в частности прочность, эластичность и биоразлагаемость. В частности, X может представлять собой метил (аланин), изопропил (валин), изобутил (лейцин и изолейцин), бензил (фенилаланин).

Добавки могут быть введены в полимерную стенку микрошариков для изменения физических свойств, таких как диспергируемость, эластичность и водопроницаемость. Для включения в полимер добавки могут быть растворены в несущей полимер фазе, например гидрофобной фазе, которая должна быть эмульгирована в водной среде, в результате чего они будут соосаждаться с полимером во время образования мембраны межповерхностного раздела.

Среди полезных добавок можно указать соединения, которые могут "гидрофобизировать" мембрану микрошариков с целью снизить водопроницаемость, такие как жиры, парафины и высокомолекулярные углеводороды. Добавки, которые улучшают диспергируемость микрошариков в инъецируемом носителе-жидкости, представляют собой амфипатические соединения, такие как фосфолипиды; они также увеличивают водопроницаемость и скорость биоразлагаемости.

Не разлагаемые биологически полимеры для изготовления микрошариков, предназначенных для использования в пищеварительном тракте, могут быть выбраны из большинства водонерастворимых, физиологически приемлемых, биологически стойких полимеров, включая полиолефины (полистирол), акриловые смолы (полиакрилаты, полиактилонитрил), сложные полиэфиры (поликарбонат), полиуретаны, полимочевину и их сополимеры. Предпочтительным сополимером является АБС (акрил-бутадиен-стирол).

Добавки, которые увеличивают эластичность мембран, представляют собой пластификаторы, такие как изопропилмиристат и тому подобное. Таким же образом очень полезные добавки представлены полимерами, родственными полимерами самой мембраны, но с относительно малым молекулярным весом. В частности, при использовании сополимеров полимолочного/полигликолевого типа в качестве образующего мембрану материала, свойства мембраны могут быть изменены выгодным образом (увеличенная мягкость и способность к биоразложению) путем введения в качестве добавок низкомолекулярных (от 1000 до 15000 Дальтон) полигликолидов или полилактидов. Также полезной смягчающей добавкой является полиэтиленгликоль с умеренным до низкого молекулярным весом (например, ПЭГ 2000).

Количество добавок, которые должны быть введены в полимер, образующий нанесенную на поверхность раздела мембрану микрошариков по настоящему изобретению, чрезвычайно переменно и зависит от потребности. В некоторых случаях не используют никаких добавок; в других случаях количества добавок, которые могут достичь примерно 20 мас.% от полимера, являются возможным.

Инъецируемые микрошарики согласно настоящему изобретению могут храниться в сухом виде в присутствии или при отсутствии добавок для улучшения сохранности и для предупреждения слипания. В качестве добавок можно выбирать от 0,1 до 25 мас.% водорастворимых физиологически приемлемых соединений, таких как маннитол, галактоза, лактоза или сахароза, или гидрофильные полимеры, такие как декстран, ксантан, агар, крахмал, поливинилпирролидон, полиглутамовая кислота, поливиниловый спирт (ПВА), альбумин и желатин. Полезный срок годности микропузырьков в инъецируемой фазе с жидким носителем, т.е. период, в течение которого отмечаются полезные эхографические сигналы, может регулироваться и продолжаться от нескольких минут до нескольких месяцев в зависимости от необходимости; это может быть достигнуто путем регулирования пористости мембраны от практической непроницаемости по отношению к жидким носителям до пористости с размерами пор от нескольких нанометров до нескольких сот нанометров. Эта степень пористости может регулироваться наряду с выбором соответствующего образующего мембрану полимера и полимерных добавок путем изменения скорости выпаривания и температуры в стадии (4) способа по п. 17 формулы изобретения и выбора соответствующего соединения (или смеси соединений), образующего гидрофобную фазу, т.е. чем больше разность его парциального давления выпаривания и разности парциального давления испарения водной фазы, тем крупнее будут поры в мембране микрошариков. Это регулирование путем подбора гидрофобной фазы может быть далее улучшено путем подбора стабилизаторов и путем изменения их концентрации с целью регулирования скорости испарения воды во время изготовления микрошариков. Все эти вариации могут быть легко осуществлены специалистами в данной области.

Необходимо заметить, что хотя микрошарики по данному изобретению могут продаваться в сухом виде, в частности, когда они разработаны с ограниченным сроком действия после инъецирования, может быть желательным также продавать готовые препараты, т.е. суспензии из микрошариков в водном жидком носителе, готовые для инъецирования или орального введения. Это требует, чтобы мембрана микрошариков была практически непроницаема (по крайней мере в течение нескольких месяцев или более) к жидкости-носителю. Такие условия могут быть легко достигнуты с помощью метода по настоящему изобретению при должном выборе полимера и параметров нанесения на поверхности раздела. Были найдены необходимые параметры (в частности, при использовании полиглутамового полимера (где A - это группа формулы I), а циклооктан представляет собой гидрофобную фазу), так что пористость мембраны после испарения гидрофобной фазы получается настолько незначительна, что микрошарики практически непроницаемы к водной жидкости-носителю, в которой они суспендированы.

Предпочтительный вводимый препарат для диагностических целей содержит суспензию в буферизированном (или без буфера) соляном растворе (0,9% водного NaCl) буфер 10 мм трис-HCl), содержащем от 10⁸ до 10¹⁰ пузырьков на 1 мл. Он может быть приготовлен главным образом согласно рекомендациям нижесл