Соединения на основе реакции амадори, их применение, способ получения и составы на их основе

Соединения на основе реакции амадори, их применение, способ получения и составы на их основе

Реферат

 

Изобретение относится к химии, медицине и фармакологии. Предложены новые составы или комбинации известных составов на основе реакции Амадори формулы R₁-NH-R₂, где R₁ включает D-форму 1-амино-1-деокси-2-кетозрадикала, производного сахаридного радикала, выбранного из группы глюкозы, галактозы, рамнозы, фруктозы, маннозы, 6-деоксиглюкозы и гликозамина или олиго- и полисахаридов, а R₂ включает L-форму аминокислоты или радикал пептида в качестве активного начала фармацевтических препаратов со свойствами продуцирования интерферона и других цитокинов. Косметические композиции на основе вышеуказанных составов используются для клеточного питания, для регенерации тканей и/или для иммуномодулирования. Изобретение расширяет арсенал средств указанного назначения. Предложен также способ получения смеси иммунотропных соединений на основе перегруппировки Амадори. 3 с. и 11 з.п.ф-лы, 4 табл., 6 ил.

Изобретение относится к соединениям на основе реакции Амадори, получаемым на их основе составам, к способу получения продукции из них, а также к новому способу применения этих составов и их продуктов, которые по крайней мере частично прошли перегруппировку Амадори согласно следующей схеме реакции и/или по реакции Майяра: Известны продукты реакции Амадори, такие, как например, продукты реакции аминокислоты или гликопептида с олиго- или полисахаридом, прошедшие перегруппировку Амадори (J.Biol.Soc.215 (1955) Henri Boreook et al.).Так, например, в патенте ФРГ DE-C- 3914354 описан водорастворимый гликопротеин аминокислоты и сахар, который выделен из экстракта семян Avena sativa. Далее в патенте ЕР-А-406087 описаны водорастворимые комплексные соединения сахаридов с гликопептидами, полученные из клеточных стенок грамположительных бактерий, а в журнале J.Biol.Chem.1965, 260/9 описано использование нанометровой спектроскопии для характеристики продуктов реакции Амадори, образующихся при реакции глюкозы со свободными аминогруппами протеина.

Настоящее изобретение относится к специфическому новому соединению на основе перегруппировки Амадори в соответствии с пунктом 1 формулы и преимуществами, изложенными в пунктах формулы 2-4.

Эти соединения восстанавливают феррицианид калия, причем контрольная тест-реакция для биологически активных веществ производится при реакции сахара и аминокислоты.

Изобретение также относится к новому применению таких соединений и в то же время к новому способу применения продуктов реакции Амадори, в частности сахаров и аминокислот, описанных в п.11-17 формулы изобретения. Ранее никем не проводилось тестирования на биологическую активность различных стадий очищения экстракта продукта реакции Амадори (для удаления балластных веществ и загрязнений).

Известны иммуностимулирующие лекарственные препараты, получаемые из натуральных продуктов, например экстракты из омелы белой, из торфа и т.п., основной недостаток использования которых заключается в необходимости дорогостоящей обработки большого количества сырья для получения нескольких граммов активного вещества. К тому же неподдающиеся контролю загрязнения могут оказывать токсичное действие и вызывать побочные эффекты и вследствие этого при практическом применении зачастую нелегко применить препарат из-за его сложных свойств и трудновоспроизводимого состава.

Производство подобных сопоставимых продуктов или их смеси, получаемых из искусственных веществ, например интерферона, а также другими методами генной инженерии, являются еще более дорогостоящим.

Кроме того, молекулы интерферона человека зачастую слишком велики, чтобы проникнуть через стенку человеческой клетки, поэтому эффективное действие оказывает только часть назначаемой дозы. К тому же, продукты генной инженерии обычно оказывают побочные действия, а некоторые даже являются токсичными. Более того, по причинам, неизвестным до настоящего времени, некоторые из них в один день оказывают эффективное действие и нейтральное - на следующий день.

Неожиданно было обнаружено, что почти любой простой комплекс аминокислота/сахар после по крайней мере частичной перегруппировки Амадори не обнаруживает ни одного из вышеупомянутых недостатков, а напротив приобретает удивительно высокую иммунологическую активность.

Вследствие этого их можно использовать в фармацевтических составах и в косметике. Эти малые молекулы легко проникают через стенку клетки и фактически действуют как питательное вещество. Они индуцируют образование естественного интерферона и других цитокинов, включая фактор некроза опухоли. Даже через три дня после назначения препарата они все еще обнаруживают этот эффект стимуляции биологической активности. Этот эффект возрастает по мере завершения перегруппировки и затем снижается в ходе декомпозиции комплекса.

Вместо простых сахаров, предпочтительно с низким молекулярным весом, в частности, менее 1000 дальтон, также можно использовать полисахариды аналогичной реакции, например декстран. Полисахариды обладают биологической активностью и могут сохранять некоторые виды такой активности даже после того, как они превращаются в олигосахариды.

До настоящего времени было очень мало известно о биологической активности этих составов. Было обнаружено, что комбинации этих веществ при взаимодействии с лейкоцитами человека вырабатывают интерферон и другие цитокины. Это явление называется поликлональной активацией клеток.

Можно протестировать вещества, вырабатываемые под действием этих составов, и определить в международных единицах измерения их биологическую активность по отношению к определенным цитокинам.

Эти составы обладают особенно высокой биологической активностью в пределах концентраций чистого вещества от 1 до 100 мг/мл. На уровне молекулы специфические свойства аминокислоты имеют более важное значение, чем свойства сахарной части молекулы.

Продукты реакции L-аспарагиновой кислоты с глюкозой или галактозой, прошедшие перегруппировку Амадори, при взаимодействии с лейкоцитами человека и инкубированные в среде тканевой культуры при 37^oC в течение 20 часов в 5% CO₂, вырабатывают от 30 до 1000 антивирусных единиц интерферона.

Интерферон анализировали посредством биопроб с раковыми клетками человека. Под действием этих составов могут вырабатываться также составы некроза опухоли.

Продукты, дающие возможность такого неожиданного применения, имеют общую формулу: R'₁-NH-R₂ где R'₁ - 1-амино-1-деокси-2-кентоз-радикал, производный группы простых сахаров, олиго- и полисахаридов предпочтительно низкомолекулярного веса, в частности менее 1000 дальтон.

R'₂ - аминокислота или радикалы пептида, предпочтительно низкомолекулярные, в частности ниже 1000 дальтон.

Таким образом, группа биологически активных соединений может включать как описанные выше специфические соединения перегруппировки Амадори, так и N-замещенные производные ряда различных составов аминокислот и один простой сахар, олиго- или полисахарид, предпочтительно низкомолекулярного веса, в частности меньше 1000 дальтон, или N-замещенные производные одного состава аминокислоты и ряд простых сахаров, олиго- и/или полисахариды, либо другую комбинацию таких производных, причем каждый из них обладает достаточной биологической активностью.

Предпочтительно, чтобы R'₁ в вышеприведенной формуле был радикалом, выбранным из простых сахаров D-формы, в частности (но не обязательно) из глюкозы D-формы, ксилозы, галактозы, рамнозы, фруктозы, маннозы, G-деоксиглюкозы, глюкозамина и галактозамина, R'₂ - был радикалом, выбранным из составов аминокислот L-формы, таких, как серин, глицин, гистидин, аргинин, глутамин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, фенилаланин, треонин, цистеин, цистин, метионин, гидроксипролин, триптофан, пролин, валин, изолейцин, лейцин и лизин либо другие пептиды этих аминокислот в любой комбинации.

Изобретение также относится к способу получения упомянутых составов и продуктов, описанных в п.5 формулы изобретения, посредством которого получают промежуточный продукт формулы R'-NH-R'' где R' - G-деокси-радикал в прямой карбоновой цепочке, или любой из простых сахаров O-мостообразной формы, либо олиго- или полисахариды, и R''-аминокислота или радикал пептида, причем данный промежуточный продукт по крайней мере частично подвергается перегруппировке Амадори и/или реакции Майяра посредством длительного нагревания реакторной смеси, предпочтительно под давлением, и одновременного или последовательного удаления растворителей.

Предпочтительный вариант осуществления процесса по настоящему изобретению описан в пунктах 6-10 формулы.

В некоторых случаях, особенно при использовании аминокислоты, имеющей две карбоксильные группы, желательно применение буферной соли, например, бикарбоната натрия, предпочтительно в молярном соотношении 1:1.

Также было обнаружено, что продукты перегруппировки Амадори достаточно чувствительны к разложению и что продукты разложения имеют смолообразную консистенцию и темно-коричневый цвет, причем не поддающиеся определению составы теряют биологическую активность. Вследствие этого предпочтительно остановить реакцию перегруппировки Амадори на стадии, когда реакционная смесь приобретает слабый оранжево-коричневый оттенок.

Следует отметить, что промежуточные продукты реакции, образующиеся, когда первоначально непрозрачный раствор аминокислоты становится чистым (до перегруппировки Амадори), легко гидролизуются, т.е. реакция является обратимой.

По мере перегруппировки обратимость уменьшается, т.к. продукты становятся более стабильными, а цвет постепенно изменяется от светло-желтого до светло-оранжевого и наконец - до оранжево- коричневого по окончании перегруппировки Амадори. Взятые во время реакции перегруппировки Амадори образцы подвергали тестированию (согласно различным описанным ниже процедурам), при этом были получены доказательства возрастания биологической активности по мере прохождения реакции Амадори и ее уменьшения, если дальнейшее нагревание приводит к разложению, показателем которого является изменение цвета до темно-коричневого.

Мгновенная редукция феррицианида и происходящее в результате изменение цвета происходит в случае, если реакционная смесь содержит другие кето-группы и/или серосодержащие аминокислоты, например цистеин; в других случаях это протекает в течение от 3 до 5 мин, что позволяет легко контролировать степень прохождения перегруппировки Амадори. Не вступающие в реакцию сахара выявляют изменения цвета только спустя полчаса или даже несколько часов.

Выделение чистых продуктов перегруппировки Амадори производится согласно известным способам, основанным на связывании смеси сильными катионообменниками, такими как Amberlite^(R) или Dowex^(R), последующей элюацией с аммонийной водой, выпаривании под давлением определенных выбранных фракций элюата и кристаллизации чистого состава из ангидроз метанола (J.E.Hodge and B.E. Fisher, Mtthods in Carbohydrate Chemistry, Vol.II, Reactions of Carbohydrates, Academic Press, N.Y., London, 1963, page 105-106; or Borsook at al. as quoted earller; or J.Dubourg and P.Devilliers).

В способе по настоящему изобретению сохраняются без изменения все вышеупомянутые преимущества, касающиеся радикалов, полученных из простого сахара и аминокислотных составов. Вдобавок смесь субстратов сахаров предпочтительно содержит D-формы глюкозы, ксилозы, галактозы, рамнозы и фруктозы в весовом соотношении приблизительно 20:10:4:1:1, а смесь субстратов аминокислот предпочтительно включает L-формы серина, глицина, гистидина, аргинина, пролина, тирозина, валина, лейцина, изолейцина и лизина в весовом соотношении 20.5:35.6:35.8:132:180:360:216:160:72:68:780.

Как уже упоминалось, продукты перегруппировки Амадори способны редуцировать феррицианид калия, причем такая контрольная химическая реакция дает возможность быстро определять биологическую активность составов, получаемых при реакции сахара и аминокислоты.

Было обнаружено, что продукты реакции особенно активны, когда смесь простых сахаров такой же композиции и весового соотношения, как и в натуральных экстрактах торфа, вступает в реакцию со смесью составов аминокислот такой же композиции и такого же весового соотношения, как в натуральных экстрактах торфа в присутствии водного растворителя, предпочтительно при добавлении низшего спирта, а также произвольных неорганических микроэлементов, присутствующих в натуральных экстрактах торфа. Реакция протекает под произвольным давлением при повышенной температуре. Далее нагревание продолжают для завершения перегруппировки Амадори у полученных продуктов, затем одновременно или последовательно удаляют растворители и прекращают реакцию перегруппировки на стадии, когда реакционная смесь приобретает слабый оранжево- коричневый цвет, после чего полученные продукты высушивают и очищают при помощи колоночной хроматографии, затем собирают фракции, тем самым обеспечивая максимальную редукцию феррицианида калия.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения быстродействующие фармацевтические составы содержат в качестве активного ингредиента по меньшей мере один продукт реакции формулы R'₁-NH-R'₂ или специфический состав формулы R₁-NH-R₂ с фармацевтически допустимым носителем и/или произвольное смазочное средство в весовом отношении активного ингредиента к остальным компонентам в диапазоне от 1:1 и 1:100, предпочтительно от 1:8 до 1:20, а наиболее предпочтительно около 1:9.

Другой обладающий преимуществами изобретения фармацевтический состав содержит в дополнение к активному ингредиенту также лактозу и смазочное средство, причем весовое соотношение лактозы к смазочному средству составляет диапазон от 20:1 и 100:1, предпочтительно 50:1.

Эти фармацевтические препараты применяют для лечения и/или предупреждения гематологических и/или иммунологических заболеваний, а также стимуляции иммуносистемы человека и/или животных посредством введения формации цитокина.

Другой областью применения активных ингредиентов являются косметические препараты. В таких препаратах активный ингредиент содержится в количестве 0,01-10% по весу, предпочтительно 0,01-1% по весу, и в частности 0,05-0,1%. Эти косметические составы содержат, помимо активного ингредиента, обычные носители, адъюванты, обогатительные компоненты и/или ароматические средства.

Далее настоящее изобретение подробно изложено и иллюстрировано следующими примерами, которые ни в коей мере не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. В горячую водяную баню помещали колбу вращательного испарителя объемом 25 мл, наполненную смесью следующего состава: 1,47 г (0,01 М) - L-глутаминовая кислота; 0,84 г (0,01 М) - NaHCO₃; 0,91 г - D-глюкоза; 0,91 г - галактоза и 3,00 мл - дважды дистиллированная вода.

Смесь нагревали до 80^oC при пониженном давлении до степени выпаривания 50%, затем при атмосферном давлении продолжали нагревание до температуры 80-85^oC, при которой смесь выдерживали в течение 120 мин, пока она не приобретала оранжевый цвет. Затем сиропообразный концентрированный водный раствор высушивали при пониженном давлении. Полученный твердый продукт реакции оранжево-красного цвета помечали как D-10 и сохраняли для биологических тестов.

Пример 2. В горячую водяную баню помещали колбу вращательного испарителя объемом 25 мл, наполненную смесью следующего состава: 1,33 г (0,01 М) - L-аспарагиновая кислота; 0,84 г (0,01 М) - NaHCO₃; 0,91 г - D-глюкоза; 0,91 г - галактоза; 3,00 - дважды дистиллированная вода.

Смесь нагревали до 80^oC при вращательном перемешивании, затем выпаривали под давлением до испарения 1,5 мл воды, далее обрабатывали при атмосферном давлении при температуре 80-85^oC до получения смеси слабого оранжевого цвета в течение 60 мин. Сиропообразный концентрированный водный раствор высушивали при пониженном давлении. Полученный в результате продукт реакции представлял собой сухой желто-оранжевый порошок. Его пометили как D-11 и сохранили для биологических тестов.

Пример 3. В горячую водяную баню помещали колбу вращательного испарителя объемом 25 мл, наполненную смесью следующего состава: 1,5 г (0,01 М) - L-серин; 0,91 г - D-глюкоза; 0,91 г - галактоза; 2,50 мл - дважды дистиллированная вода.

Смесь нагревали до 85-92^oC при вращательном перемешивании. Спустя 100 мин раствор приобретал оранжевый цвет. Давление уменьшали и смесь выпаривали до сухого состояния. На стенках сосуда появлялся прозрачный оранжевый слой продукта реакции, который соскребали и измельчали до состояния порошка, помечали как D-12 и сохраняли для биологических тестов.

Пример 4. В горячую водяную баню помещали колбу вращательного испарителя объемом 25 мл, наполненную смесью следующего состава: 0,66 г (0,005 М) - D-аспарагиновая кислота; 0,42 г (0,0005 М) - NaHCO₃; 0.45 г - D-глюкоза; 0,45 г - галактоза; 3,00 мл - дважды дистиллированная вода, Смесь нагревали до 80^oC, выпаривали под давлением объем воды 1,5 мл, затем обрабатывали при атмосферном давлении при температуре 85^oC. После нагревания в течение 60 мин смесь приобретала оранжевый цвет, давление уменьшали, а полученный в результате сиропообразный водный раствор выпаривали до сухого состояния. Чтобы полностью устранить влагу, перед окончательным высушиванием осадка в колбу дважды выводили по 10 мл безводного этанола и испаряли его. Полученный в результате сухой продукт измельчали до порошка, помечали как D-13 и сохраняли для биологических тестов.

Пример 5. Для получения синтетического эквивалента биологически активной фракции определенного натурального экстракта торфа в нагреваемую водяную баню помещали колбу ротационного испарителя, наполненную составом: 20,5 мг - L-серин; 35,8 мг - L-глицин; 35,8 мг - L-гистидин; 132,0 мг - L-аргинин; 180,0 мг - L-аланин; 360,0 мг - L-пролин; 216,0 мг - L-тирозин; 160,0 мг - L-валин; 68,0 мг - L-изолейцин; 72,0 мг - L-лейцин; 780,0 мг - L-лизин; 2000,0 мг - D-глюкоза; 1000,0 мг - D-ксилоза; 400,0 мг - D-галактоза; 100,0 мг - D-рамноза; 100,0 мг - D-фруктоза; 6,0 мл - дважды дистиллированная вода.

Смесь перемешивали вращением и нагревали под давлением в течение 45 мин при возрастании температуры от 75^oC до 86^oC. За этот период полностью выпаривали около 3 мл воды, а вещества полностью растворялись. Затем смесь обрабатывали в течение 30 мин при атмосферном давлении и температуре 85-86^oC для проведения перегруппировки Амадори. За этот период времени раствор быстро приобретал красно-коричневый цвет. Давление уменьшали, а нагревание до 84^oC продолжали, таким образом одновременно выпаривая растворители. В конце выпаривания вводили дважды по 15 мл безводного этанола, после чего реакционную смесь полностью высушивали. Колбу с высушенным продуктом реакции выдерживали в эксикаторе над хлоридом кальция в течение 18 часов. Затем измельчали до состояния порошка, в результате получали около 4,5 г порошка, который обозначили как EK₂-S.

Часть продукта реакции - 4 г - растворяли в 20 мл дистиллированной воды и помещали в колонку для хроматографии размером 25 мм х 330 мм, наполненную аналитически градуированным сорбентом Amberlite^(R) XAD-2. Колонку элюировали 0,4 мл/мин дистиллированной воды. Фракции объемом 10 мл были собраны общим объемом 450 мл. Содержимое фракции было подвергнуто хроматографическому мониторингу. Фракции последовательных номеров 11-13 были соединены и выпарены при пониженном давлении. Эти фракции характеризуются высоким содержанием продуктов перегруппировки Амадори (что подтверждено тестом на редукцию феррицианида калия). Продукт был сохранен для биологических тестов под маркировкой EK₂-S-11.

Биологические тесты для определения биологической активности проводили на иммунизированных 8-10-недельных мышах типа Balb/C обоих полов. Иммунизацию мыши осуществляли введением в брюшную полость 0,2 мл 10% суспензии эритроцитов овцы (SRBC), т.е. 610⁸ клеток. Эритроциты зафиксировали в стерильном растворе Альсевера в следующей композиции: глюкоза - 2,05 г; цитрат натрия - 0,8 г; хлорид натрия 0,42 г; лимонная кислота - 0,055 г; дважды дистиллированная вода - 100 мл.

В этот раствор Альсевера вводят асептический образец клеток крови овцы в соотношении 1: 1, затем смесь выдерживают не менее 3 дней при температуре +4^oC. Из стабилизированных таким образом эритроцитов затем отбирают асептические образцы и вводят в фосфатный буфер (PBS) для того, чтобы их промыть. Эритроциты дважды промывают раствором PBS, центрифугируют в течение 10 мин при 2000 об/мин. Вымытые клетки применяют в виде 10% суспензии в PBS. Такую суспензию используют для иммунизации мыши типа Balb/C.

Подлежащий тестированию образец вводили 4 раза внутрибрюшинно или орально в выбранной дозировке, причем первое введение проводили за 2 часа до иммунизации мыши раствором SRBC, а остальные три дозы были введены после иммунизации с интервалами в 24 часа.

Каждой группе тестируемых животных вводили различные дозы тестируемого продукта реакции: 10 мг/кг, 1 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,01 мг/кг. Контрольную группу животных также иммунизировали раствором SRBC, но вместо тестируемого вещества назначали 0,2 мл раствора PBS через такие же интервалы времени.

Каждая группа животных, как контрольная, так и тестируемая, во всех экспериментах включала 8-12 мышей.

На четвертый или (в случае определения антител типа 7S) на десятый день после иммунизации мышей подвергали легкой анестезии эфиром и обескровливали путем полного удаления глазного яблока. Кровь собирали в тестовые пробирки. Эту кровь использовали для получения сыворотки, необходимой для определения гемагглютинированных антител типа 19S+7S, а селезенку использовали для получения клеток, требуемых для определения процентного содержания клеток, способных к формированию Е-розеток и проявляющих гемолитическую активность. Для этой цели селезенки мышей измельчали в порошок. Полученные спленоциты суспендировали приблизительно в 2 мл среды по Hanks при температуре +4^oC и разделяли на слои плотностью 1.077 по градиенту Ficoll-Uropolin, затем центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин при +4^oC. После отделения промежуточной фазы слой лимфоцитов в буферном растворе помещали в среду no Hanks при +4^oC и промывали, центрифугируя дважды каждый раз при 1600 об/мин в течение 7-10 мин. Затем спленоциты суспендировали в 1 мл среды по Hanks до концентрации клеток 110⁶.

Для каждого теста процент погибших клеток определялся путем смешивания капли тестируемой суспензии спленоцитов с каплей раствора красителя, содержащего 4 части 0,2% трипанового синего и 1 часть 4,25% раствора NaCl. Для каждых 100 клеток под микроскопом определяли процент погибших спленоцитов. Погибшие клетки имеют цвет морской волны, в то время как живые клетки светлые. Критическим считается наличие более 10% погибших клеток и такой образец следует исключить из дальнейшего применения.

На всех этапах тестирование следует проводить в стерильном лабораторном сосуде из кварцевого стекла, помещенном в емкость со льдом.

Пример 6. В первом тесте было определено влияние тестируемых продуктов реакции на количество клеток, продуцирующих гемолитические антитела (PFC-lg М). Тест проводили следующим образом: 0.5 мл 5%-ного раствора агарозы, помещенного в пробирку для теста, находящуюся в нагреваемой водяной бане при 45^oC, смешивали с 0,1 мл 10%-ной суспензии SRBC (приготовленного, как описано выше). Затем добавляли 0,1 мл суспензии спленоцитов плотностью 1 10⁶ клеток/мл, смесь быстро перемешивали и немедленно выливали на предметные стекла, предварительно покрытые агарозой. Стекла инкубировали при 37^oC в течение 2 часов. Затем тестируемые образцы покрывают на 2 часа комплементом гвинейской свинки, разбавленным в соотношении 1:20. После инкубации тестируемых образцов комплементом подсчитывали число клеток, формирующих тромбоциты (PFC), и пересчитывали для 110⁶ спленоцитов. Каждый тест проводился дважды.

Наибольшее увеличение ответной реакции на SRBC, выраженной в возрастании числа спленоцитов, продуцирующих гемолизины lg М (PFC), наблюдали после введения дозы 0,1 мг/кг вещества D-11. Усиление ответной реакции составило 119%. При увеличении дневной дозы в 10 раз - до 1 мг/кг, ответная реакция понизилась до 53%. Наиболее высокую активность продукт реакции D-12 проявил при дозе 1 мг/кг - 58%-ное увеличение.

Продукт реакции EK₂-S-11 в этом тесте показал наиболее высокую активность при дозе 0,1 мг/кг (65%-ное увеличение). При дозе в 10 раз выше, т.е. 1 мг/кг, усиление составило до 52%.

Продукт реакции D-13, тестируемый при дозе 1 мг/кг, давал 40%-ное усиление. При увеличении дозы до 10 мг/кг, т.е. в 10 раз, ответная реакция составила только 14%.

Пример 7. Был также проведен тест на активность гемагглютинации, при котором определялись уровни анти-SRBC антител типа 19S+7S и типа 7S. Для определения уровня антител типа 19S-lg М приготавливали мышиную сыворотку на четвертый день после иммунизации мыши SRBC, а для определения уровня антител типа 7S-lg G сыворотка была приготовлена на десятый день после иммунизации мыши SRBC, который считается днем максимального количества антител данного типа в мыши, иммунизированной SRBC.

A. Порядок подсчета антител 19S+7S Образец крови центрифугировали в течение 30 мин при 3500 об/мин. От каждого приготовленного таким способом образца собирали сыворотку и помещали на 30 мин в подогреваемую до 56^oC водяную баню для деактивации комплемента. Далее из каждой тестируемой сыворотки приготавливали ряд растворов, имеющих несколько разных степеней разбавления (от 1:1 до 1:4096), применяя прибор для микротитрирования и U-образные микрочашки объемом по 20 мл каждая. Разбавленную сыворотку инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. В каждую сыворотку добавляли каплю 1%-ной суспензии SRBC в PBS (приготовленной, как описано выше), затем смесь инкубировали в течение 2 часов при температуре 37^oC и хранили при температуре +4^oC. Результаты проверяли на следующий день. Степень максимального разбавления, при котором все еще происходит гемагглютинация, определялась путем подсчета антител. Появление кольца на дне чашки является доказательством проходящей гемагглютинации. На отсутствие гемагглютинации указывает наличие бляшкоподобных образований на дне чашки, что принимается за отрицательный результат.

Для статистического анализа результатов увеличение разбавления сыворотки в тестируемом веществе сравнивали с аналогичным в контрольной группе.

Продукт реакции D-11 при дозе 1 мг/кг увеличил количество Ig М в 2,57 раз. Увеличенная в десять раз доза стимулировала воздействие в 3,5 раза по сравнению с контрольной группой.

Продукт реакции в этом тесте D-12 в этом тесте показал более слабое воздействие. При дозе 0,1 мг/кг он вызвал увеличение количества иммуноглобулина М (Ig М) в 2 раза, а при дозе 1 мг/кг - в 1,4 раза.

Наиболее сильное воздействие в этом тесте обнаружил продукт реакции EK₂-S-11. при дозе 0,1 мг/кг он вызвал увеличение количества Ig М в 4,3 раза, а при дозе 1 мг/кг - в 3,6 раза.

Продукт реакции D-13 при дозе 1 мг/кг способствовал увеличению количества Ig М в 4,3 раза, а его десятикратная доза - в 3,6 раза.

В. Определение количества антител 7S Тестируемую неактивированную сыворотку соединяли в соотношении 1:1 с 0,1 М раствором 2-меркаптоэтанола и инкубировали в течение 30 мин при температуре 37^oC. 2-меркаптоэтанол разрушает иммуноглобулины типа 19S - (Ig М), в то время как иммуноглобулины типа 7S -(Ig G) не чувствительны к действию 2-меркаптоэтанола.

После 30-минутной инкубации реакцию редукции останавливали путем снижения температуры до +4^oC в течение 15 минут. Далее описанным выше способом приготавливали ряд разбавлений с учетом подсчета количества антител типа 19S, затем соединяли их с 1%-ной суспензией SRBC, после 2 часов инкубации при 37^oC образцы хранили при +4^oC. Оценку результатов производили на следующий день согласно изложенному выше критерию определения степени гемагглютиниции. Одновременно проводили контрольный тест с комбинацией 1%-ной суспензии SRCB с PBS в соотношении 1:1.

При тестировании вещества D-11, как описано выше, при дозе 1 мг/кг оно увеличивало продукцию антител Ig G в 3.16 раз. При дозе 10 мг/кг увеличение составило 2,2 раза.

Продукт реакции D-12, тестированный при дозе 0,1 мг/кг и 1 мг/кг, соответственно стимулировал продукцию антител Ig G в 1,3 раза, а доза 10 мг/кг - в 1,5 раза.

Продукт реакции EK₂-S-11 при дозе 0,1 мг/кг стимулирует продукцию Ig GB 1,9 раз, а при дозе 1 мг/кг - в 2,89 раз (по сравнению с контрольным).

Затем методом T-student (Т-стьюдент) при а=0,05 провели статистический анализ результатов тестов A и В, полученных для каждой партии продукции или для каждой фракции биологически активных продуктов реакции, синтезированных согласно изобретению и проявляющих вышеупомянутую иммунологическую реакцию. Результаты, полученные для каждой дозы, сравнивали с параллельным контрольным тестом и выявляли увеличение биологической активности.

Пример 8. Группу биологически активных продуктов реакции, полученных в соответствии с Примерами 1-5, также подвергали тестированию, в результате которого определяли процентное содержание Е-розеток, формирующих спленоциты.

250 мл 1%-ной суспензии SRBC и 250 мл подлежащих тестированию клеток в концентрации 110⁶ клеток/мл добавляли к 550 мл среды по Hanks. Затем каждый образец инкубировали в течение 15 мин при температуре 37^oC на водяной бане с подогревом и встряхиванием. Далее образцы выдерживали при температуре +4^oC в течение 20 часов. Процентное содержание Е-розеток, формирующих спленоциты, с SRBC определяли после окрашивания суспензии 1-3 каплями кристаллического красителя фиолетового цвета.

У каждого образца трижды определяли процентное содержание спленоцитов, получив долю каждого примера 400 спленоцитов. За Е-розетку принимали спленоцит, окруженный не менее чем тремя эритроцитами.

Для статистической оценки сравнивали процент увеличения числа спленоцитов с Е-розетками с тестируемыми веществами и контрольной группой.

При этом тестировании самый высокий эффект стимуляции выявили продукты реакции D-11 (63%) и EK₂-S-11 (70%) при дозе 1 мг/кг. При дозе, меньшей в 10 раз, т.е. 0,1 мг/кг, значения понизились соответственно до 45% и 57%.

Продукт реакции D-12 при дозе 1 мг/кг вызывает увеличение способности формирования Е-розеток на 22% по сравнению с контрольной группой. Соответствующее значение для дозы, меньшей в 10 раз, т.е. 0,1 мг/кг, составило 29%.

Продукт реакции D-13 проявляет максимальное действие при дозе 1 мг/кг, причем при более высоких дозах действие слегка снижается.

Биологическая активность синтезированных составов оценивалась согласно следующим тестам: 1. Тест для определения процентного содержания Е-розеток. формирующих спленоциты, проводимый по Bach and Dardenne (Cell. Immunol. 3, 1-16, 197-2).

2. Тест для определения числа клеток, продуцирующих гемолитические антитела Ig М-типа, проводимый по методу Jerne. модифицированному Mishell fnd Dutton (J. Exp. Med. 126, 423-442. 1967) и 3. Тест для определения степени гемагглютиниции антител 19S+7S, проводимый по методам активной гемагглютинации (J. Immunol. 95, 26-38, 39-47, 1965) с помощью микрочашек (J.lmmunopharmacol. 4, 43-52. 1982).

Пример 9. Помещенную в водяную баню с подогревом колбу ротационного испарителя наполняли следующим составом: 1,33 г (0,01 М) - L-аспарагиновая кислота; 0,84 г (0,01 М) - NaHCO₃; 10,00 г - гидролизированный декстран общего молекулярного веса 3000 дальтон; 10,00 мл - дважды дистиллированная вода.

Смесь нагревали под давлением при температуре 70^oC до полного растворения твердых веществ, удалив за это время с помощью дистилляции около 3 мл воды (время нагревания около 30 мин). Легко укутанную колбу с раствором поместили в паровой стерилизатор и нагревали в течение 40 мин под давлением до 121^oC. После охлаждения полученный желто-оранжевый раствор разбавляли 15 мл воды, очищали центрифугированием и высушивали сжатым воздухом с входной температурой +160^oC, а выходной + 85^oC. Полученные в результате реакции 10,5 г продукта светло-бежевого цвета были легко растворимы в воде.

Наличие продуктов перегруппировки Амадори в продукте реакции подтверждали по методу тестирования, описанному Borsook, Abrams and Lowy, J.Biol. Chem. 215. (1955), 111-124, а также методами хроматографии.

Описанные в предыдущих примерах биологические тесты подтверждают иммунологическую активность данного продукта, подобную той, которую обнаруживают препараты, получаемые с простыми сахарами.

Пример 10. Коническую колбу наполняли следующим составом: 5,0 г - гидролизированный декстран общего молекулярного веса около 5000 дальтон; 1.1 г - L-пролин; 4,0 мл - дважды дистиллированная вода.

Содержимое растворяли при перемешивании. Полученную однородную смесь помещали в паровой стерилизатор и нагревали в течение 40 мин под давлением при температуре 110^oC. Полученный прозрачный оранжевый раствор разбавляли 20 мл дважды дистиллированной воды и очищали на центрифуге. Очищенный раствор высушивали сжатым воздухом.

Получали 5,3 г продукта, легко растворимого в воде. Иммунотропная активность была подобна той, которую наблюдали при других экспериментах в соответствии с предыдущими примерами.

Все технологические параметры способа, подлежащие контролю, не приводятся потому, что продукты обладают биологической активностью несмотря на варьирование параметров способа в широком диапазоне. Соответственно определяются только критические особенности реакции. В Примере 5 установлено, что состав смеси можно регулировать и изменять посредством частичного разделения на сорбционных колонках и контролировать хроматографическим методом. Пример может быть дополнен следующими данными и методологией контроля: 1. Определение соединений Амадори и простых сахаров посредством ВЭЖХ на Si-DEAE колонке с последующей постколоночной дериватизацией производных, основанной на использовании спиртового раствора трифенилтетразолий хлорида (ТТХ), согласно работе Reutter и Eichner (Lebensm. Unters. Forch. 188, 28, 1989).

Процитированный выше способ позволяет оценить количественное соотношение индивидуальных соединений Амадори в реакционной смеси после реакции, которое в целом не отличается от исходного соотношения аминокислотной смеси (из-за различных скоростей реакции и скоростей реакций распада).

2. Разделение реакционной смеси после реакции посредством метода ВЭЖХ на гелевых колонках OH-Pak Q-801 (Shodex) с использованием дистиллированной воды в качестве элюента. Так как этот способ разделения соответствует размеру молекул, в образцах, отобранных из реакционных смесей через различные интервалы времени, т.е. при различной продолжительности реакции, можно видеть увеличение фракций молекул с высоким молекулярным весом, что связано со следующими стадиями реакции Майлларда, то есть с декомпозицией соединений Амадори и последующей конденсацией продуктов декомпозиции с аминокислотами.

Такие фракции имеют определенное влияние на продуцирование цитокина, то есть хроматографический контроль процесса реакции позволяет поддерживать его в нужном соотношении с другими фракциями.

Когда элюат контролируется УФ-дефектором (длины волны 215 и 280 нм) и рефрактометрически, субстрат непрореагировавших сахаров виден при рефрактометрической регистрации, так как они не поглощают УФ.

3. ИК-спектры позволяют проводить относительную оценку различия в композиции индивидуального вклада продуктов. Сравнение ИК-спектра настоящего продукта с соответствующими ИК-спектрами предыдущих продуктов, имеющих требуемую биологическую активность, или со стандартным продуктом осуществляют, чтобы модифицировать направление реакции.

Поскольку биологические испытания не вошли в уже отмеченные анализы в описании, то использовались следующие дополнительные способы: 4. Испытание воздействия полученных средств на выживаемость мышиных тимоцитов в 18 и 20 часовых культурах в присутствии гидрокортизона.

Такое испытание используется в Польше в качестве рутинного контроля активности утвержденных иммуномодуляторных средств, известных как TFX (экстракт активных пептидов тимуса) и ТТР (полученных из торфяного экстракта).

Подробное описание анализа приведено ниже. Прилагаются представительные результаты испытания для средств, экспериментально полученных согласно настояще