Антагонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (лг- рф) (варианты), способ их получения (варианты), фармацевтическая композиция и способ приготовления лекарственных препаратов

Антагонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (лг- рф) (варианты), способ их получения (варианты), фармацевтическая композиция и способ приготовления лекарственных препаратов

Реферат

 

Изобретение относится к новым антагонистам ЛГ-РФ, прежде всего к пептидомиметикам и пептидам с модифицированной боковой цепью, формулы V, где D-Xxx, R¹ - R⁸ охарактеризованы в описании, и их солям с фармацевтически приемлемыми кислотами, а также в нем описывается их терапевтическое применение в качестве аналога рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (ЛГ-РФ), обладающего высокой антагонистической активностью и не обнаруживающего нежелательных побочных действий, в особенности не стимулирующего отеков. Описывается также способ получения соединения формулы V путем твердофазного метода или частично твердофазного метода и получение терапевтического состава, обладающего высоким сродством к рецептору рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, включающего в качестве активного вещества соединения по пп. 1 - 4. Также описывается способ приготовления лекарственных препаратов, содержащих соединения по пп.1 - 9, характеризующийся тем, что данные соединения смешивают с вспомогательными веществами. 6 с. и 11 з.п.ф-лы, 7 табл., 6 ил.

Ac-D-Nal(2)¹-D-(pCl)Phe²-D-Phe(3)³-Ser⁴-Tyr⁵-D-Xxx⁶-heu⁷-Arg⁸-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂ (V).

Изобретение относится к новым антагонистам ЛГ-РФ, прежде всего к пептидомиметикам и пептидам с модифицированной боковой цепью и их солям с фармацевтически допустимыми кислотами, а также к способам синтеза антагонистов ЛГ-РФ и их солей. Заявленные согласно изобретению пептиды являются аналогами рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (ЛГ-РФ), который имеет следующую структуру: p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, [ЛГ-РФ, гонадорелин].

Исследования потенциальных селективных антагонистов декапептидов ЛГ-РФ проводятся уже более 20 лет [M.Karten und J.E.Rivier, Endocrine Reviews 7, 44-66 (1986)]. Повышенный интерес к таким антагонистам связан с потребностью в этих препаратах в ряде областей медицины: эндокринологии, гинекологии, контрацепции и онкологии. Было синтезировано большое количество соединений, представляющих собой потенциальные антагонисты ЛГ-РФ. Самый большой интерес среди синтезированных к настоящему времени соединений вызывают соединения с модифицированной структурой ЛГ-РФ.

Первая серия потенциальных антагонистов была получена путем введения эфиров ароматических аминокислот в положения 1, 2, 3 и 6 или 2, 3 и 6. Общепринятым способом описания таких модифицированных аналогов является следующий: прежде всего указывают аминокислотный остаток, которым заменяют имеющийся остаток в ЛГ-РФ, причем цифрами в надстрочном индексе указывают номер позиции аминокислотного остатка, в которой произошла замена. Далее, при описании аналогов, в структуре которых были произведены замены, будет использоваться сокращение "LH-RH" (ЛГ-РФ).

Известными антагонистами являются: [Ac-D-Phe(4-Cl)^1,2, D-Trp^3,6] LH-RH (D.H.Coy et al., In: Gross, E. and Meienhofer, J. (Eds) Peptides: Proceedings of the 6th American Peptid Symposium, S. 775-779, Pierce Chem.Co., Rockville III. (1979); [Ac-Pro¹, D-Phe(4-Cl)², D-Nal(2)^3,6] LH-RH (US-Patent Nr.4.419.347) и [Ac-Pro¹, D-Phe(4-Cl)², D-Trp^3,6] LH-RH (J.L.Pineda, et al., J.Clin. Endocrinol.Metab. 56, 420, 1983).

Позднее с целью повышения растворимости антагонистов в воде было осуществлено введение остатков основных аминокислот, например, D-Arg в положение 6. Например, [Ac-D-Phe(4-Cl)^1,2, D-Trp³, D-Arg⁶, D-Ala¹⁰] LH-RH (ORG-30276) (D. H.Coy, et al., Endocrinology 100, 1445, 1982) и [Ac-D-Nal(2)¹, D-Phe(4-F)², D-Trp³, D-Arg⁶] LH-RH (ORF 18260) (J.E. Rivier et al., in: Vickery B.H. Nestor, Jr.J.J., Hafez, E.S.E (Eds). LHRH and its Analogs, S.11-22 MTP Press, Lancaster, UK 1984).

Такие аналоги характеризуются не только ожидаемой повышенной растворимостью в воде, но и повышенной антагонистической активностью. Однако, эти в высшей степени гидрофильные аналоги, содержащие D-Arg и другие основные боковые цепи в положении 6, вызывают временные отеки лица и конечностей при подкожном введении крысам в дозе 1,25 или 1,5 мг/кг (F.Schmidt, et al., Contraception 29, 283, 1984: J.E. Morgan, et al., Int.Archs.Allergy Appl. lmmun. 80, 70 (1986). Другие потенциальные антагонисты ЛГ-РФ описаны в заявках WO 92/19651, WO 94/19370, WO 92/17025, WO 94/14841, WO 94/13313, US-A 5,300,492, US-A 5,140,009 и EP 0 413 209 А1.

Из-за стимуляции отека, обнаруженной при испытании некоторых из указанных антагонистов на крысах, возникли сомнения в безопасности применения этих соединений по отношению к человеку и в связи с этим задерживалось их внедрение в клиническую практику в качестве лекарственных средств.Таким образом существует необходимость в получении антагонистических пептидов, которые не обладают побочным действием.

Согласно изобретению эту проблему решают с использованием соединений общей формулы I где n = 4, R¹- алкилоксигруппа, арильная группа, аралкильная группа, гетероаралкильная группа, аралкилокси группа или гетероаралкилокси группа, в каждом конкретном случае незамещенная или замещенная, R² и R³- независимо друг от друга в зависимости от необходимости означают атом водорода, алкильную группу, аралкильную группу или гетероаралкильную группу, в зависимости от необходимости незамещенную или замещенную, причем замещение, в свою очередь, может включать арильную группу или гетероарильную группу, или -NR²R³ представляет собой аминокислотный остаток, причем R⁴ - группа формулы (II) где p - целое число от 1 до 4, R⁵ - водород или алкильная группа и R⁶ - незамещенная или замещенная арильная группа или гетероарильная группа, причем заместитель, в свою очередь, может включать арильную группу или гетероарильную группу, или R⁴ представляет собой кольцо общей формулы (III): в которой q - число 1 или 2, R⁷ и R⁸ являются атомами водорода, а Х представляет собой атом серы, причем ароматические или гетероароматические остатки могут существовать в полностью гидрированной форме, причем хиральные атомы углерода имеют L-конфигурацию; а также соли указанных соединений с фармацевтически приемлемыми кислотами.

Предпочтительными комбинациями остатков от R¹ до R⁴ являются следующие: a) R¹ - бензилокси, R² - водород и R³ - водород, б) R¹ - бензилокси, R² - водород и R⁴ - группа формулы II, в которой p - 2 или 3, R⁵ - водород и R⁶ - 4-амидинофенильная группа, а также в) R² - водород, R³ - водород и R⁴ - группа формулы II, в которой p - 2, R⁵ - водород и R⁶ - 4-амидинофенильная группа.

Алкильными группами предпочтительно являются метил-, этил-, н-пропил-, изопропил-, н-бутил-, изобутил-, трет-бутил-, 2-этилгексил-, додецил- и гексадецил группы.

Арильными группами предпочтительно являются фенил-, нафтил-, фенантранил- и флуоренил группы.

Гетероарильными группами предпочтительно являются 2-, 3- и 4-пиридил-, 2- и 4-пиримидил-, имидазолил-, имидазопиридил-, 5- и 6-индолил-, 5- и 6-индазолил-, триазолил-, тетразолил-, бензимидазолил-, хинолил-, 2,6- дихлорпиридо-3-ил- и фурил- группы.

Гидрированными гетероарильными группами предпочтительно являются пиперидин-, пиперазинил-, морфолино- и пирролидинил-группы.

Аралкильными группами и гетероаралкильными группами являются группы, которые связаны в соответствующем положении через алкиленовую группу, предпочтительно метилен-, этилен-, н-пропилен- или н-бутилен- группы.

Предпочтительными заместителями наряду с названными арил- и гетероарил-группами являются атомы галогена, такие как: фтор, хлор, бром и иод, а также метил-, этил-, изопропил-, трет-бутил-, циано-, нитро-, остатки карбоновой кислоты, амида карбоновой кислоты, метилового эфира карбоновой кислоты, этилового эфира карбоновой кислоты, этилового эфира кротоновой кислоты, трифторметил-, бензоил-, метокси-, бензилокси-, пиридилокси-, амино-, диметиламино-, изопропиламино-, амидино- и хинолилметокси- группы.

В дальнейшем, согласно изобретению, используют соединения общей формулы (V) [Ac-D-Nal(2)¹-D(pCl)Phe²-D-Pal(3)³-Ser⁴- Tyr⁵-D-Xxx⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-D- Ala¹⁰-NH₂, где D-Xxx - остаток аминокислоты общей формулы (VI) а также n, p, q, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ и X - как указано выше и их соли с фармацевтически приемлемыми кислотами с вышеназванными свойствами.

Заявленные согласно изобретению соединения характеризуются высокой антагонистической активностью и не обладают нежелательным побочным действием, прежде всего не вызывают отек. Если они используются не в виде солей с плохорастворимыми в воде фармацевтически приемлемыми кислотами, то эти соединения, кроме того, обладают повышенной растворимостью в воде. Эти соединения характеризуются высоким сродством к рецептору ЛГ-РФ человека, то есть являются высокоактивными при ингибировании высвобождения гонадотропинов из гипофиза млекопитающих, включая человека: при испытании на крысах обнаруживают пролонгированное ингибирование высвобождения тестостерона, а также вызывают минимальное высвобождение гистамина in vitro.

Соединениями общей формулы (1) предпочтительно являются: - N-Z-[-N'-4-(4-амидинофенил)-амино-1,4-диоксобутил]-лизинамид, - N-Z-[-N'-(имидазолидин-2-он-4-ил)-формил]- лизинамид.

Пептидами формулы V предпочтительно являются такие соединения, в которых Xxx - [- N'-4-(4-амидинофенил)-амино-1,4- диоксобутил]-лизил-группа или [-N'-(имидазолидин-2-он-4- ил)-формил]-лизил-группа. Предпочтительно соли с фармацевтически приемлемыми кислотами плохо растворимы в воде. Особенно предпочтительны соли 4,4'-метилен-бис(3-гидрокси-2-нафтойевой кислоты), известной также как эмбоновая или памоевая кислота.

Номенклатура, применяемая для обозначения пептида, соответствует правилам биохимической номенклатуры, опубликованным Административным советом ИЮПАК(IUPAC-IUB) (European J. Biochem., 1984, 138, 9-37), согласно которой стандартным способом представления пептида является указание N- концевого аминокислотного остатка слева, а C-концевого - справа. Заявленные согласно изобретению пептиды и пептиды-миметики, являющиеся антагонистами ЛГ-РФ, содержат как природные аминокислоты, так и синтетические аминокислоты, причем к первым относятся Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp и His. Аббревиатура отдельных аминокислотных остатков основывается на тривиальных названиях аминокислот: Ala - аланин, Arg - аргинин, Gly - глицин, Leu - лейцин, Lys - лизин, Pal(3) - 3-(3-пиридил)аланин, Nal(2) - 3-(2-нафтил)аланин, Phe - фенилаланин, (pCl)Phe - 4-хлорфенилаланин, Pro - пролин, Ser - серин, Thr - треонин, Trp - триптофан и Tyr - тирозин. Все вышеприведенные аминокислоты относятся к L-ряду, если не указано иное. Например, аббревиатура D-Nal(2) является сокращением от 3-(2-нафтил)-D-аланина и Ser - сокращением L-серина. Ниже другие используемые сокращения: Boc - трет-бутилоксикарбонил; Вор - бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)-фосфонийгексафторфосфат; DCC - дициклогексилкарбодиимид; DCM - дихлорметан; Ddz - диметоксифенил-диметилметиленоксикарбонил (диметоксидиметил-Z), DIC - диизопропилкарбодиимид; DIPEA- N,N-диизопропилэтиламин, DMF - диметилформамид; Fmoc - флуоренилметилоксикарбонил; HF - жидкая безводная фтористоводородная кислота; HOBt - 1-гидроксибензотриазол; HPLC - жидкостная хроматография высокого давления (ЖХВД); РуВор - бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидинофосфоний гексафторфосфат; TFA - трифторуксусная кислота; Z - бензилоксикарбонил.

Согласно изобретению соединения общей формулы (I) получают следующим образом: прежде всего обеспечивают защиту двух из трех функциональных групп ( - амино-, - -аминогруппа и - карбоксильная группа), а свободная незащищенная группа участвует в реакции конденсации. При известных условиях, если это возможно и приводит к наилучшим результатам, на первой стадии вводят промежуточные защитные группы, которые удаляют после второй стадии, чтобы получить требуемые функциональные группы. Походящие защитные группы и методы их введения известны в специальной литературе. Например, защитные группы описаны с следующих руководствах "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984), Lehrbuch "Solid Phase Peptide Synthesis" J.M.Steward and J.D. Young, Pierce Chem.Company, Rockford, III, 1984, и G.Barany and R.B.Merrifild "Peptides", Ch.1, S.1-285, 1979, Academic Press Inc.

Синтез соединений формулы (V) можно проводить либо при использовании классического метода конденсации фрагментов, либо с помощью твердофазного метода Меррифилда с постепенным наращиванием пептидной цепи и применением в качестве исходного соединения D-лизина, ацилированного по боковой группе карбоновой кислотой общей формулы VII, а также путем обеспечения реакции декапептидной единицы с соответствующими карбоновыми кислотами с образованием амидной связи в боковой цепи D-лизина⁶. В связи с этим, согласно изобретению, имеется два альтернативных способа для получения соединения общей формулы (V).

Первый альтернативный способ для получения соединения общей формулы (V) включает следующие стадии: а) связывание D-аланина, содержащего блокированную аминогруппу, с подходящей подложкой для твердофазного синтеза, б) удаление защитной группы с аминогруппы аланина, в) обеспечение реакции конденсации аланина, связанного с подложкой, с пролином, содержащим защищенный атом азота, г) удаление защитной группы с атома азота пролина, д) повторение стадий с) и г) с использованием аминокислот с первой по восьмую согласно общей формуле (V) в порядке от восьмой до первой, е) удаление соединения, полученного на стадии д), с подложки, ж) обеспечение реакции конденсации с карбоновой кислотой общей формулы (VII); R⁴COOH, - где R⁴ имеет значения, как указано выше, з) при необходимости обеспечение реакции конденсации с фармацевтически приемлемой кислотой, предпочтительно эмбоновой кислотой, с образованием соли.

Второй альтернативный способ синтеза соединения общей формулы (V) включает следующие стадии: а) связывание D-аланина, содержащего блокированную аминогруппу, с подходящей подложкой для твердофазного синтеза, б) удаление защитной группы с аминогруппы аланина, в) обеспечение реакции конденсации аланина, связанного с подложкой, с пролином, содержащим защищенный атом азота, г) удаление защитной группы с атома азота пролина, д) повторение стадий в) и г) с использованием аминокислот с шестой до восьмой согласно общей формуле (V) в порядке от восьмой до шестой, е) удаление защитной группы с - аминогруппы D-лизина или D-орнитина в положении 6 и обеспечение конденсации с карбоновой кислотой формулы (VII) ⁴-COOH, где R⁴ имеет значения, как указано выше, ж) удаление защитной группы с - аминогруппы D-лизина или D-орнитина, з) повторение стадий в) и г) с использованием аминокислот с первой до пятой согласно общей формуле (IV) в порядке от пятой до первой, и) удаление соединения, полученного на стадии з), с подложки и очистка (например, ЖХВД), к) при необходимости обеспечение реакции конденсации с фармацевтически приемлемой кислотой, предпочтительно эмбоновой кислотой, с образованием соли.

Третий альтернативный способ синтеза соединения общей формулы (V) включает следующие стадии: а) связывание D-аланина, содержащего блокированную аминогруппу, с подходящей подложкой для твердофазного синтеза, б) удаление защитной группы с аминогруппы аланина, в) обеспечение реакции конденсации аланина, связанного с подложкой, с пролином, содержащим защищенный атом азота, г) удаление защитной группы с атома азота пролина, д) повторение стадий в) и г) с использованием аминокислот с шестой до восьмой согласно общей формуле (V) в порядке от восьмой до шестой, е) удаление защитной группы с - аминогруппы D-лизина или D-орнитина в положении 6 и обеспечение конденсации с карбоновой кислотой формулы (Vll) ⁴-COOR, где R⁴ имеет значения, как указано выше, ж) удаление защитной группы с - аминогруппы D-лизина или D-орнитина, з) повторение стадий в) и г) с использованием аминокислот с первой до пятой согласно общей формуле (IV) в порядке от пятой до первой, и) удаление соединения, полученного на стадии з), с подложки и очистка (например, ЖХВД), к) при необходимости обеспечение реакции конденсации с фармацевтически приемлемой кислотой, предпочтительно эмбоновой кислотой, с образованием соли.

Предпочтительными карбоновыми кислотами формулы (VII) являются: имидазолидин-2-он-4-карбоновая кислота и N-(4-амидинофенил)-амино-4-оксомасляная кислота.

Соединения формулы (V) синтезируют в соответствии с известными методиками, например, при использовании твердофазного метода, частично твердофазного метода или классического синтеза в растворе (см. M.Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis" Springer Verlag 1984). Например, методы твердофазного синтеза описаны в руководствах Lehrbuch "Solid Phase Peptide Synthesis" J. M. Steward and J.D.Young, Pierce Chem.Company, Rockford, III, 1984, и G.Barany and R.B.Merrifild "Peptides", Ch.1, S.1-285, 1979, Academic Press Inc. Методы классического синтеза в растворе подробно описаны в руководстве "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Synthese von Peptiden" E.Wunsch (Herausgeber) 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD.

Ступенчатый синтез осуществляют, например, следующим образом: прежде всего C-концевую аминокислоту с защищенной - аминогруппой ковалентно присоединяют к общеизвестной нерастворимой подложке, удаляют защитную группу с - аминогруппы указанной аминокислоты и к полученной таким образом свободной аминогруппе присоединяют следующую аминокислоту с заблокированной аминогруппой, затем таким же образом, стадия за стадией присоединяют остальные аминокислоты в нужном порядке и после присоединения всех аминокислот готовый пептид удаляют с подложки. Ступенчатая конденсация осуществляется по стандартной методике с использованием подходящих аминокислот с аминогруппами, заблокированными в соответствии с общепринятым способом. Возможно также использование и автоматического синтезатора пептидов, например, типа Labortec SP 650 (Bachem, Швейцария) с применением коммерческих препаратов защищенных аминокислот.

Связывание аминокислот друг с другом осуществляют в соответствии с общепринятыми методиками, в частности могут быть использованы следующие методы: - метод симметричных ангидридов в присутствии дициклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида (DCC, DIC); - общий карбодиимидный метод; - карбодиимид-гидроксибензотриазольный метод (см. The Peptides, Volume 2, Ed. E.Gross and J.Meienhofer). Для присоединения аргинина предпочтительно используют карбодиимидный метод. Для остальных аминокислот в основном применяют методы симметричных или смешанных ангидридов.

Для соединения фрагментов предпочтительно используют азидный метод, не сопровождающийся рацемизацией, или DCC-1-гидроксибензотриазольный, или DCC-3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазиновый методы. Для соединения фрагментов можно также использовать и метод активированных эфиров.

При ступенчатой конденсации особенно предпочтительно применять активированные эфиры N-защищенных аминокислот, например, N-гидроксисукцинимидный эфир или 2,4,5- трихлорфениловый эфир. Для катализа аминолиза эффективно использовать N-гидроксисоединения, кислотность которых приблизительно равна кислотности уксусной кислоты, например, 1 -гидроксибензотриазол.

В качестве промежуточных защитных групп применяют группы, удаляемые гидрогенолизом, например, бензилоксикарбонильную группу (Z-радикал) или группы, отщепляемые в слабокислой среде. В качестве защитных групп - аминогрупп применяют, например, трет- бутилоксикарбонильные группы, карбобензокси-группы или карбобензотио- группы (при необходимости в каждом случае содержащие п-бром- или п-нитробензил-группу), трифторацетил-, фталил-, о-нитрофеноксиацетил-, тритил-, п-толуолсульфонил-, бензил-группы, замещенные в бензоловом ядре бензильные группы (п-бром или п-нитробензил), - фенилэтил-группы (см. руководства Jesse P. Greenstein und Milton Winitz, Chemistry of Amino Acids, New York, 1961, John Wiley and Sons, Inc., Volume 2, P.883 и следующие, a также The Peptides, Volume 2, Ed. E.Gross and J.Meienhofer, Academic Press, New York). Эти же защитные группы используют для блокировки функциональных групп боковых цепей (ОН-, NH₂-групп) соответствующих аминокислот.

Для защиты гидроксигрупп аминокислот (серина, треонина) предпочтительно используют бензильные или сходные с ними группы. Для защиты других боковых групп (например, - аминогруппы, гуанидиновой группы аргинина) предпочтительно используют ортогональный метод.

Реакцию конденсации аминокислот проводят в общепринятом для этих целей инертном растворителе или в суспензии (например, в дихлорметане), причем при известных условиях для увеличения растворимости можно добавлять диметилформамид.

Для введения R⁴-CO-группы путем конденсации аминогруппы лизина с карбоновой кислотой общей формулы (VII) могут быть использованы вышеуказанные методы конденсации аминокислот. Однако особенно предпочтительно проводить конденсацию в присутствии карбодиимида, например, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)- карбодиимида и 1-гидроксибензотриазола.

В качестве синтетических подложек используют нерастворимые полимеры, например, набухающую в органическом растворителе полистирольную смолу в виде гранул (например, сополимер полистирола и дивинилбензола (1%)). Синтез защищенного амида декапептида проводят на метилбензгидриламидной смоле (МВНА-смола, то есть полистирол, содержащий метилбензагидриламидные группы), причем после отщепления от подложки в присутствии HF получают пептид с необходимой С-концевой амидной группой в соответствии со схемой A (см. в конце описания).

Для синтеза пептида аминокислоты с N--Boc-защитными группами добавляют в трехкратном молярном избытке в присутствии диизопропилкарбодиимида (DIC) и 1-гидроксибензотриазола (HOBt) в CH₂Cl₂/DMF, конденсацию проводят в течение 90 мин и Boc-группу удаляют путем обработки 50% трифторуксусной кислотой (TFA) в CH₂Cl₂ в течение 30 мин. Для контроля полноты конверсии используют хлораниловый тест по Кристенсену и нингидриновый тест по Кайзеру. Остатки свободных аминогрупп блокируют ацетилированием с использованием ацетилимидазола (пятикратный избыток) в CH₂Cl₂.

На схеме приведена последовательность стадий синтеза пептида. На стадии отщепления пептида от смолы конечный продукт твердофазного синтеза сушат в вакууме над P₂O₅ и обрабатывают его после высушивания 500-кратным избытком смеси HF/анизол в соотношении 10:1/(об./об.) в течение 60 мин при 0^oC.

После удаления HF и анизола в вакууме и обработки остатка безводным этиловым эфиром амид пептида выпадает в виде белого твердого продукта, отделение пептида от выпавшего совместно с ним полимерного носителя проводят промывкой осадка 50%-ным раствором уксусной кислоты в воде. С помощью осторожного упаривания уксуснокислых растворов в вакууме можно получить соответствующий пептид в виде высоковязкого масла, которое после добавления к нему абсолютного эфира на холоду превращается в белый твердый продукт.

Дальнейшую очистку проводят с помощью препаративной ЖХВД.

Получение кислых солей пептидов осуществляют стандартным способом с помощью их обработки кислотами. Свободные пептиды можно получить обработкой их кислых солей основаниями. Эмбонаты пептидов можно получить обработкой солей трифторуксусной кислоты (TFA-соли) свободной эмбоновой (памоевой) кислотой или соответствующей динатриевой солью эмбоновой кислоты. Для этого водный раствор TFA-соли пептида смешивают с раствором динатриевой соли эмбоновой кислоты в диполярном апротонном растворителе, предпочтительно диметилацетамиде, и выделяют образующийся светложелтый осадок.

Для лучшего понимания сущности изобретения приведены следующие примеры, не ограничивающие область изобретения.

Пример 1 Получение Ac-D-Nal(2)-D(pCl)Phe-D-Pal(3)-Ser-Туr-D-[- N'- (имидазолидин-2-он-4-ил)формил]-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ Синтез проводят в соответствии с приведенной выше схемой с использованием 5 г смолы mBHA (нагрузка полимера растущими пептидными цепями составляет 1,08 мМоля пептида на 1 г полимера). Лизин присоединяют к полимеру в виде Fmoc-D-Lys(Boc)-OH, который после удаления Boc-защитной группы в боковой цепи лизина ацилируют трехкратным избытком имидазолидин-2-он-4-карбоновой кислоты. Затем удаляют Fmoc-защитную группу в присутствии 20% пиперидин/DMF и наращивают пептидную цепь по направлению к N-концу согласно схеме. Синтезированный пептид отщепляют от полимера и получают 5,2 г сырого продукта. Пептид подвергают очистке препаративной HPLC и после лиофильного высушивания получают 2,1 г пептида, который по данным ЖХВД представляет собой гомогенный продукт общей формулы C₇₄H₉₇N₁₈O₁₅Cl с молекулярной массой, скорректированной по данным FAB-масс-спектроскопии - 1514 (М+H⁺) (рассчитанная - 1512,7) и с соответствующим ¹H-ЯМР-спектром.

¹H-ЯМР (500 МГц, DMSO- d₆, в ppm): 8,56, m, аром.H; 8,08, m, 1H, аром. H; 7,81, m, 1H, аром.H: 7,73 m, 2H, аром.H; 7,66, m, 1H, аром.H; 7,60, s, 1H, аром.H; 7,44, m, 2H, аром.H; 7,30, d, 1H, аром.H; 7,25, и 7,18, 2 d, 2 x 2H, аром.H p-Cl-Phe; 6,97 и 6,60, 2 d, 2 x 2H, аром.H Tyr; 9,2-6,3, некоторые сигналы, амид-NH; 4,8-4,0, многочисленные m, C - H и алифатич.H; 2,1-1,1, многочисленные m, остаточный алифатич.H; 1,70, s, 3H, ацетил: 1,22, d, 3H, С - H Ala: 0,85, dd, С - H Leu.

Пример 2 Получение Ac-D-Nal(2)-D(pCl) Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-[ -N'-4-(4- амидинофенил)-амино-1,4-диоксобутил]-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Alа-N₂ 0,7 мМоля (1,03 г) декапептида Ac-D-Nal-D(pCl)Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ конденсируют с 0,1 мМоля (0,27 г) (4-амидинофенил)амино- 4-оксомасляной кислоты в присутствии 1,0 мМоля (0,16 г) 1-этил-3- (3-диметиламинопропил)-карбодиимида и 1,0 мМоля (0,16 г) 1- гидроксибензотриазола в свежеперегнанном DMF. После инкубировании реакционной смеси в течение 24 ч растворитель удаляют в вакууме, полученный остаток растворяют в воде и высушивают лиофильно. Полученный сырой продукт (1,63 г) подвергают очистке с помощью обратнофазовой ЖХВД и получают 0,61 г пептида, который по данным ЖХВД представляет собой гомогенный продукт суммарной формулы C₈₁H₁₀₄N₁₉O₁₅Cl с молекулярной массой, скорректированной по данным FAB-масс-спектроскопии - 1618,7 (М+H⁺) (рассчитанная - 1617,7) и с соответствующим ¹H-ЯМР-спектром.

¹H-ЯМР (500 МГц, DMCO-d₆, в ррm): 10,4, s, 1H у. 9,15, s, 2H, u 8,8, s, 1H, NH группы 4-амидиноанилина; 8,60, m, 2H, аром. H; 8,20, m, 1H, аром. H; 7,80, m, 1H, аром.H; 7,73, m, аром. H; 7,61, s, 1H, аром.H; 7,44, m, 2H, аром.H; 7,30, d, 1H, аром.H; 7,25 u 7,20, 2d, 4H, аром. H (pCl)Phe; 7,0 u 6,6, 2d,4H, аром.H Tyr: 8,3-7,2, некоторые сигналы, амид-NH; 4,73-4,2, некоторые мультиплеты, C -H; 4,13, m, 1H, C -H; Ala; 3,78-2,4, некоторые мультиплеты, C -H и алифатич.Н; 1,72, s, 3H, ацетил; 1,22, d, 3Н, C Ala: 0,85, dd, 6Н, C Leu.

Пример 3 К 0,5 г (0,3 мМоля) пептидного антагониста ЛГ-РФ, полученного согласно примеру 1, растворенного в 50 мл воды, добавляют раствор 0,130 г (0,3 мМоля) динатриевой соли эмбоновой кислоты в 2 мл воды, при этом получают эмбонат пептида, который быстро выпадает из раствора в виде желтого осадка. Получают 0,281 г тонкокристаллического порошка желто- зеленого цвета. Содержание эмбоновой кислоты составляет 33%.

Пример 4 К 0,3 г (0,17 мМоля) пептидного антагониста ЛГ-РФ, полученного согласно примеру 2, растворенного в 5 мл диметилацетамида, добавляют раствор 0,195 г (0,45 мМоля) динатриевой соли эмбоновой кислоты в 2 мл воды, при этом получают эмбонат пептида, который выпадает из раствора в виде желтого осадка после добавления 50 мл воды. Получают 0,330 г тонкокристаллического порошка желтого цвета. Содержание эмбоновой кислоты составляет 20%.

Соединения общей формулы I могут быть получены согласно следующим схемам 1, 3, 4 и 5, причем три функциональные группы R¹, R³ и R⁴ систематически варьируют. На схеме 1 приведен синтез соединения в соответствии с примером 1.

Общие принципы синтеза соединений общей формулы I согласно схеме 1.

Карбоновую кислоту R⁴-COOH, содержащую замещенный остаток R⁴ и лежащую в основе формулы I и схемы синтеза 1, и которая в случае основного остатка R⁴ может существовать также в виде соли, например, в виде хлоргидрата, гидросульфата или ацетата, растворяют или суспендируют в безводной среде при перемешивании в неполярном или диполярном апротонном органическом растворителе, например, в тетрагидрофуране, диоксане, метил-трет-бутиловом эфире, толуоле, диметилформамиде, диметилацетамиде, N-метилпирролидоне, диметилсульфоксиде или хлористом метилене и соединяют при перемешивании с основанием, которое применяют для удаления кислоты, например, с диизопропиламином, триэтиламином, N-метилморфолином, диметиламинопиридином или пиридином. Затем добавляют смесь Z-(L) -лизинамида гидрохлорида в разбавителе, причем в качестве разбавителя применяют растворитель, использованный для растворения карбоновой кислоты R⁴-COOH, содержащей заместитель R⁴. Затем pH реакционной смеси поддерживают с помощью основания, которое добавляют для связывания кислоты, в диапазоне 6,5-9,0, предпочтительно 7,0-8,5, особенно 7,0-7,5. Наконец, к реакционной смеси добавляют при перемешивании раствор конденсирующего агента, например, бензотриазол-1-ил-окси-трис(диметиламино)- фосфонийгексафторфосфат (ВОР) или бензотриазол-1-ил-окси-трис- пирролидинофосфонийгексафторфосфат (РуВОР) или дициклогексил карбодиимид (DCC) и через непродолжительный период времени снова доводят pH реакционной смеси в вышеуказанном диапазоне. Суспензию перемешивают, например, в течение 1-15 ч при 0-80^oC, предпочтительно при 10-50^oC, особенно при 20-30^oC, затем отфильтровывают, твердый продукт промывают и фильтрат высушивают в вакууме. Полученный остаток кристаллизуют путем растирания в органическом растворителе, например, толуоле, тетрагидрофуране, метилэтилкетоне или изопропиловом спирте, или очищают перекристаллизацией, перегонкой или колоночной или флэш-хроматографией на силикагеле или окиси алюминия. В качестве подвижной фазы используют, например, смесь, включающую хлористый метилен, метанол, аммиак (25%) в соотношении 85: 15:1 (б/б), или смесь, включающую хлористый метилен, метанол, аммиак (25%) в соотношении 80:25:5 (б/б).

Синтез трифторацетата Соединение, очищенное как указано выше, растворяют в протонном или апротонном растворителе, например, в спиртах, таких как метанол, этанол, изопропанол, или в циклических эфирах, например, тетрагидрофуране или диоксане, и pH среды доводят до 10-11 раствором 2 н. едкого натрия. Выпавший твердый продукт отфильтровывают, промывают, сушат в вакууме и раствор в этаноле смешивают со стехиометрическим количеством или 2-4-кратным избытком трифторуксусной кислоты при температуре от 10 до 80^oC, предпочтительно от 20 до 40^oC. Через 24 ч инкубирования реакционной смеси при 0-4^oC трифторацетат выпадает в осадок, который отфильтровывают и высушивают в вакууме.

Соединения, приведенные в таблице 1, синтезируют, как описывается в примере 5, согласно вышеуказанному общему методу, который является основой схемы синтеза 1.

Пример 5 Получение - N-[бензилоксикарбонил]- N-[5-[(4-амидинофенил)амино]-5-оксопентаноил]-L-лизинамид трифторацетат 5 г (17,5 мМоля) гидрохлорида 5-[[4-(аминоиминометил)фенил]-амино]- 5- оксопентановой кислоты суспендируют при перемешивании в 200 мл безводного диметилформамида и добавляют 3,85 мл (35,0 мМоля) N- метилморфолина, а затем к суспензии добавляют смесь 5,53 г (17,5 мМоля) гидрохлорида Z-(L)-лизинамида в 100 мл диметилформамида и pH среды доводят до 7,0-7,5 N-метилморфолином (NMM). На конечном этапе добавляют раствор 9,73 г (21,9 мМоля) бензотриазол-1-ил- окси-трис-(диметиламино)фосфоний-гексафторфосфата (ВОР) и после инкубирования в течение 10-15 мин снова устанавливают pH среды до 7,0-7,5. Суспензию желтого цвета перемешивают при постоянном контроле значения pH, которое должно составлять 7,0-7,5, в течение 3-4 ч при комнатной температуре, отфильтровывают бесцветный осадок. Осадок промывают дважды диметилформамидом и фильтрат желтого цвета упаривают досуха. Маслянистый остаток обрабатывают метилэтилкетоном (5 x 40 мл) и после каждой из пяти обработок растворителем фазу метилэтилкетона отделяют и отбрасывают. Выделившийся в кристаллической форме сырой продукт промывают 30 мл метилэтилкетона и сушат в вакууме при комнатной температуре.

Полученный твердый продукт растворяют приблизительно в 50 мл этанола и pH раствора доводят до 10-11 2 н. раствором едкого натрия. Выпавшее основание отфильтровывают, промывают водой и этанолом, сушат в вакууме при 35^oC.

Выход: 5,5 г (62% от теоретического) Трифторацетат: Суспензию 5,5 г основания в этаноле смешивают с пятикратным молярным избытком трифторуксусной кислоты при 60^oC. Раствор хранят в течение ночи при 4^oC, полученный трифторацетат отфильтровывают и сушат в вакууме при 35^oC.

Выход: 5,9 г (87,7% от теории) Температура плавления: 185^oC Данные элементного анализа: Рассчитано: C 53,84 H 5,65 N 13,45 Найдено: C 54,11 H 5,74 N 13,33 Структура соединений с общей формулой I, синтезированных по вышеприведенному методу, приведена в таблице 1, причем для всех примеров n равно 4.

Температура плавления соединений, полученных согласно вышеприведенным примерам, приведена в таблице 2.

Предшественники для синтеза соединений общей формулы I, полученных согласно схеме синтеза 1, структура которых приведена в таблице 1.

В качестве исходного вещества для синтеза соединений в соответствии с примерами 5-34 используют коммерческий препарат Z-(L)-лизинамида. Замещенные производные "арил"- или "гетероариламино-оксо-предельных кислот", полученные согласно схеме 1 и используемые для дальнейшего синтеза в качестве промежуточных производных, можно синтезировать и аналогично схеме 2 по известному в литературе методу (P.R.Bovy, J.Organ.Chem. 58, 7948 (1993)).

В качестве ароматических или гетероароматических аминов (A-NH₂) исходных соединений для синтеза по схеме 2, используют коммерческие препараты. Аминоимидазо[1,2а] пиридин, являющийся исходным соединением для синтеза согласно примеру 28, можно синтезировать аналогично известным в литературе методам (R.Westwood, J.Med.Chem 31, 1098 (1988)).

"Арил" или соответственно "гетероариламино-оксо-предельные кислоты", используемые в качестве исходных соединений, можно также синтезировать с помощью реакции аминолиза монометилового эфира предельной дикарбоновой кислоты, например, монометилового эфира субериновой кислоты и монометилового эфира азелаиновой кислоты с использованием ароматического или гетероароматического амина в кипящем этаноле или бутаноле, или по известной методике в ароматическом растворителе, например, толуоле или ксилоле при температуре кипения растворителя или в автоклаве при температуре кипения растворителя под давлением до 50 бар. Затем реакционную смесь концентрируют в вакууме и остаток кристаллизуют из метанола или этанола или подвергают очистке методом колоночной хроматографии. В качестве подвижной фазы используют, например, смесь, включающую хлористый метилен, метанол, аммиак (25%), в соотношении 85:15:1 (б/б) или хлористый метилен, метанол, аммиак (25%) в соотношении 80: 25:5 (б/б).

Альтернативным методом получения соединений общей формулы I, где R¹ - бензилоксикарбонильная группа, a R² и R³- атом водорода, является следующий: 1. Амидируют - карбоксильную группу.

2. В - аминогруппу вводят Z-защитную группу.

3. В аминогруппу вводят Boc-защитную группу, что обеспечивает селективность при более позднем удалении защитных групп с NH₂-групп.

4. Удаляют Z-группу с -аминогруппы.

5. В - аминогруппу вводят необходимый R⁴-CO-заместитель.

6. С - аминогруппы удаляют Boc-защитную группу.

7. В - аминогруппу вводят Z- защитную группу.

Другие соединения общей формулы I получают согласно схеме