Производные арилсульфониламиногидроксамовой кислоты, способ их получения, фармацевтическая композиция, способ ингибирования матричных металлопротеиназ и способ лечения

Производные арилсульфониламиногидроксамовой кислоты, способ их получения, фармацевтическая композиция, способ ингибирования матричных металлопротеиназ и способ лечения

Реферат

 

Описываются производные арилсульфониламиногидроксамовой кислоты общей формулы I, где значение Ar, X, n, R³, R⁴ указаны в п.1 формулы изобретения, которые являются ингибиторами матричных металлопротеиназ или продуцирования фактора некроза опухолей. Могут быть использованы для лечения артрита, рака, язв тканей, септического шока. Описывается способ их получения, способ ингибирования, способ лечения и фармкомпозиции на основе соединений формулы I. 5 с. и 13 з.п. ф-лы, 1 табл.

Данное изобретение относится к производным арилсульфониламиногидроксамовой кислоты, которые являются ингибиторами матричных металлопротеиназ или продуцирования фактора некроза опухолей (далее обозначаемый как ФНО) и поэтому полезны для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из артрита, рака, язв тканей, повторного стеноза, периодонталь-ного заболевания, врожденного буллезного эпидермолиза, склерита и других заболеваний, характеризующихся активностью матричной металлопротеиназы, СПИДа, сепсиса, септического шока и других заболеваний, включающих продуцирование ФНО.

Это изобретение также относится к способу применения таких соединений для лечения вышеуказанных заболеваний у млекопитающих, особенно у людей, и к фармацевтическим композициям, применяемым для этого.

Существует ряд ферментов, которые действуют разрушающе на структурные белки и которые являются структурно родственными металлопротеиназами. Матричноразрушающие металлопротеиназы, такие как желатиназа, стромолизин и коллагеназа, участвуют в разрушении структуры тканей (например, коллагеновая недостаточность) и являются причиной многих патологических состояний, включающих аномальный метаболизм соединительной ткани и основной структуры мембран, таких как артрит (например, остеоартрит и ревматоидный артрит), язвы тканей (например, тканей роговицы, язвы кожи и желудка), аномальное заживление ран, периодонтальное заболевание, костные заболевания (например, болезнь Педжета и остеопороз), метастазы или инвазия опухолей, а также ВИЧ-инфекция (J.Leuk.Biol., 52(20): 244-248, 1992).

Известно, что фактор некроза опухолей участвует в патогенезе многих инфекционных и аутоиммунных заболеваний (W.Friers, FEBS Letters, 1991, 285, 199). Кроме того, было показано, что ФНО является прямым медиатором воспалительной реакции наблюдаемой при сепсисе и септическом шоке (С.Е. Spooner et al. Clinical Immunology and Immunopathology, 1992, 62 Sll).

Краткое описание изобретения Данное изобретение относится к соединениям формулы или его фармацевтически приемлемым солям, где n равно от 1 до 6; X является гидроксилом, (C₁-C₆)алкоксилом или NR¹R², R¹ и R², каждый независимо выбирают из группы, состоящей из (C₁-C₆)алкила, пиперидила, (C₁-C₆)алкилпиперидила, (C₆-C₁₀)арила, (C₅-C₇)гетероарила, содержащего в качестве гетероатома азот, (C₆-C₁₀)арил(C₁-C₆)алкила, (C₅-C₇)гетероарил(C₁-C₆)алкила, содержащего в качестве гетероатома азот или R¹ и R² вместе образуют пирролидинил, морфолинил, пиперидил, (C₁-C₆)алкилпиперидил, пиперазил, N-(С₁-С₆) алкилпиперазил, N-(C₆-C₁₀)арилпиперазил, R³ и R⁴ каждый независимо выбран из группы, включающей водород, (C₁-C₆)алкил,(C₆-C₁₀)арил, (C₅-C₉)гетероарил, (C₆-C₁₀)арил-(C₁-C₆) алкил, (C₅-C₉) гетероарил(C₁-C₆) алкил, (C₆-C₁₀)арил(C₆-C₁₀)арил, (C₃-C₆)циклоалкил и (C₃-C₆)циклоалкил (C₁-C₆)алкил, или R³ и R⁴ вместе могут образовывать (C₃-C₆)циклоалкил, оксациклогексил, тиоциклогексил, инданил или кольцо тетралинила или пиперидиновое кольцо, замещенное R¹⁵, где R¹⁵ означает водород, (С₁-С₆)ацил, (С₁-С₆)алкил, (С₆-С₁₀)арил(С₁-С₆)алкил, (С₅-С₉)гетероарил (С₁-С₆)алкил или (C₁-С₆)алкилсульфонил; Ar означает (С₆-С₁₀)арил, (С₅-С₉)гетероарил, (С₁-С₆)алкил (С₆-С₁₀)арил, (С₁-С₆)алкокси (С₆-С₁₀)арил, ((C₁-С₆) алкокси)₂ (С₆-С₁₀) арил, (С₆-С₁₀) арилокси (С₆-С₁₀) арил или (С₅-С₉)гетероарилокси (С₆-С₁₀) арил.

Термин "алкил", как он использован здесь, если не указано иначе, обозначает насыщенные моновалентные углеводородные радикалы, имеющие заместители с прямой, разветвленной цепью или циклические или их комбинации.

Термин "алкокси", как он использован здесь, обозначает О- алкильные группы, где "алкил" имеет указанные выше значения.

Термин "арил", как он использован здесь, если не указано иначе, обозначает органический радикал, полученный от ароматического углеводорода путем удаления одного водорода, такой как фенил или нафтил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбираемыми из группы, состоящей из фтора, хлора, трифторметила, (С₁-C₆)алкоксила, (C₆-C₁₀)apилоксила, трифторметоксила, дифторметоксила и (С₁-С₆)алкила.

Термин "гетероарил", как он использован здесь, если не указано иначе, обозначает органические радикалы, полученные от ароматического гетероциклического соединения, содержащего в качестве гетероатома азот.

Термин "ацил", как он использован здесь, если не указано иначе, обозначает радикалы общей формулы RCO, где R является алкилом, алкоксилом, арилом, арилалкилом или ариалкилоксилом, а термины "алкил" или "арил" определены выше.

Термин "ацилоксил", как он использован здесь, включает О-ацильные группы, где "ацил" определен выше.

Соединения формулы I могут иметь хиральные центры и поэтому существуют в разных энантиомерных формах. Данное изобретение относится ко всем оптическим изомерам и стереомерам соединений формулы I и их смесям.

Предпочтительные соединения формулы I включают те, в которых n равно 2.

Другие предпочтительные соединения формулы I включают те, в которых Ar является 4-метоксифенилом или 4-феноксифенилом.

Другие предпочтительные соединения формулы I включают те, в которых или R³ или R⁴ не является водородом.

Другие предпочтительные соединения формулы I включают те, в которых n равно I.

Другие предпочтительные соединения формулы I включают те, в которых X является гидроксилом, Ar является 4-метоксифенилом или 4-феноксифенилом, а либо R³ или R⁴ не является водородом.

Другие предпочтительные соединения формулы I включают те, в которых X является алкоксилом, Ar является 4-метоксифенилом или 4-феноксифенилом, а либо R³ или R⁴ не является водородом.

Другие предпочтительные соединения формулы I включают те, в которых Ar является 4-метоксифенилом или 4-феноксифенилом, a R³ и R⁴, взятые вместе, образуют (C₃-C₆)циклоалканил, оксациклогексанил, тиоциклогексанил, инданил или группу формулы где R¹⁵ является (С₁-С₆)ацилом, (С₁-С₆)алкилом, (С₆-C₁₀)арил- (С₁-С₆)алкилом, (С₅-С₉)гетероарил(С₁-С₆)алкилом или (C₁-C₆)- алкилсульфонилом.

Более предпочтительными соединениями формулы I являются, те, в которых n равно 2, Ar является 4- метоксифенилом или 4- феноксифенилом, R¹ и R², взятые вместе, образуют пиперазинил, (С₁-С₆)алкилпиперазинилом, (С₆- С₁₀)арилпиперазинилом или (С₅-C₉)гетероарил(С₁-C₆)алкилпиперазинилом, а либо R³ или R⁴ не является водородом, или оба, R³ и R⁴, не являются водородом.

Более предпочтительными соединениями формулы I являются те, у которых n равно 2, Ar является 4-метоксифенилом или 4- феноксифенилом, R¹ является водородом или (С₁-С₆)алкилом, R² является 2-пиридилметилом, 3-пиридилметилом или 4-пиридилметилом, а либо R³ или R⁴ не является водородом, или оба R³ и R⁴ не являются водородом.

Более предпочтительными соединениями формулы I являются те, в которых n равно 1, Ar является 4-метоксифенилом или 4-феноксифенилом, R₂ является 2-пиридилметилом, 3-пиридилметилом или 4-пиридилметилом, а либо R³ или R⁴ не является водородом, или оба, R³ и R⁴, не являются водородом.

Конкретные предпочтительные соединения формулы I включают следующие: 2-(R)-N-гидрокси-2- [(4-метоксибензолсульфонил) (3- морфолин-4-ил-3-оксопропил)амино]-3-метилбутирамид; 2-(R) -2-[(2-бензил карбамоилэтил)(4-метоксибензолсульфонил)амино] -N- гидрокси-3-метилбутирамид; 2-(R)-N-гидрокси-2- ((4-метоксибензолсульфонил)(2-[(пиридин-3-илметил) -карбамоил]этил)амино)-3-метилбутирамид; 2-(R)-N-гидрокси-2-([4-метоксибензолсульфонил] [2-(метилпиридин- З-илметилкарбамоил)этил]амино)-3-метилбутирамид; 4-(3-[1-(R)-1-гидроксикарбамоил-2-метилпропил) (4- метоксибензолсульфонил) амино] пропионил) пиперазин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир; 2-(R)-N-гидрокси-2-[(4- метоксибензолсульфонил) (3-оксо-3-пиперазин-1-илпропил)амино)-3- метилбутирамида гидрохлорид; 2-(R)-2-[(бензилкарбамоилметил) (4- метоксибензолсульфонил) амино] N-гидрокси-3-метилбутирамид; 2-(R)-N-гидрокси-2-([4-метоксибензолсульфонил] -[(2-морфолин-4- илэтилкарбамоил) метил] амино) -3-метилбутирамид и 2-(R)-N-гидрокси-2-((4-метоксибензолсульфонил) ([(пиридин-3-илметил) карбамоил)метил)амино)-3-метилбутирамид.

Другие конкретные соединения формулы I включают следующие: 2-(R)-3, 3, 3-трифтор-N-гидрокси-2- [(метоксибензолсульфонил) (3-морфолин-4-ил-3- оксопропил) амино] пропионамид; 2-(R)-N-гидрокси-2-((4-феноксибензолсульфонил) [2- (метил-пиридин-4-илметилкарбамоил)этил)амино)-3-метилбутирамид; 4-[4-метоксибензолсульфонил)(3-морфолин-4-ил-3-оксопропил) амино] -1-метилпипериден-4-карбоновой кислоты гидроксамид; 2-(R)-N-гидрокси-2-((4-метоксибензолсульфонил) - [3-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-оксопропил]амино)-3-метилбутирамид; 2-(R)-2-[(2-карбоксиэтил) (4-метоксибензолсульфонил)амино] -N-гидрокси-3-метилбутирамид; [(2-карбоксиэтил) (3,4-диметоксибензолсульфонил)амино] -N-гидроксиацетамид; 2-(R)-2-[(2-карбамоилэтил) (4-метоксибензолсульфонил) амино]-N-гидрокси-3-метилбутирамид; 2-(R), 3-(R)-3,N-дигидрокси-2-[(4-метоксибензолсульфонил)-(3-оксо- З-пиперидин-1-илпропил)амино]-бутирамид; 2-(R)-N-гидрокси-2- ((4-метоксибензолсульфонил) [3-(метилпиридин-3- илметилкарбамоил)пропил]амино)-3-метилбутирамид; 2-(R)-N-гидрокси-2-((4-метоксибензолсульфонил) [2- (метилкарбоксиметилкарбамоил) этил] амино)-3-метилбутирамид; 2-(R)-N-гидрокси-2- ((4метоксибензолсульфонил) - [(1-метил-пиперидин-4-илкарбамоил) метил] амино)-3-метилбутирамид; 2-(R)-2-циклогексил-N-гидрокси- 2-((4-метоксибензолсульфонил) - [3- (4-метилпиперазин-1-ил) -3- оксопропил]амино)-ацетамид; 2-(R)-N-гидрокси-2-[(метоксибензолсульфонил) (3-морфолин-4-ил-3- оксопропил) амино]-4-(морфолин-4-ил)бутирамид.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции для (а) лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из артрита, рака, язв тканей, возвратного стеноза, периодонозного заболевания, врожденного буллезного эпидермолиза, склерита и других заболеваний, характеризующихся активностью матричных протеиназ, СПИДа, сепсиса, септического шока и других заболеваний, которые связаны с продуцированием фактора некроза опухолей (ФНО) или (б) подавления матричных металлопротеиназ или продуцирования фактора некроза опухолей (ФНО) у млекопитающих, включая людей, содержащей количество соединения по пункту 1 или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для такого лечения и фармацевтически приемлемый носитель.

Данное изобретение также относится к способу ингибирования (а) матричных металлопротеиназ или (б) продуцирования фактора некроза опухолей (ФНО) у млекопитающих, включая людей, который включает введение указанному млекопитающему эффективного количества соединения по пункту 1 или его фармацевтически приемлемой соли.

Данное изобретение также относится к способу лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из артрита, рака, язв тканей, повторного стеноза, периодонтозного заболевания, врожденного буллезного эпидермолиза, склерита и других заболеваний, характеризующихся активностью матричных протеиназ, СПИДа, сепсиса, септического шока и других заболеваний, которые связаны с продуцированием фактора некроза опухолей (ФНО) у млекопитающих, включая людей, включающий введение указанному млекопитающему количества соединения по пункту 1 или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для лечения такого заболевания.

Детальное описание изобретения Следующие далее схемы реакций иллюстрируют получение соединений данного изобретения. Если не указано иначе, R¹, R², R³, R⁴, n и Ar в схемах реакций и в описании, которое следует далее, имеют те же значения, что и указанные выше.

В реакции 1 схемы 1 аминокислотное соединение формулы VII, в котором R¹⁶ является (С₁-С₆алкилом, бензилом, аллилом или трет-бутилом, превращают в соответствующее соединение формулы VI реакцией УП с реактивным функциональным производным арилсульфоновой кислоты, таким как арилсульфонилхлорид, в присутствии основания, такого как триэтиламин, и полярного растворителя, такого как тетрагидрофуран, диоксан, вода или ацетонитрил, предпочтительно, смеси диоксана и воды. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение периода времени от примерно 10 минут до примерно 24 часов, предпочтительно, примерно 60 минут.

В реакции 2 схемы 1 арилсульфониламино-соединение формулы VI, в котором R¹⁶ является (С₁-С₆алкилом, бензилом, аллилом или трет-бутилом, превращают в соответствующее соединение формулы V, в котором n равно 1,3,4,5 или 6, реакцией VI с реактивным производным спирта формулы таким как хлорид, бромид или иодид, предпочтительно, бромид, где R¹⁷ защитная группа является (С₁-С₆)алкилом, бензилом, аллилом или трет-бутилом, в присутствии основания, такого как карбонат калия или гидрид натрия, предпочтительно, гидрид натрия, и полярного растворителя, такого как диметилформамид. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение периода времени от примерно 60 минут до примерно 48 часов, предпочтительно, примерно 18 часов. R¹⁷ защитную группу выбирают так, чтобы ее можно было селективно удалить в присутствии и без потери R¹⁶ защитной группы, поэтому R¹⁷ не может быть такой же, как и R¹⁶. Удаление R¹⁷ защитной группы из соединения формулы V, с получением соответствующей карбоновой кислоты формулы IV, в реакции 3 схемы 1, проводится в условиях, подходящих для этой конкретной используемой R¹⁷ защитной группы, которые не влияют на R¹⁶ защитную группу. Такие условия включают: (а) омыление, когда R¹⁷ является (С₁-С₆)алкилом, a R¹⁶ является трет-бутилом, (б) гидрогенолиз, когда R¹⁷ является бензилом, a R¹⁶ является трет-бутилом или (С₁-С₆)алкилом, (в) обработка сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота или хлористоводородная кислота, когда R¹⁷ является трет-бутилом, a R¹⁶ является (C₁-С₆)алкилом, бензилом или аллилом, или (г) обработка трибутил-оловогидридом и уксусной кислотой в присутствии каталитического бис(трифенилфосфин) палладия (П) хлорида, когда R¹⁷ является аллилом, a R¹⁶ является (С₁-С₆)алкилом, бензилом или трет-бутилом.

В реакции 4 схемы 1 карбоновую кислоту формулы IV конденсируют с амином, R¹R²NH, или их солью с получением соответствующего амидного соединения формулы III. Образование амидов из первичных или вторичных аминов или аммиака и карбоновых кислот достигается путем превращения карбоновой кислоты в активированное функциональное производное, которое в дальнейшем реагирует с первичным или вторичным амином или аммиаком с образованием амида. Активированное функциональное производное может быть выделено перед реакцией с первичным или вторичным амином или аммиаком. Альтернативно карбоновую кислоту можно обработать оксалилхлоридом или тионилхлоридом, чистым или в инертном растворителе, таком как хлороформ, при температуре от примерно 25^oC до примерно 80^oC, предпочтительно, при 50^oC, с получением соответствующего функционального хлоридного производного кислоты. Инертный растворитель и оставшийся оксалилхлорид или тиотилхлорид затем удаляют выпариванием в вакууме. Оставшееся функциональное хлоридное производное кислоты затем реагирует с первичным или вторичным амином или аммиаком в инертном растворителе, таком как метиленхлорид с образованием амида. Предпочтительным методом конденсации карбоновой кислоты формулы IV с амином для получения соответствующего амидного соединения формулы III является обработка IV (бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфония гексафторфосфатом в присутствии основания, такого как триэтиламин с получением in situ бензотриазол-1-окси-эфира, который в свою очередь реагирует с амином, R¹R²N, в инертном растворителе, таком как метиленхлорид, при комнатной температуре с получением амидного соединения формулы III.

Удаление R¹⁶ защитной группы у соединения формулы III с получением соответствующей карбоновой кислоты формулы II в реакции 5 схемы 1, проводят в условиях, подходящих для конкретной используемой R¹⁶ защитной группы. Такие условия включают: (а) омыление, когда R¹⁶ является низшим алкилом, (б) гидрогенолиз, когда R¹⁶ является бензилом, (в) обработку сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота или хлористоводородная кислота, когда R¹⁶ является трет-бутилом или (г) обработку гидридом трибутилолова и уксусной кислотой в присутствии каталитического бис (трифенилфосфин) палладия (П) хлорида, когда R¹⁶ является аллилом.

В реакции 6 схемы 1 соединение карбоновой кислоты формулы II превращают в соединение гидроксамовой кислоты формулы I обработкой П 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидом и 1-гидроксибензтриазолом в полярном растворителе, таком как диметилформамид, с последующим добавлением гидроксиламина к реакционной смеси через от примерно 15 минут до примерно 1 часа, предпочтительно через 30 минут. Предпочтительно, гидроксиламин образуется in situ, из солевой формы, такой как гидрохлорид гидроксиламина, в присутствии основания, такого как N- метилморфолин. Альтернативно, может быть использовано защищенное производное гидроксиламина или его соль, где гидроксильная группа защищена путем получения третбутилового, бензилового или аллилового эфира, в присутствии (бензотриазол-1- илокси)трис(диметиламино)фосфония гексафторфосфата и основания, такого как N-метилморфолин. Удаление защитной группы гидроксиламина производится гидрогенолизом в случае бензильной защитной группы или обработкой сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота, в случае третбутильной защитной группы. Аллильная защитная группа может быть удалена обработкой гидридом трибутилолова и уксусной кислотой в присутствии каталитического бис (трифенилфосфин) палладия (П) хлорида. В качестве защищенного гидроксиламинового производного можно также использовать N,0- бис(4-метоксибензил)гидроксиламин, причем удаление защиты достигается с применением смеси метансульфоновой кислоты и трифторуксусной кислоты.

В реакции 1 схемы 2 арилсульфонаминовое соединение формулы VI, где R¹⁶ является (С₁-С₆)алкилом, бензилом или трет-бутилом, превращают в соответствующее соединение формулы VIII, где R¹⁸ является 2-пропенилом или З-бутенилом, реакцией IX с реактивным функциональным производным, таким как галогенид, предпочтительно йодным производным, в 2-пропен-1-ол, когда R¹⁸ является 2-пропенилом или в З-бутен-1-ол, когда R¹⁸ является 3-бутенилом, в присутствии основания, такого как карбонат калия, карбонат цезия или гидрид натрия, предпочтительно, гидрид натрия, когда R¹⁸ является 2-пропенилом, или карбонат цезия, когда R¹⁸ является 3-бутенилом. Реакционную смесь перемешивают в полярном растворителе, таком как диметилформамид, при комнатной температуре в течение периода времени, равного от примерно 2 часов до примерно 48 часов, предпочтительно, в течение 18 часов.

В реакции 2 схемы 2 соединение по формуле VIII превращают в соединение карбоновой кислоты формулы IV, где n равно 2. Соединение формулы VIII, где R¹⁸ является 2-пропенилом, превращают в соединение формулы IV, где n равно 2, реакцией VIII с боран-диметилсульфидным комплексом с последующим немедленным окислением с использованием трехокиси хрома в водной уксусной кислоте. Окислительное отщепление концевых олефинов до карбоновых кислот может быть проведено несколькими известными в этой области технологии методами. Предпочтительный метод окислительного расщепления соединения формулы VIII, где R¹⁸ является 3-бутенилом для получения карбоновой кислоты формулы IV состоит в том, что соединение VIII реагирует с перйодатом натрия в присутствии каталитического количества хлорида рутения (III) в смеси четыреххлористого углерода, ацетонитрила и воды.

Соединение формулы IV, где n равно 2, далее реагирует с получением соединения гидроксамовой кислоты формулы I, где n равно 2, по методике, описанной выше для реакций 4, 5 и 6 схемы 1.

Альтернативный способ синтеза соединения гидроксамовой кислоты формулы I, где n равно 1, a R³ и R⁴ оба являются водородами, показан в реакции 1 схемы 3, начиная с реакции иминоуксусной кислоты или ее соли с металлом или аммонием формулы X с функциональным производным соединения арилсульфоновой кислоты, таким как арилсульфонилхлорид, при комнатной температуре в присутствии подходящего основания, такого как триэтиламин, и полярного растворителя, такого как тетрагидрофуран, диоксан, вода или ацетонитрил, предпочтительно, смеси диоксана и воды, с получением соответствующего соединения дикарбоновой кислоты формулы XI.

В реакции 2 схемы 3 соединение дикарбоновой кислоты формулы XI дегидрируют с получением циклического ангидрида формулы XII. Образование циклических ангидридов дегидрированием дикарбоновых кислот может быть осуществлено различными способами. Предпочтительный способ дегидрирования дикарбоновой кислоты формулы XI с получением циклического ангидрида формулы XII состоит в обработке XI избытком уксусного ангидрида при температуре в интервале от примерно 25^oC до примерно 80^oC, предпочтительно при примерно 60^oC. Избыток уксусного ангидрида и уксусной кислоты, побочный продукт реакции, удаляют выпариванием при пониженном давлении, причем остается циклический ангидрид формулы XII.

В реакции 3 схемы 3 циклический ангидрид формулы XII реагирует при комнатной температуре с амином, NR¹R², или солью этого амина, такой как гидрохлорид, в присутствии основания, такого как триэтиламин, с получением карбоновой кислоты формулы II, где n равно 1, a R³ и R⁴ оба являются водородами. Подходящими растворителями для реакции являются те, которые не будут реагировать с исходными материалами, и которые включают хлороформ, метиленхлорид и диметилформамид, предпочтительно, метиленхлорид.

Соединение формулы II далее реагирует с получением соединения гидроксамовой кислоты формулы I, где n равно 1, a R³ и R⁴ оба являются водородом, в соответствии с методикой, описанной выше для реакции 6 схемы 1.

В реакции 1 схемы 4 соединение карбоновой кислоты формулы IV, где n равно 2, превращают в соответствующее соединение формулы V, где R¹⁹ является (C₁-C₆)aлкилом или трет-бутилом, реакцией IV с соединением формулы (R¹⁹O)₂CHN(CH₃)₂, где R¹⁹ является (С₁-C₆)алкилом или трет-бутилом, в инертном растворителе, таком как толуол, при температуре в интервале от примерно 60^oC до примерно 100^oC, предпочтительно, примерно 100^oC, в течение периода времени от примерно 1 часа до примерно 3 часов, предпочтительно, 2 часов. В реакции 2 схемы 4 арилсульфониламино-соединение формулы VI, где n равно 1, 3,4,5 или 6, a R¹⁶ является (С₁-С₆)алкилом, бензилом, аллилом или трет-бутилом, превращают в соответствующее соединение формулы XIII, где R¹⁹ является (С₁-C₆)алкилом или трет-бутилом, реакцией VI с реактивным производным спирта формулы таким, как хлоридное, бромидное или йодное производное, предпочтительно бромидное производное, где R¹⁹ является (С₁-С₆)- алкилом или трет-бутилом, в присутствии основания, такого как карбонат калия или гидрид натрия, предпочтительно гидрид натрия, и полярного растворителя, такого как диметилформамид. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение периода времени от примерно 60 минут до примерно 48 часов, предпочтительно в течение примерно 18 часов. Защитная группа R¹⁶ соединений формулы IV и VI выбирается так, чтобы ее можно было селективно удалить в присутствии и без потери R¹⁹ (С₁-С₆)алкильной или трет-бутильной группы, поэтому R¹⁶ не может быть такой же, как и R¹⁹. Удаление защитной группы R¹⁶ у соединения формулы XIII с получением соответствующей карбоновой кислоты формулы XIV, где n равно 1-6, в реакции 3 схемы 4 производят в условиях, подходящих для данной конкретной использованной R¹⁶ защитной группы, которые не будут влиять на R¹⁹(С₁-С₆)алкильную или трет-бутильную группу. Такие условия включают: (а) омыление, когда R¹⁶ является (С₁-С₆)алкилом, a R¹⁹ является трет-бутилом, (б) гидрогенолиз, когда R¹⁶ является бензилом, a R¹⁹ является трет-бутилом или (C₁-С₆)алкилом, (в) обработку сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота или хлористоводородная кислота, когда R¹⁹ является трет-бутилом, а R¹⁹ является (С₁-C₆)алкилом, или (г) обработку гидридом трибутилолова и уксусной кислотой в присутствии каталитического бис (трифенилфосфин) палладия (П) хлорида, когда R¹⁶ является аллилом, a R¹⁹ является (С₁-С₆)-алкилом или трет-бутилом.

В реакции 4 схемы 4 карбоновую кислоту формулы XIV превращают в соединение гидроксамовой кислоты формулы XV, где n равно 1-6, обработкой XIV 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидом и 1-гидроксибензтриазолом в полярном растворителе, таком как диметилформамид с последующим добавлением гидроксиламина в реакционную смесь через от примерно 15 минут до примерно 1 часа, предпочтительно примерно через 30 минут. Гидроксиламин предпочтительно получают in situ из солевой формы, такой как гидроксиламина гидрохлорид, в присутствии основания, такого как N- метилморфолин. Альтернативно, защищенное производное гидроксиламина или его солевую форму, где гидроксильная группа защищена в виде трет-бутилового, бензилового или аллилового эфира, может использоваться в присутствии (бензотриазол-1-илокси) трис (диметиламино) фосфония гексафторфосфата и основания, такого как N-метилморфолин. Удаление групп, защищающих гидроксиламин, производится гидрированием в случае бензильной защитной группы или обработкой сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота, в случае трет-бутильной защитной группы. Аллильная защитная группа может быть удалена обработкой гидридом трибутилолова и уксусной кислотой в присутствии каталитического бис (трифенилфосфин) палладия (П) хлорида. В качестве защищенного производного гидроксиламина может также использоваться N,0-бис(4-метоксибензил) гидроксиламин, когда R¹⁹ является (С₁-С₆)алкилом, в этом случае удаление защитной группы проводится при использовании смеси метансульфоновой кислоты и трифторуксусной кислоты.

В реакции 5 схемы 4 амидное соединение формулы XV, если требуется, превращается в соответствующее соединение карбоновой кислоты формулы XVI (а) омылением, когда R¹⁹ является низшим алкилом или (б) обработкой сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота или хлорводородная кислота, когда R¹⁹ является трет-бутилом.

Фармацевтически приемлемыми солями кислотных соединений данного изобретения являются соли, образованные с основаниями, то есть катионные соли, такие как соли щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, литий, калий, кальций, магний, а также соли аммония, триметиламмония, диэтиламмония и трис-(гидроксиметил) -метиламмония.

Подобным же образом возможно получение солей присоединения кислот, таких как минеральные кислоты, органические карбоновые и органические сульфоновые кислоты, например, хлористоводородная кислота, метансульфоновая кислота, малеиновая кислота, благодаря тому, что основная группа, такая как пиридильная, составляет часть структуры.

Способность соединений формулы I или их фармацевтически приемлемых солей (здесь далее называемых соединениями данного изобретения) подавлять матричные металлопротеиназы или продуцирование фактора некроза опухолей (ФНО) и, следовательно, демонстрация их эффективности для лечения заболеваний, характеризующихся активностью матричных протеиназ или продуцированием фактора некроза опухолей, показана следующими исследованиями in vitro.

Биологическое испытание на ингибирование человеческой коллагеназы (ММР-1) Человеческую рекомбинантную коллагеназу активируют трипсином, используя следующее соотношение: 10 мкг трипсина на 100 мкг коллагеназы. Трипсин и коллагеназу инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, затем добавляют пятикратный избыток (50 мкг/10 мкг трипсина) ингибитора трипсина соевых бобов.

Готовят стандартные 10 мМ растворы ингибиторов в диметилсульфоксиде и затем разбавляют их, используя следующую схему.

10 мМ ---> 120 мкМ ---> 12 мкМ ---> 1,2 мкМ ---> 0,12 мкМ Двадцать пять микролитров раствора каждой концентрации затем добавляют в три повторные соответствующие ячейки 96-ячеечного микротитровального плата. Конечная концентрация ингибитора будет разведением 1:4 после добавления фермента и субстрата. Положительные контроли (фермент, без ингибитора) помещают в ячейки D1-D6, а растворы сравнения (без фермента, без ингибиторов) помещают в ячейки D7-D12.

Коллагеназу разводят до 400 нг/мл и затем добавляют в соответствующие ячейки микротитровального плата. Конечная концентрация коллагеназы в исследовании составляет 100 нг/мл.

Субстрат (DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-Lys (NMA) - NH₂) готовят в виде 5 мМ стандартного раствора в диметилсульфоксиде и затем разводят до 20 мкМ буфером для исследований. Исследование начинают добавлением 50 мкл субстрата в ячейку микротитровального плата с получением конечной концентрации 10 мкМ.

Показатели флуоресценции (возбуждение 360 нм, излучение 460 нм) определяли в момент 0 и затем через 20-минутные интервалы. Исследование проводят при комнатной температуре, причем обычное время исследования равно 3 часам.

Затем строили график зависимости флюоресценции от времени как для растворов сравнения, так и для образцов, содержащих коллагеназу (берут средние значения, определенные из трех повторений). Момент времени, в который получен хороший сигнал (раствор сравнения) и который находится на линейной части кривой (обычно около 120 минут) выбран для определения значений IC₅₀. Нулевой момент времени использован в качестве сравнения для каждого соединения при каждой концентрации, и эти значения вычитали из показаний для 120 минут. Строили график зависимости концентрации ингибитора от % контроля (флюоресценция раствора с ингибитором деленная на флюоресценцию раствора с одной коллагеназой х 100). Значения IC₅₀ определены по концентрации ингибитора, которая дает сигнал, равный 50% контрольного.

Если показано, что значения IC₅₀ < 0,03 мкМ, то ингибиторы оценивают при концентрациях 0,3 мкМ, 0,03 мкМ и 0,003 мкМ.

Ингибирование желатиназы (ММР-2) Ингибирование активности желатиназы исследовали, используя субстрат Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH₂ (10 мкМ) в тех же самых условиях, как и при ингибировании человеческой коллагеназы (ММР-1).

Желатиназу в 72 кД активируют 1 мМ АФРА (n-аминофенил-ртути ацетата) в течение 15 часов при 4^oC и разводят с получением конечной концентрации для исследования, равной 100 мг/мл. Ингибиторы разводят таким же образом, как и для определения ингибирования человеческой коллагеназы (ММР-1) с получением конечных концентраций исследования, равных 30 мкМ, 3 мкМ, 0,3 мкМ и 0,03 мкМ. Каждую концентрацию исследуют трижды.

Показатели флюоресценции (возбуждение 360 нм, излучение 460 нм) определяли в нулевой момент времени и затем через 20-минутные интервалы в течение 4 часов.

Значения IC₅₀ определены как и при ингибировании человеческой коллагеназы (ММР-1). Если сообщено, что значения IC₅₀ менее 0,03 мкМ, то ингибиторы исследовали при конечных концентрациях, равных 0,3 мкМ, 0,03 мкМ, 0,003 мкМ и 0,003 мкМ (см. табл. 1).

Ингибирование активности стромелизина (ММР-З) Изучение ингибирования активности стромелизина основано на модифицированном спектрофотометрическом исследовании, описанном Weingarten Н. and Feder J. (Weingarten H. and Feder J., Spectrophotometric Assay for Vertebrate Collagenase, Anal. Boochem. 147, 437-440 (1985)). Гидролиз тиопептолидного субстрата [Ac-Pro-Leu-Gly-SCH[CH₂CH(CH₃)₂] CO-Leu-Gly-OC₂H₅] дает меркаптановый фрагмент, который может быть зафиксирован в присутствии реагента Эллмана.

Человеческий рекомбинантный простромелизин активируют трипсином, используя соотношения: 1 мкл стандартного раствора трипсина с концентрацией 10 мг/мл на 26 мкг стромелизина. Трипсин и стромелизин инкубируют при 37^oC в течение 15 минут с последующей инкубацией с 10 мкл раствора ингибитора соевого трипсина с концентрацией 10 мг/мл в течение 10 минут при 37^oC для погашения активности трипсина.

Исследования проводили в общем объеме 250 мкл буфера для исследований (200 мМ хлорида натрия, 50 мМ MES и 10 мМ хлорида кальция, рН 6,0) в 96-ячеечных платах. Активированный стромелизин разводят буфером для исследований до 25 мкг/мл. Реактив Эллмана (3-карбокси-4-нитрофенилдисульфид) готовят в виде 1М стандартного раствора в диметилформамиде, разводят до 5 мМ буфером для исследований, получая 50 мкл на ячейку с конечной концентрацией 1 мМ.

Готовят 10 мМ стандартные растворы ингибиторов в диметилсульфоксиде и разводят серийно буфером для исследований так, что добавление 50 мкл в соответствующие ячейки дает конечные концентрации, равные 3 мкМ, 0,3 мкМ. 0,003 мкМ и 0.0003 мкМ. Все испытания проводились в трех повторных ячейках.

300 мМ стандартного раствора пептидного субстрата в диметилсульфоксиде разводят до 15 мМ буфером для исследования, и исследование начинают добавлением 50 мкл этого раствора в каждую ячейку с получением конечной концентрации 3 мМ субстрата. Растворы сравнения состоят из пептидного субстрата и реагента Эллмана без фермента. Образование продукта фиксировали при 405 нм с помощью считывающего устройства для плат Molecular Devices Uvmax.

Значения IC₅₀ определяли таким же образом, как и для коллагеназы.

Ингибирование ММР-13 Человеческую рекомбинантную ММР-13 активируют с помощью 2 мМ АФРА ацетата n-аминофенилртути в течение 1,5 часов при 37^oC и разводят до 400 мг/мл буфером для исследований (50 мМ Трис, рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 20 мкМ хлорида цинка, 0,02% brij). Добавляют двадцать пять микролитров разведенного фермента на ячейку 96- ячеечного плата. Фермент затем при исследовании разводят в соотношении 1:4 добавлением ингибитора и субстрата с получением конечной концентрации исследования, равной 100 мг/мл.

10 мМ стандартные растворы ингибиторов готовят в диметилсульфоксиде и затем разводят буфером для исследований, также по схеме разведения ингибитора для ингибирования человеческой коллагеназы (ММР-1). Двадцать пять микролитров раствора каждой концентрации добавляют в трехкратном повторении в ячейки микротитровального плата (для определения флюоресценции). Конечные концентрации при исследовании составляют 30 мкМ, 3 мкМ, 0,3 мкМ и 0,03 мкМ.

Субстрат (Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-Lys (NMA)-NH₂) готовят так же, как и для ингибирования человеческой коллагеназы (ММР-1) и добавляют в каждую ячейку 50 мкл с получением конечной концентрации исследования, равной 10 мкМ.

Показатели флюоресценции (возбуждение - 360 нм, излучение - 450 нм) снимали в момент времени 0 и через каждые 5 минут в течение 1 часа.

Положительные контроли включали фермент и субстрат без ингибитора, а растворы сравнения включали только субстрат.

IC₅₀ определяют так же, как и при подавлении человеческой коллагеназы (ММР-1). Если показано, что IC₅₀ менее 0,03 мкМ, ингибиторы затем оценивали при к