Способ получения гамма-l-глутамилгистамина, применение гамма-l-глутамилгистамина, фармацевтическая композиция

Способ получения гамма-l-глутамилгистамина, применение гамма-l-глутамилгистамина, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Использование: в медицине. Сущность изобретения: усовершенствованный способ получения гамма-L-глутамилгистамина (I), заключающийся в ацилировании гистамина гамма-пентафторфеноловым эфиром L-трет.-бутилоксикарбонил--бензилового эфира L-глутаминовой кислоты в органическом растворителе с последующим отщеплением защит в кислой среде и гидрогенолизом, изоэлектрическим осаждением и перекристаллизацией. Применение соединения (I) в качестве средства, обладающего антиоксидантным, антирадикальным, липидрегулирующим, гипогликемическим, антиастматическим, гепатопротекторным, противовирусным, антибактериальным, противоопухолевым, антиметастатическим, адаптогенным действием, а также способностью модулировать метаболизм арахидоновой кислоты и другими видами терапевтического действия. Фармацевтическая композиция, обладающая вышеперечисленными свойствами, включающая активное начало - соединение (I) в эффективном количестве и целевые добавки. 3 с. и 1 з.п.ф-лы, 14 табл.

Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии и касается усовершенствования метода синтеза -L-глутамилгистамина (-L-Glu-HA), а также его применения в медицине в качестве потенциального лекарственного средства.

Объектом изобретения является известный псевдопептид формулы (I).

-L-Glu-HA был впервые выделен в следовых количествах из нервных тканей крысы и моллюска [Koniski Н., Kakimoto Y. /Formation of -glutamylhistamine from histamine in rat brain.// J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp. 1461-1463; Tsuji M., Matsuoka Y., Nakajima T. /Studies of formation of -glutamines in rat brain and synthetic and catabolic enzymes.// J. Neurochemistry. -1977. -vol. 29. -pp. 633-638.]. Известен химический способ получения -L-Glu-HA, исходя из Z-L-Glu(OEt)OH [Koniski Н., Kakimoto Y. / Formation of - glutamylhistamine from histamine in rat brain.// J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp. 1461-1463]. Последний действием гидразин-гидрата в течение 48 часов превращают в соответствующий гидразид Z-L-Glu(N₂H₃)OH с выходом 80%, а затем в азид Z-L-Glu(N₃)OH. Последний вводят в реакцию с гистамином в водно-щелочной среде в соответствии с методикой Какимото [Kakimoto Y. , Nakajima Т. /Isolation of -L-Glu-L-Glu acid and -L-Glu-L-glutamine from bovine brain. // Biochemica et biophysica Acta. -1964. -vol. 93. -pp. 333-338] . Продукт реакции Z-L-Glu(HA)OH гидрируют для отщепления Z-защиты. Образующийся -L-Glu-HA очищают колоночной хроматографией на ионообменнике IR-120 с последующей перекристаллизацией из воды, спирта и ацетона. Конкретной методики с указанием выходов промежуточных и конечных продуктов и условий проведения отдельных стадий синтеза -L-Glu-HA [Koniski Н., Kakimoto Y. / Formation of - glutamylhistamine from histaimine in rat brain.// J. Neurochem. -1976, -vol. 27. -pp. 1461-1463] не приведено.

Недостатками способа являются длительность стадии гидразинолиза (48 час), неоднозначность протекания реакции аминолиза -азида со свободной карбоксильной группой [Шредер Э. , Любке К. Пептиды. -M. -Мир. -1967. -с. 249] , трудоемкость очистки конечного продукта -L-Glu-HA [Koniski Н., Kakimoto Y. / Formation of -glutamylhistamine from histamine in rat brain.// J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp. 1461-1463], низкие выходы и плохая воспроизводимость азидного метода при синтезе родственных соединений: выходы -Glu--аминоизобутановой кислоты для D-изомера составляет 17,7%, а для L-изомера- 38,8. -L-Glu-HA, синтезированный по известному способу [Koniski Н. , Kakimoto Y. / Formation of -glutamylhistamine from histamine in rat brain. // J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp.l461-1463], охарактеризован лишь элементным анализом и кислотным гидролизом, что недостаточно для подтверждения строения и индивидуальности вещества, в том числе отсутствия в нем -изомера.

Известен химический способ получения -L-Glu-HA, исходя из Boc-L-Glu(OH)-OBu^t, близкий к заявляемому и выбранный нами в качестве прототипа [Mc Caman M. W., Stetzler J., Clark В. / Synthesis of -Glutamyilopamine and Other Peptidoamines in the Nervous System of Aplysia californica.// J. Neurochem. -1985. -vol. 45. -N 6. -pp. 1828-1835].

Недостатком способа является длительность реакции отщепления -OBu^t-эфира от Boc-L-Glu(HA)-OBu^t, которая, к тому же, сопровождается образованием побочных продуктов. Кроме того, в публикации [Mc Caman М. W., Stetzler J. , Clark В. / Synthesis of -Glutamyldopamine and Other Peptidoamines in the Nervous System of Aplysia californica.// J. Neurochem. -1985. -vol. 45. -N 6. -pp. 1828-1835] не приведены выход и характеристики полученного -Glu-HA. Согласно предлагаемому нами способу (схема 1), Boc-L-Glu(OPfp)-OBzl вводят во взаимодействие с гистамином в среде DMF.

Промежуточный продукт Boc-L-Glu(HA)-OBzl очищают перекристаллизацией и гидрируют в метаноле над катализатором - палладием на активированном угле. Далее отщепляют Boc-защиту трифторуксусной кислотой. Выделение и очистку целевого -L-Glu-HA проводят изоэлектрическим осаждением при действии органического основания в среде органического растворителя с последующей перекристаллизацией.

Преимуществами способа являются высокие выходы, практическое отсутствие побочных реакций, исключение из синтеза нетехнологичных стадий очистки конечных и промежуточных продуктов колоночной хроматографией, проведение всех стадий синтеза и очистки в органической среде, т.к. известно, что гамма-глутамильная связь чувствительна к действию гидролитических агентов [Шредер Э., Любке К. Пептиды. -М. -Мир. -1967. -с. 249].

Исходный продукт Boc-L-Glu-OBzl коммерчески доступен и продается фирмами, производящими реагенты для пептидного синтеза.

Способ синтеза описан в примерах.

Индивидуальность полученных соединений проверяют методом ТСХ на пластинках "Kieselgel" фирмы "Merck" в системах растворителей : хлороформ-метанол 9: 1 (1), хлороформ-метанол 8:2 (2), н-бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:5 (3); изопропанол-вода-25% водный аммиак 6:3:1 (4); на бумаге фабрики им. Володарского в системе растворителей изопропанол-вода-25% водный аммиак 6:3: 1(5).

Хроматограммы проявляют хлор-толидиновым раствором, реактивом Паули и нингидрином.

Температуру плавления веществ определяют на приборе "Boetius" (Германия).

¹Н-ЯМР-спектры снимают на приборе "Brucker WM-250" (Германия) и "Varian XL-400" (Япония) с ТМС в качестве внутреннего стандарта.

Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводят в условиях (1): колонка МПС-270 С-18 (4.0 х 250 мм), 10 мкм, элюция 0.1 М Na₂HPO₄, pH 2.3; в условиях (2) : колонка та же, элюция 0.1 М Na₂HPO₄, pH 2.7.

Пример 1.

ПЕНТАФТОРФЕНИЛОВЫЙ ЭФИР N -ТРЕТ.-БУТИЛОКСИКАРБОНИЛ- - БЕНЗИЛ-L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ (II).

К раствору 0.425 г (1.25 ммоль) Boc-L-Glu-OBzl в 6 мл смеси диоксана и хлористого метилена ( 1:1 ) прибавляют 0.23 г (1.25 ммоль) пентафторфенола в 1.5 мл той же смеси растворителей при перемешивании. Охлаждают до 0^oC и прибавляют 0.258 г (1.25 ммоль) N,N'-дициклогексилкарбодиимида. Перемешивают 4 ч, осадок DCU отделяют. Растворитель из фильтрата удаляют в вакууме. К маслообразному остатку прибавляют 4 мл гексана, растирают. Осадок отделяют, сушат в вакууме. Выход 0.658г ( 90.0%). Т.пл. 67- 68^oC. R_f 0.8 (1).

Пример 2.

N- ТРЕТ.-БУТИЛОКСИКАРБОНИЛ -- БЕНЗИЛ-L- ГЛУТАМИЛГИСТАМИН (III).

К раствору 0.250 г (0.48 ммоль) Boc-L- Glu(OPfp)-OBzl в 2.5 мл DMF прибавляют при перемешивании 0.055 г (0.48 ммоль) гистамина, pH реакционной смеси доводят до 8 прибавлением N-метилморфолина. Перемешивают в течение 30 мин при 20^oC и оставляют на 48 час при 0^oC. Диметилформамид удаляют в вакууме, маслообразный остаток растирают с 2 мл сухого эфира. Осадок отделяют, промывают 2 мл эфира и перекристаллизовывают из ацетона. Выход 0.145 г (85.0%). R_f 0.39 (2). Т.пл. 130-132^oC. ИК-спектр (в вазелине), см^-1: 1680 (амид I), 1530 (амид II). ¹H-ЯМР-спектр (CDCl₃, CD₃OD), , м.д.: 1.4 (с, 9H, (CH₃)₃C-Boc), 2.1 (м, 2H, -CH₂), 2.45 (т, 2H, -CH₂), 2.85 (т, 2H, -CH₂-HA), 3.45 (т, 2H, -CH₂-HA), 4.2 (т, 1H, -CH), 5.2 (д, 2H, CH₂-Bzl), 7.05 (с, 1H, CH-4-Im), 7.4 (с, 5H, C₆H₅-Bzl), 8.1 (с, 1H, CH-2-Im). Найдено %: C 61.08; H 6.85; N 13.10. C₂₂H₃₀N₄O₅. Вычислено %: C 61.39; H 6.97; N 13.02.

Пример 3.

-L- ГЛУТАМИЛГИСТАМИН (I).

К раствору 0.050 г (0.11 ммоль) Boc-L-Glu(HA)-OBzl в 2 мл безводного метанола прибавляют 0.050 г 10%-го палладия на активированном угле, перемешивают 2.5 час, периодически пропуская ток водорода. Катализатор отфильтровывают, промывают 3 мл метанола. Растворитель из фильтрата удаляют в вакууме. Получают 0.040 г (100%) прозрачного масла Boc-L-Glu(HA)OH (IV), R_f 0.29 (3). Продукт растворяют в 0.11 мл TFA, выдерживают 1 час при 20^oC и прибавляют 2 мл безводного эфира. Выпавшее масло промывают эфиром при растирании и сушат в вакууме над P₂O₅. Твердый остаток растворяют в 0.4 мл этанола и прибавляют 0.036 мл Et₃N до pH 7. Творожистый осадок отделяют, промывают эфиром, сушат. Выход 0.0235 г (89.0%). После перекристаллизации получают 17.1 мг (65.0%). R_f 0.61 (4), R_f 0.58 (5). ВЭЖХ в условиях (4): один пик, время выхода 3.50 мин.; в условиях (5): один пик, время выхода 3.53 мин. ¹H-ЯМР-спектр в D₂O, , м. д. : 1.8 (м, 2H, -CH₂), 2.13 (т, 2H, -CH_2/ ), 2.57 (т, 2H, -CH₂-HA), 3.18 (т, 2H, -CH₂-HA), 3.5 (т, 1H, -CH), 6.73 (с, 1H, CH-4-Im), 7.55 (с, 1H, CH-2-Im).

Биологическая активность.

Ранее, исходя из антиокислительных свойств -L-Glu-HA- известного наиболее близкого аналога заявляемого соединения - было предложено использовать его для лечения ряда заболеваний, в частности, атеросклероза, аллергии [Seguin М.С., Babizhayev М. / Product de couplage de l'un acide amine, procede de preparation, et applications therapeutigues et cosmetologigues.// Patent Fr. - 2701947. -1994. -C1 C 07 C 237/04. -A 61 K 31/195. -7/48; Babizhayev М., Seguin М.C. / Pseudodipeptide product having on imidazole grouping and applications.// WO 95/12581. -C1 C 07 D 233/64. -C 12 P 17/10. -A 61 K 31/415. -7/42].

Однако эти показания к применению не были подтверждены экспериментально в опытах in vivo. Показано, что -L-Glu-HA- ингибирует образование супероксиданиона лишь в небольшой степени при высоких концентрациях, не влияя на образование гидроксильного радикала [Babizhayev М., Seguin М.С. / Pseudodipeptide product having on imidazole grouping and applications.// WO 95/12581. -C1 C 07 D 233/64. -C 12 P 17/10. -A 61 К 31/415. -7/42]. Кроме этого, можно прогнозировать большую неустойчивость -L-Glu-HA- к действию ферментов in vivo, чем у соответствующего -аналога. Исходя из этих данных, нами предпринято расширенное исследование биологической активности заявляемого соединения (IV). В результате для него были выявлены неизвестные ранее виды фармакологической активности и предложен механизм действия на основании экспериментов in vitro. Так, было показано, что заявляемое соединение обладает антиоксидантной и антирадикальной активностями при низких концентрациях.

Совокупность вышеотмеченных свойств определяет ценность предлагаемого соединения (IV) в качестве фармакологического средства для лечения ряда заболеваний.

Примеры разнообразных видов биологической активности, проявляемых заявляемым соединением, in vitro и in vivo приведены ниже.

Пример 4.

ВЛИЯНИЕ -L-Glu-HA HA ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ.

Изучалось влияние препарата -L-Glu-HA на изменение хемилюминесценции (ХЛ), обусловленной образованием гидроксильного радикала (^.OH) и супероксидного анион-радикала (O₂^-), в модельных химических и ферментативных системах.

Активные формы кислорода (АФК) различной природы генерировали в следующих системах: A. гидроксильный радикал - в смеси FeSO₄ с H₂О₂ (реактив Фентона) [Halliwell В. / Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of iron salts.// FEBS Lett. -1978. -vol. 96. -pp. 238-241].

Инкубационная среда состояла из 5 мМ KH₂PO₄ (pH 7,4); 5 мM FeSO₄; 2 мМ люминола. H₂О₂ в конечной концентрации 5 мМ вводили в кювету через диспендер после того, как было зарегистрировано фоновое свечение смеси реагентов. Патентуемое соединение, растворенное в воде, в необходимой концентрации вносили в кювету в объеме 5-10 мкл. Общий объем пробы составлял 0,5 мл.

B. супероксидный анион-радикал - в смеси ксантина и ксантиноксидазы [Afanasev I., Suslova Т., Cheremisina Z. et al. / Study of antioxidant properties of metal aspartates.// Analyst- 1995. -vol. 120. -pp. 859-862].

Инкубационная среда содержала следующие ингредиенты: 5 мМ KH₂PO₄; 0,2 МЕ/мл ксантиноксидазы. Ксантин в концентрации 1 мМ вводили в пробу через диспендер. В качестве сенсибилизатора свечения в данной системе использовали люцигенин (0,2 мМ). Исследуемое вещество вводили аналогично как при исследовании гидроксильного радикала.

В предварительных исследованиях было показано, что заявляемое соединение не влияло на активность ксантиноксидазы.

Измерение ХЛ описанных систем проводили при 25^oC в режиме пульсового (в момент введения реагентов через диспендер) перемешивания. Индикация сигнала ХЛ осуществлялась путем его интегрирования каждые 10 с - 5 мин. Длительность регистрации вспышки ХЛ после смешивания ингредиентов определялась кинетикой конкретного процесса. Для каждой системы определяли светосумму ХЛ (мВ) в контрольных пробах без препарата (I-) и в пробах в присутствии соответствующих концентраций препарата (I+). Для оценки степени ингибирования (активации) ХЛ в изученных системах находили отношение I+/I- (относительные единицы).

Образование АФК и влияние на этот процесс предлагаемого соединения регистрировали на приборе Luminometer-1251 (LKB, Швеция).

Результаты экспериментов обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

A. Влияние соединения -L-Glu-HA на образование гидроксильного радикала в реактиве Фентона.

При введении H₂O₂ в фосфатный буфер, содержащий сульфат железа, возникала вспышка ХЛ, которая была обусловлена образованием в реакционной смеси преимущественно гидроксильного радикала. Вспышка носила кратковременный характер, максимум интенсивности достигался на 10-й секунде и в течение следующих 10-20 секунд свечение гасло и показатели ХЛ уменьшались до фоновых значений.

В таблице 1 представлены данные исследования действия -L- Glu-HA на генерацию гидроксильного радикала в реактиве Фентона. Результаты показывают, что соединение ингибирует образование гидроксильного радикала в изученной системе.

B. Влияние -L-Glu-HA на образование супероксидного анион-радикала в системе ксантин-ксантиноксидаза.

Введение ксантина в среду, содержащую ксантиноксидазу и люцигенин, приводило к возникновению вспышки ХЛ, которая достигала максимума за 3-5 минут, после чего в изучаемой системе начиналось очень медленное уменьшение интенсивности хемилюминесценции. Добавление -L-Glu-HA в смесь ксантин- ксантиноксидазы принципиально не меняло форму кривой ХЛ-ответа, варьировали только значения максимальной интенсивности ХЛ. Вследствие такой "растянутости" кинетической кривой регистрировалась светосумма хемилюминесценции за первые 3-5 минут, которая отражала суммарное количество квантов света, вырабатываемых в системе до достижения максимальных значений интенсивности ХЛ.

Как видно из представленных данных (табл. 2), -L-Glu-HA обладает способностью достоверно ингибировать образование супероксидного анион-радикала.

Пример 5.

ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ -L-Glu-HA В ОПЫТЕ IN VIVO.

Эксперимент проведен на 47 беспородных крысах-самцах с исходной массой 190-200 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. Поражение печени (экспериментальный гепатит) у животных вызывали введением четыреххлористого углерода (CCl₄) внутрижелудочно в виде 50% раствора в вазелиновом масле в объеме 0,25 мл на 100 г массы тела в течение 3 дней [Венгеровский А.И., Чучалин B.C., Паульс О.В., Саратиков А.С. / Влияние гепатопротекторов на метаболизм липидов при CCl₄ - гепатите.// Бюлл. экспер. биол. -1987. -N 4. -с. 430-432] . -L-Glu-HA вводили животным внутрижелудочно в дозах 50 и 500 мкг/кг до поражения печени (3 и 4 группы) в течение 3 дней, а также одновременно с CCl₄ (5 и 6 группы). Животным контрольной группы вводили CCl₄, как описано выше (2 группа). Интактные животные получали перорально физиологический раствор в эквивалентном количестве (1 группа).

Образцы крови и печени брали на анализ через 18 часов после последнего введения CCl₄.

Содержание первичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - диеновых конъюгатов, диеновых кетонов и триенов, определяли методом [Волчегорский И. А., Налимов А. Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р. И. /Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан- изопропанольных экстрактах крови.// Вопр. мед. химии. -1989. -N 1. -с. 127-131]. Расчет содержания продуктов ПОЛ проводили, соотнося величины соответствующих экстинкций к 1 мл исследуемой пробы.

Количество конечных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) - определяли по тесту с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Коробейникова Э.Н. / Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой. // Лаб. дело. -1989. -N7.- с. 8-10]. Концентрацию ТБК-активных продуктов рассчитывали с помощью уравнения регрессии. Содержание МДА в печени экспериментальных животных оценивали модифицированным методом [Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. / Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты.// В кн: Современные методы в биохимии. -М. -Медицина. -1977. -с. 66-69], проводя предварительную экстракцию липидов по Фолчу [Кейтс М. Техника липидологии. -М. -Мир. -1975. -с. 74-76].

Результаты эксперимента обрабатывались статистически с применением t-критерия Стьюдента [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Результаты таблицы 3 свидетельствуют, что введение крысам CCl₄ приводило к накоплению продуктов ПОЛ в сыворотке крови и печени. У животных всех групп, которым вводили -L-Glu-HA, отмечалось снижение содержания МДА в сыворотке крови и в печени. Кроме этого, выявлено уменьшение первичных продуктов ПОЛ в печени животных, получавших исследуемое соединение.

Пример 6.

ВЛИЯНИЕ -L-Glu-HA НА МЕТАБОЛИЗМ [C¹⁴]-АРАХИДОНОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ГОМОГЕНАТЕ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ.

Исследования проводили на мышах-самцах линии С57В1, находившихся на стандартном рационе вивария. Легкие животных извлекали, замораживали в жидком азоте, затем гомогенизировали стеклянным гомогенизатором фирмы "Wheaton" (США) при +4^oC в 10 объемах 0,05 М трис-HCl буфера. Аликвоты (0,5 мл) супернатанта инкубировали с 0,5 мкКю [C¹⁴] -арахидоновой кислоты ([C¹⁴]-AK, "Amersham", Англия; удельная активность 50-60 мКю/ммоль) при +37^oC в течение 30 мин. Концентрация в инкубационной среде -L-Glu-HA составляла 10^-4 М. Экстракцию неметаболизированной [C¹⁴]-AK и продуктов ее метаболизма осуществляли в 20 объемах смеси хлороформа и метанола (1:1), при эффективности экстракции не менее 90%, оцененной с помощью [C¹⁴]-ПГF₂. Растворители удаляли на ротационном испарителе ("Buchi", Швейцария) при пониженном давлении, сухой остаток растворяли в смеси хлороформа: метанола (1:1). Разделение и идентификацию [C¹⁴] -AK и ее метаболитов осуществляли тонкослойной хроматографией на пластинах Kieselgel 60 ("Merck", Германия), с использованием органической фазы системы растворителей (этилацетат, изооктан, уксусная кислота, вода в соотношении 110: 50:20:100) и меченных стандартов. Авторадиохроматограммы, полученные на рентгеновской пленке X- Omat AR ("Kodak", США) и HS 11 ("ORWO", Германия), денситометрировали на денсикане KS 3 ("Kipp and Zonnen", Голландия). Количественный анализ отдельных эйкозаноидов проведен с помощью радиометрии фракций, полученных высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC-система фирмы "Gilson", Франция; колонка ZORBAX C8 фирмы "Du Pont" США) и элюированием пятен на ТСХ-пластинках.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Результаты эксперимента представлены в таблице N 4. Обращает внимание снижение количества ПГF₂ - на 39%, 6-кето-ПГF₁ на 39% и 12-, 15-НЕТЕ- на 28% в присутствии -L-Glu-HA.

Таким образом, введение в инкубационную среду соединения -L-Glu-HA приводит к изменению метаболизма арахидоновой кислоты в системе in vitro.

Пример 7.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ -L-Glu-HA НА ПРОЯВЛЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО БРОНХОСПАЗМА.

Антиастматическое действие -L-Glu-HA изучалось на модели антиген-индуцированного бронхоспазма у активно сенсибилизированных морских свинок по методу Andersson [Andersson P. /Antigen induced bronchial anaphylaxis in actively sensitized guinea pig.// Allergy. -1980. -vol. 35. -pp. 65-71].

Данная модель наиболее адекватна атонической бронхиальной астме, так как спазм бронхов у морской свинки развивается в результате аллергической реакции между антигеном и гомоцитотропными антителами lgE класса.

Морские свинки-самцы с исходной массой 250-300 г сенсибилизировались внутримышечной инъекцией 0,5 мл суспензии, содержавшей 20 мкг овальбумина (ОБА, производства фирмы Sigma /grade III/) и 100 мг Al(OH)₃ на животное. Разрешающую дозу 150-200 мкг/кг ОБА вводили внутривенно (v. jugularis) в 0,1 мл физиологического раствора на 26 день после сенсибилизации. Индукция бронхоспазма и измерение параметров внешнего дыхания проводилась по методу, описанному в работе [Yu-Hong L., Barnes P., Rogers D. / Inhibition of neurogenic plasma exudation and bronchoconstriction by a K⁺ chennel activator, BRL 38227, in guinea pig airways in vivo.// Europ. J. Pharmacol. -vol. 239. -pp. 257-259]. Животное наркотизировали внутрибрюшинным введением этаминала натрия (70 мг/кг массы), обнажали трахею, проводили трахеотомию и вставляли в трахею канюлю. Канюля присоединялась через специальный тройник к респиратору (Ugo Basel, модель 7025), который работал в течение эксперимента в постоянном режиме: объем вентилируемого воздуха 8 мл, частота дыхания 70 в минуту. Измерение параметров дыхания осуществлялось с помощью трансдуцера (Ugo Basel, модель 7020), соединенного с канюлей и самописца (Миллихром), регистрировавшего амплитуду дыхания. Величина амплитуды отражала степень сопротивления гладкой мускулатуры бронхов воздушному потоку. После установления у морской свинки нормального ритма дыхания, животному вводили в v. jugularis разрешающую дозу антигена. Через 1-2 минуты развивался бронхоспазм, который выражался в резком увеличении сопротивления бронхов (вследствие их сужения) и амплитуды дыхания в 8-10 раз по сравнению с исходным значением. Динамику бронхоспазма наблюдали в течение 30-60 минут. При оценке эффективности заявляемого соединения определяли изменение величины бронхоспазма.

Исследуемое вещество растворяли в физиологическом растворе и вводили животным трехкратно за 72, 48 и 18 часов до индукции бронхоспазма внутрижелудочно в дозе 50 мкг/кг. В качестве препарата сравнения использован Интал - препарат, получивший широкое распространение при лечении бронхиальной астмы. Интал вводили животным внутрижелудочно в дозе 5 мг/кг по той же схеме, что и -L-Glu-HA. Контрольная группа животных получала эквивалентное количество физиологического раствора.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Данные, приведенные в таблице 5, свидетельствуют, что заявляемое соединение достоверно снижает величину бронхоспазма на 40%, по сравнению с контрольными значениями.

Таким образом, -L-Glu-HA проявлял активность в отношении снижения величины бронхоспазма, сравнимую с действием препарата сравнения - Интал. Однако действующая доза предлагаемого вещества была на два порядка ниже, чем Интала.

Пример 8.

ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ -L-Glu-HA. Гиполипидемическую активность -L-Glu-HA изучали на модели экспериментальной гиперлипидемии [Arichi Н., Kumura Н.О. / Effects of stibens compounds of roots of polygonum cuspidatium on the lipid metabolism.// Chem. Pharm. Bull. -1982. -vol. 30. -N 5. -pp.l766-1767] у беспородных крыс-самцов с исходной массой 220-250 г, получавших в течение 10 дней внутрижелудочно на фоне стандартного рациона в масляную суспензию, содержавшую 10% холестерина и 1% холевой кислоты (из расчета 1 мл суспензии на 100 г массы тела). Исследуемое соединение вводили животным перорально в дозах 50 и 500 мкг/кг в течение последних четырех дней эксперимента. В качестве препарата сравнения использовали никотиновую кислоту, которую вводили животным в течение 10 дней на фоне атерогенной нагрузки в дозе 10 мг/кг. Образцы крови брали на анализ через 18 часов после последнего введения препарата, в течение которых у крыс отнимали пищу.

Определяли следующие показатели: холестерин общий (ХС- общий), холестерин липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП), холестерин липопротеидов низкой плотности и липопротеидов очень низкой плотности (ХС-ЛПНП и ХС-ЛПОНП), триглицериды (ТГ). Содержание ХС в сыворотке крови определяли методом Илька [Биохимические исследования в клинике.- под. ред. А.А. Покровского. -М. -Медицина. -1969. -с. 300-302], ХС-ЛПВП оценивали в супернатанте после гепарин-марганцевой преципитации ЛПНП+ЛПОНП [Титов В.Н., Бренер Е.Д., Халтаев Н.Г., Задоя А.А., Творогова М.Г. / Метод и диагностическая значимость исследования содержания холестерина в -липопротеидах.// Лаб. дело. -1979. -N 1. -с. 36-41]. Определение ХС-ЛПНП проводили путем расчета по формуле, представленной в работе Friedewald W.T. et al [Friedewald W.T., Levy K. J., Leus R. /Fat transhort in lipoproteins an integrated approach to mechanism and disoders.// New Eugl.J. Med. -1967. -vol. 276. -p. 32].

Для оценки влияния заявляемого соединения на соотношение атерогенных и антиатерогенных липопротеидов плазмы крови вычисляли холестериновый индекс (K_xc) по формуле, приведенной в работе Климова А.Н. с соавторами [Климов А. Н. , Никульчева Н.Г. Липопротеиды, дислипопротеинемии и атеросклероз. -М. -Медицина. -1984. -165 с.].

Содержание ТГ в сыворотке крови определяли общепринятым методом [Радионова Л. П. /Модификация метода определения содержания триглицеридов в сыворотке крови. / Лаб. дело. -1980. -N 5. -с. 297-299].

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Данные, приведенные в таблицах 6, 7, свидетельствуют о том, что введение животным жировой суспензии сопровождалось достоверным повышением содержания ХС в сыворотке крови за счет атерогенных фракций липопротеидов (ЛПНП и ЛПОНП) на фоне снижения количества антиатерогенной фракции - ЛПВП. Индекс атерогенности возрос в 3 раза. Отмечалось также значительное повышение ТГ в сыворотке крови.

В таблице 7 представлены результаты влияния изучаемого соединения в дозе 50 мкг/кг на липидный состав крови у животных, получавших атерогенную нагрузку. Показано, что при введении -L-Glu-HA происходило изменение всех исследованных показателей практически до контрольных значений. У животных, которым вводили соединение в дозе 500 мкг/кг, выявлены аналогичные изменения.

Таким образом, изменения липидного состава сыворотки крови при введении экспериментальным животным исследованного соединения сопоставимы с гиполипидемическим эффектом препарата сравнения - никотиновой кислотой (табл. 6). Однако, действующая доза -L-Glu-HA была на два порядка ниже, чем у препарата сравнения, и исследованное соединение вводили в течение 4-х, а не 10 дней, как никотиновую кислоту.

Пример 9.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ АНТИДИАБЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ -L-Glu-HA. Исследования проведены на крысах-самцах Вистар массой 250-300 г. Экспериментальный диабет вызывали однократным внутривенным введением стрептозотоцина (кооп. "Синтез" при ИМБГ АН Украины) в дозе 42 мг/кг крысам, предварительно голодавшим в течение 24 часов с допуском к пище сразу после инъекции. Крыс отбирали в опыт через 2 недели после индукции диабета с уровнем гликемии 120-180 мг%. -L-Glu-HA вводили внутрижелудочно в течение 4 дней в суточных дозах 50 мкг/кг и 500 мкг/кг в водном растворе из расчета 1 мл на 200 г массы тела. Контрольные животные получали соответствующий объем воды. Животных лишали пищи за 2 часа до забора крови. Эффект оценивали по изменению уровня глюкозы в крови через 2, 5 и 24 часа после последнего введения препарата. Кровь брали из хвостовой вены в объеме 0,1 мл. Содержание глюкозы определяли о-толуидиновым методом.

Содержание глюкозы рассчитывали в мг% по калибровочной кривой с использованием стандартных растворов глюкозы. Далее определяли степень изменения содержания глюкозы по отношению к исходному количеству для каждого животного, выражая ее в процентах от исходного содержания. Окончательный расчет проводили для каждой группы животных.

Результаты опытов обработаны статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Данные, приведенные в таблице 8, свидетельствуют, что 4-дневное внутрижелудочное введение -L-Glu-HA в суточных дозах 50 и 500 мкг/кг приводило к достоверному снижению глюкозы в крови через 2 часа после введения препарата животным. Гипогликемический эффект сохранялся через 5 часов после введения, однако был менее выражен и статистически недостоверен.

Таким образом, глюкозопонижающая активность заявляемого соединения выражена в равной степени при его применении как в дозе 50 мкг/кг, так и 500 мкг/кг.

Пример 10.

ВЛИЯНИЕ -L-Glu-HA НА СОДЕРЖАНИЕ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ У ИНТАКТНЫХ ЖИВОТНЫХ.

Эксперимент проведен на белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 200-220 г. Животные контрольной группы (1 группа) в течение 3-х дней получали перорально физиологический раствор, животные опытных групп (2 и 3 группы) - раствор -L-Glu-HA в дозах 50 и 500 мкг/кг соответственно. В день забора крови животных лишали пищи. За два часа до последнего введения препарата у животных брали кровь из хвостовой вены. Образцы крови брали также через 2 и 5 часов после введения соединения, затем животных переводили на рацион вивария и последний забор крови проводили через 24 часа после последнего введения препарата. Содержание глюкозы в пробах определяли как описано в примере 7.

Результаты обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Данные, представленные в таблице 9, свидетельствуют, что лишение пищи приводило к незначительному, но достоверному снижению содержания глюкозы у животных всех групп с последующим восстановлением до количества, близкого к исходному. Не выявлено достоверных различий между содержанием глюкозы во всех группах в исследованные сроки.

Таким образом, введение -L-Glu-HA не влияло на содержание глюкозы в крови у интактных животных.

Пример 11.

ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ -L-Glu-HA.

A. Защитный эффект -L-Glu-HA при инфекции, вызванной вирусом энцефаломиокардита.

Исследования проводили на беспородных мышах обоего пола с исходной массой 10-11 г. В контрольной и опытных группах использовали по 30 животных. Исследуемое соединение и препарат сравнения Ридостин - индуктор интерферона, вводили однократно, внутрибрюшинно через 24 часа после заражения мышей вирусом энцефаломиокардита в дозах 30 мкг/кг и 5 мг/кг соответственно. Вирус энцефаломиокардита вводили в дозе 100 ЛД₅₀. Противовирусную активность определяли по изменению средней продолжительности жизни (СПЖ) мышей и степени защиты от смертельной вирусной инфекции.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Полученные результаты представлены в таблице 10. Показано, что -L-Glu-HA обладал выраженной противовирусной активностью в дозе на два порядка ниже по сравнению с дозой препарата сравнения.

Б. Влияние -L-Glu-HA на течение экспериментальной гриппозной инфекции у мышей.

Исследование проводили на белых беспородных мышах обоего пола массой 8-10 г. Вирус гриппа человека, тип A, штамм Aichi (аллантоисная жидкость), вводили мышам интраназально в дозе 100 ЛД₅₀, -L-Glu-HA вводили животным перорально в дозах 50 и 500 мкг/кг в течение 3-х дней до заражения и 10 дней после заражения. В качестве препаратов сравнения использовали Арбидол (специфический препарат) в дозе 100 мг/кг, который вводили за 24 и 2 часа до и 3 дня после заражения, и Тимоген (неспецифический препарат) в дозе 10 мкг/кг, вводившийся животным по той же схеме, что и исследуемое вещество. В каждой группе использовано по 30 животных. Противовирусную активность определяли по изменению СПЖ мышей и степени защиты от смертельной дозы вирусной инфекции.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Результаты исследования представлены в таблице 11. Выявлено, что увеличение СПЖ, выживаемости и степень защиты наиболее выражены при введении исследуемого соединения в дозе 500 мкг/кг. Применение -L-Glu-HA в дозе 50 мкг/кг и Арбидола сопровождалось изменением исследованных показателей в равной степени. Действие Тимогена в качестве противовирусного препарата было выражено более слабо.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о выраженном противовирусном действии заявляемого соединения при экспериментальной вирусной инфекции у мышей, вызванной вирусом гриппа человека, тип A. Действие -L-Glu-HA было сопоставимо и несколько более выражено, чем Арбидола. Однако эффективность заявляемого соединения отмечена при использовании доз на 3-4 порядка ниже по сравнению с препаратом сравнения - Арбидолом.

В. Влияние -L-Glu-HA на репродукцию вируса иммунодефицита человека при острой инфекции лимфобластоидных клеток.

Исследование проводили на культуре лимфобластоидных клеток человека МТ-4. В эксперименте использовали вирус иммунодефицита человека, тип 1, изолят ВИЧ-1/ИВ17 из коллекции Института вирусологии им. Д.И.Ивановского. -L-Glu-HA испытывали в концентрациях: 1,0; 0,1 и 0,01 мкг/мл. Препарат сравнения - азидотимидин, в дозе 0,05 мкМ/мл. Вещества вносили в культуру клеток МТ-4 за 1 час до внесения вируса в дозе 1000 ТЦИД₅₀.

Основным параметром эффективности действия веществ являлась жизнеспособность клеток.

В предварительных экспериментах было показано, что