Модифицированные углеводами цитостатические средства

Модифицированные углеводами цитостатические средства

Реферат

 

Описываются новые модифицированные углеводами соединения общей формулы K-Sp-L-AA1-AA2-C (I), где К, Sp, L, АА1, АА2 и С имеют указанные в п.1 формулы изобретения значения, и их изомеры и соли. Новые соединения обладают цитостатической активностью. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 10 табл., 1ил.

Изобретение относится к новым цитостатическим средствам, специфичным к опухолям, в частности к модифицированным углеводами соединениям цитостатической активности.

Химиотерапия при опухолевых заболеваниях сопровождается в большинстве случаев серьезными побочными действиями, обусловленными токсичностью химиотерапевтических средств в отношении пролиферирующих клеток других тканей. Уже много лет ученые занимаются проблемой улучшения селективности применяемых активных начал. Интенсивно разрабатывается синтез пролекарств, которые более или менее селективно высвобождаются в целевой ткани, например, в результате изменения значения pH (см. Tietze и др., например, патент DE N 4229903), с помощью ферментов (например, глюкуронидаз; см. Jacquesy и др., заявку ЕР N 511917, Bosslet и др., заявку ЕР N 595133) или антитело-ферментных конъюгатов (см. Bagshawe и др., заявку WO N 88/07378, Senter и др., патент США N 4975278, Bosslet и др., заявку ЕР N 595133). Проблематичными при этом оказываются, среди прочего, недостаточная стабильность конъюгатов в других тканях и органах и, в частности, повсеместное распределение активного начала, происходящее после внеклеточного высвобождения активного начала в опухолевой ткани.

Выраженная структура пектинов на поверхности опухолевых клеток (см. Gabius в источнике Onkologie 12, 1989 г., стр. 175) предоставляет принципиальную возможность путем связывания соответствующих компонентов углеводов с цитостатическими средствами целенаправленно воздействовать на опухолевые клетки. Эта перспектива ограничивается тем, что и в других тканях, в частности в печени, имеются пектины сходной специфичности в отношении углеводов (например, галактозы, лактозы, маннозы, N-ацетил-глюкозамина, фукозы и т.д.) (см. Ashwell и др. в источнике Annu. Rev. Biochem. 46, 1982 г., стр. 531: Stahl и др. в источнике Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977 г., стр. 1521: Hill и др. в источнике J. Biol. Chem. 262, 1986 г., стр. 7433; Jansen и др. в источнике J. Biol. Chem. 266, 1991 г., стр. 3343). Поэтому следует ожидать значительного накопления содержащих активное начало гликоконъюгатов в печени и в других богатых пектинами органах, если применяют такие немодифицированные сахары.

Гетероциклический амин батрацилин формулы (1) проявляет хорошее противоопухолевое действие в различных моделях рака кишки (см. патент США N 4757072).

Пептидные конъюгаты формулы (1) с хорошим действием ин витро и благоприятными свойствами растворимости (см. патент США N 4180343) при опыте на животных переносятся хуже, чем батрацилин. Описанные в заявке ЕР N 501250 конъюгаты фукозы сильно накапливаются в печени.

Хинолона формулы (2), 7-[(3aRS, 4RS, 7аSR)-4-амино-1,3,3а,4,7,7а- гексагидро-изо-индол-2-ил] -8-хлор-1-циклопропил-6-фтор-1,4- дигидро-4-оксо-3-хинолинкарбоновая кислота наряду с отличной антибактериальной активностью также обладает очень хорошим действием в отношении различных клеточных линий опухолей (см. заявку ЕР N 520240, заявку JP N 4253973). Этому противостоят, однако, значительные токсикологические проблемы, такие как, например, генотоксичность, токсичность в отношении костного мозга, высокая острая токсичность ин виво и т.д.

Задачей изобретения является получение новых модифицированных углеводами соединений цитостатической активности, обладающих сывороточной стабильностью, улучшенной клеточной и тканевой селективностью, в частности в случае опухоли печени, и улучшенной растворимостью и переносимостью.

Поставленная задача решается предлагаемыми модифицированными углеводами соединениями общей формулы (I) K-Sp-L-AA1-AA2-C, где K - незамещенный или региоселективно модифицированный углеводный остаток, Sp - арилен формулы где R означает хлор или гидроксиалкиламино, AA1 - остаток аминокислоты в D- или L-конфигурации, который может иметь защитные группы или вторую группу K-Sp-L-, в которой K, Sp, L независимо от другой группы K-Sp-L- могут иметь вышеуказанные значения, или прямая связь, AA2 - остаток аминокислоты в D- или L-конфигурации, который может иметь защитные группы или прямая связь, C - цитостатический остаток, остаток цитостатического средства или производного цитостатического средства, и их изомеры и соли.

Структурный элемент -Sp-L-AA1-АА2- в целом представляет собой спейсер, связывающий K и C.

Соединения формулы (I) могут иметься в стереоизомерных формах, например в виде энантиомеров или диастереомеров, или в виде их смесей, например в виде рацемата. Изобретение относится к чистым стереоизомерам, а также их смесям.

В случае необходимости смеси стереоизомеров можно разделять известным образом на единые стереоизомерные компоненты, например путем хроматографии или способов кристаллизации.

Соединения формулы (I) могут также иметься в виде их солей. В общем здесь можно назвать соли с органическими или неорганическими основаниями или кислотами, а также внутренние соли.

В число добавляемых кислот входят предпочтительно галогенированные водородные кислоты, например хлористо-водородная кислота и бромисто-водородная кислота, в частности хлористо-водородная кислота, далее фосфорная кислота, азотная кислота, серная кислота, моно- и бифункциональные карбоновые кислоты и гидроксикарбоновые кислоты, такие как, например, уксусная кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, оксалевая кислота, глюконовая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, салициловая кислота, сорбиновая кислота и молочная кислота, а также сульфокислоты, такие, как, например, п-толуолсульфокислота, 1,5-нафталиндисульфокислота или камфарная сульфокислота.

Физиологически невредные соли могут представлять собой металлические или аммониевые соли предлагаемых соединений, имеющие свободную карбоксильную группу. Особенно предпочтительными являются, например, соли натрия, калия, магния или кальция, а также аммониевые соли, которые производятся от аммиака или органических аминов, таких как, например, этиламин, ди- или триэтиламин, ди- или триэтиноламин, дициклогексиламин, диметиламиноэтанол, аргинин, лизин, этилендиамин или фенэтиламин.

В первую группу предпочтительных модифицированных углеводами соединений общей формулы (I) входят соединения, у которых K - углеводный остаток формулы (II) где A - метил, гидроксиметил, алкоксиметил, карбоксиалкилоксиметил, R₂, R₃, R₄ отдельно или вместе означают водород, гидроксил, алкилокси, гидроксиалкилокси, карбоксиалкилкарбонилокси, сульфат, или два из остатков R₂, R₃, R₄ вместе означают эпоксигруппу, Sp, L, AA1, AA2 и C имеют вышеуказанные значения, и их изомеры и соли.

Во вторую группу предпочтительных модифицированных углеводами соединений общей формулы (I) входят соединения, у которых Sp - арилен формулы К, L, AA1, AA2 и C имеют вышеуказанные значения, и их изомеры и соли.

В третью группу предпочтительных модифицированных углеводами соединений общей формулы (I) входят соединения, у которых C - хинолонкарбоновая кислота (а, б, в и г), батрацилин, камптотецин, доксорубицин, мелфалан, K, Sp, L, AA1 и AA2 имеют вышеуказанные значения, и их изомеры и соли.

В четвертую группу предпочтительных модифицированных углеводами соединений общей формулы (I) входят соединения, у которых AA1 - остаток аминокислоты, производимый от глицина, аланина, валина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, орнитина, тирозина, или серина в D- или L-конфигурации, который может быть связан с дополнительной группой K-Sp-L, или прямая связь, K, Sp, L, AA2 и C имеют вышеуказанные значения, и их изомеры и соли.

В пятую группу предпочтительных модифицированных углеводами соединений общей формулы (I) входят соединения, у которых AA2 - остаток аминокислоты, производимый от глицина, аланина, лизина, орнитина, диаминопропионовой кислоты или серина в D- или L-конфигурации, или прямая связь, К, Sp, L, AA1 и C имеют вышеуказанные значения, и их изомеры и соли.

В шестую группу предпочтительных модифицированных углеводами соединений общей формулы (I) входят соединения, у которых C означает остаток формулы (III) T-Q, где Q - остаток формулы где Y-C-R⁵, где R⁵ означает водород, галоген или метокси, X₁ - водород, галоген, X₂ - водород, аминогруппа, или Q - остаток формулы где X₃ означает галоген, T - остаток формулы где R⁶ - водород, алкил с 1 - 3 атомами углерода, и К, Sp, L, AA1 и AA2 имеют вышеуказанные значения, и их изомеры и соли.

Благодаря вышеупомянутой активности соединения формулы (I) могут представлять собой активное вещество цитотоксического средства, являющегося дополнительным объектом изобретения.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Примеры серии А: Биологические опыты Пример A.1 Тест торможения роста для определения цитотоксических свойств гликоконъюгатов батрацилина и хинолона-а Клеточные линии SW480 и НТ 29 (АТСС N CCL 228 и НВТ-38) толстого кишечника человека и клеточную линию B16F10 меланомы мыши выращивают в чашках Ру в буфере RPMI 1640, содержащем 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Затем обрабатывают трипсином и подают в буфер RPMI, содержащий 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и далее культивируют до достижения 50000 клеток/мл. В каждую чашку микротитратора с 96 чашками подают 100 мкл клеточной суспензии и инкубируют в термостате в атмосфере двуокиси углерода при температуре 37^oC в течение суток. Потом добавляют еще 100 мкл буфера RPMI и 1 мкл ДМСО с испытуемыми соединениями. Рост проверяют после третьего и шестого дней. Для этого в каждую чашку наносят 40 мкл раствора МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5- дифенилтетразолин-бромида) с исходной концентрацией 5 мг/мл воды. Инкубируют в термостате в атмосфере двуокиси углерода при температуре 37^oC в течение 5 часов, после чего буфер отсасывают и к каждой чашке добавляют 100 мкл изопропанола. После 30-минутного встряхивания 100 мкл воды экстинкцию измеряют при 540 нм с помощью прибора Titertek Multiskan МСС/340.

Цитотоксическое действие описанных гликоконъюгатов батрацилина в таблице 1а приведено в качестве значения KT₅₀ (концентрация 50%-ного торможения) для клеточных линий SW480 и НТ 29.

В таблице 1б сведены значения KT₅₀ гликоконъюгатов хинолона-а в отношении клеточных линий SW480, НТ 29 и B 16 F 10.

Зависимость биологического действия от углеводов дополнительно доказана неактивностью сравнительных соединений серий примеров 5, 6 и 11 N-[ N,N- бис-(4-гидроксифениламино- тиокарбонил)-лизил]-батрацилин и N-[ N,N- бис- (4-гидроксифениламино-тиокарбонил)-лизил-D-аланил]-батрацилин или N-[ N,N- бис-(4-гидроксифениламино-тиокарбонил)-D-лизил- хинолон-а (значения KT₅₀ > 250).

Пример А.2 Испытание ин витро на расщепляемость гликоконъюгатов Кинетика расщепления с применением крови человека 1,225 мл крови человека вместе с 1,25 мл фосфатно-солевого буферного раствора и 25 мкл маточного раствора субстрата (1 мг/мл в 3% ДМСО в фосфатно-солевом буферном растворе) инкубируют при температуре 37^oC. Через 1 час и через 24 часа отбирают пробы в количестве по 1 мл, смешивают с 1 мл этанола, после чего оставляют стоять при 4^oC в течение 20 минут. Центрифугируют 5 минут при 3500 об/мин, после чего отбирают 100 мкл надосадочной жидкости для анализа с помощью высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии.

Кинетика расщепления с применением клеток 2,25 мл фосфатно-солевого буферного раствора вместе с 225 мкл клеточной суспензии (30 мг/мл) и 25 мкл маточного раствора субстрата (1 мг/мл в 3% ДМСО в фосфатно-солевом буферном растворе) инкубируют при температуре 37^oC. Через 1 час и через 24 часа отбирают пробы в количестве по 1 мл, смешивают с 1 мл этанола, после чего оставляют стоять при 4^oC в течение 20 минут. Центрифугируют 5 минут при 3500 об/мин, после чего отбирают 100 мкл надосадочной жидкости для анализа с помощью высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии.

Условия высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии: Хроматограф: прибор фирмы Waters Колонна: марки Bischoff Hypersil OCS RP 18 5 мкм 250 x 4 мм Элюент A: 10 ммол буфера фосфата калия, pH 4,5 Б: смесь 80% ацетонитрила и 20% воды Скорость подачи: 1 мл/мин Длина волны: 372 нм Градиент: 0 мин - 10% Б 10 мин - 60% Б 15 мин - 60% Б 18 мин - 10% Б 20 мин - 60% Б Элюент конъюгатов хинолона-а: А: 100% метанола Б: 10 ммол буфера фосфата калия, pH 2,2 10 ммол гептансульфокислоты.

Результаты приведены в табл. 2а, 2б.

Пример А.3 Испытание по распределению в органах Во всех экспериментах были использованы атимические голые мыши штамма NMRI nu/nu, которых разводят в лаборатории "Drug Development Laboratory, Oncotest GmbH" проф. X.X. Фибига в г. Фрайбурге. Животных держали в поликарбонатных клетках (торговой марки Макролон) в условиях ламинарного потока. В качестве опухолевого материала употребляли ткань клеточной линии SW 480, которая предварительно несколькими операциями переноса была введена в мыши.

Голым мышам в возрасте 6 - 8 недель подкожно имплантировали в боки по двум опухолям на животное. До рандомизации животных держали в течение 26 - 27 суток. Тогда средний размер опухолей составлял 500 мг и радиус опухолей - около 10 мм.

Сама фармакокинетика произошла следующим образом: голым мышам инъецировали испытуемое соединение, после чего мышей хранили еще в клетках до отбора пробы через полчаса или 4 ч. Отбор пробы начался с взятия крови. Для этого мышь наркотизировали эфиром в течение 30 - 60 с. Через 0,5 ч или же 4 ч после введения соединения открыли брюшную полость, мышь в наркозе обескровливали через вену Vena cava caudalis в течение 1 - 2 мин и затем умерщвляли путем перелома шейного отдела позвоночника. В результате этого происходила остановка системы кровообращения и прекращение перфузии органов. В дальнейшем отдельные органы освобождали и вынимали, что длилось около 5 мин. Непосредственно после этого взвесили пробы органов и затем остальное тело и замораживали в жидком азоте.

Соединение "конъюгат 1" внутрибрюшинно вводили в количестве 300 мг/кг веса тела, а соединение "конъюгат 2" вводили в количестве 100 мг/кг в хвостовую вену. При проведении опыта для каждого соединения и каждой дозы были использованы по 5 животным.

Результаты распределения конъюгата 1 приведены в таблице 3, а конъюгата 2 - в таблице 4.

А. Калибровка 5, 10, 50, 100 и 200 мкг соединения, растворенного в смеси этанола и воды в объемном соотношении 1:1, добавляли к 1 г печени коровы. Затем измельчали с помощью 1 г песка и 2,5 мл охлажденной смеси этанола и воды в объемном соотношении 1: 1 и пробы центрифугировали в течение 2 минут при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, остаток еще раз перемешивали с 2,5 мл смеси этанола и воды, центрифугировали и супернатанты объединяли. Отбирали по 100 мкл и подвергали анализу с помощью высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии.

Условия высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии: Хроматограф: прибор фирмы Waters Колонна: марки Bischoff Hypersil ODS RP 18 5 мкм 250 x 4 мм Элюент: А: смесь 80% ацетонитрила и 20% воды Б: 10 ммол буфера фосфата калия, pH 4,5 Градиент: 0 мин - 90% Б 10 мин - 40% Б 15 мин - 40% Б 18 мин - 90% Б 20 мин - 90% Б Скорость подачи: 1 мл/мин Длина волны: 372 нм Б. Обработка органов Обработку осуществляли аналогично примеру А, причем все органы обрабатывали 2,5 мл смеси этанола и воды и экстрагировали.

В. Обработка крови Отобранное количество крови перемешивали с 2 мл смеси этанола и воды в объемном соотношении 1:1, центрифугировали в течение 2 мин при 3500 об/мин и надосадочную жидкость декантировали. К остатку еще раз добавляли 2 мл смеси этанола и воды в объемном соотношении 1:1, центрифугировали и супернатанты объединяли. Отбирали по 100 мкл объединенных супернатантов и подвергали анализу с помощью высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии в условиях, приведенных в примере А.

Конъюгант 1 (заявка EP N 501250 Конъюгант 2 (пример 3.9) Пример A.4 Определение острой токсичности гликоконъюгатов батрацилина (разовое введение) Острую токсичность производных батрацилина определяли на голых мышах штамма nu/nu.

Внутривенно введенные соединения один раз инъецировали мышам в виде водных растворов, а внутрибрюшинно введенные соединения - в виде растворов ДМСО в концентрациях до 400 мг соединения на кг мыши.

Переносимую разовую дозу вычисляли на основе потери веса животных до 21-го дня после введения соединения и на основе числа выживших животных.

Переносимые разовые дозы соединений приведены в таблице 5.

В случае соединений примеров 3.16, 3.33, 3.9, 6.12, 6.14, 6.2, 6.81, 8.2 доза составляла свыше 200 мг соединения на кг мыши. В случае соединений примеров 3.33, 6.12, 6.14, 6.2, 6.81 даже при дозе 400 мг/кг острой токсичности не было найдено.

В отличие от этого не содержащий сахара лизил-D-аланил- батрацилин примера 2.13 проявлял заметную токсичность уже при разовых дозах, составлявших от 25 до 50 мг на кг мыши.

Пример А.5 Определение острой токсичности после многократного введения Часть соединений ввели внутривенно, другую часть - внутрибрюшинно, либо ежедневно в дни с 1-4 и с 7-10, либо в дни 1, 5 и 9. Дозировки составляли 400, 200 и 100 мг/кг в день. Анализ осуществляли на основе потери веса животных до 21-го дня и на основе числа выживших животных. Для проведения опыта для каждого соединения и каждой дозы были использованы по 5 животным. Результаты приведены в таблице 6.

Пример A.6 Кроветворная активность гликоконъюгатов хинолона-а по сравнению с соответствующим активным началом Материал и методы Испытание ин витро: Клетки костного мозга вымывали из бедра мыши. 10⁵ клеток в среде марки McCoy 5А (0,3% агара) вместе с рекомбинантным мышиным колоние-стимулирующим фактором (GM-CSF) (торговый продукт Гензиме; образование колоний основных клеток) и соединениями (10^-4 - 100 мкг/мл) инкубировали при температуре 37^oC в атмосфере, содержащей 7% двуокиси углерода. Спустя 7 дней определили число колоний (< 50 клеток) и кластеров (17 - 50 клеток).

Испытание ин виво: Мышам подкожно ввели 1, 3, 10, 30 мг/кг соединений. В различные промежутки времени (через 3, 24, 48, 72 ч. после инъецирования) удаляли бедра и выделяли клетки костного мозга. 2 10⁵ клеток вышеописанным образом инкубировали вместе с рекомбинантным мышиным колоние-стимулирующим фактором (GM-CSF) и спустя 7 дней определили число колоний и кластеров.

Результаты: По данным таблицы 7 испытанные гликоконъюгаты по сравнению с хинолоном-а проявляли уменьшенное на фактор 10⁵ - 10³ торможение пролиферации основных клеток костного мозга.

И при испытании ин виво по сравнению с хинолоном-а торможения пролиферации основных клеток соединением примера 12.3 в дозировке до 30 мг/кг не наблюдалось. Уже при введении 3 мг/кг хинолона-а было индицировано массивное подавление пролиферации основных клеток (см. чертеж).

Пример A.7 Противоопухолевая активность конъюгатов хинолона-а Активность ин витро гликоконъюгатов хинолона-а определяли на опухолевых ксенотрансплантатах человека в системе двухслойного культивирования на мягком агаре по Гамбургеру и Салмону (см. источник Science 197, стр. 461-463).

Твердые опухоли сначала выращивали в атимической голой мыши штамма NMRI nu/nu, выделяли операцией и раздробляли механическим способом. Отдельные клетки получали потом в результате инкубации при 37^oC в течение 30 минут в смеси ферментов, а именно 0,05% коллагеназы, 0,07% ДНКазы и 0,1% гиалуронидазы в буфере RPMI. Клетки два раза промывали, после чего их просеивали через сито с размером отверстий 200 мкм и 20 мкм.

Применили следующий способ культивирования: Нижний слой содержал 0,2 мл модифицированной по способу Дульбекко среды Искова с 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,7% агара. На этот слой наносили 40000 - 200000 клеток в 0,2 мл той же самой среды и 0,4% агара в чашки микротитратора с 24 чашками. Цитостатические соединения добавляли в 0,2 мл среды.

Культуры инкубировали в атмосфере, содержащей 7% двуокиси углерода, при температуре 37^oC в течение 6 - 15 дней. Потом выросшие колонии подвергали количественному анализу в инвертированном микроскопе, при этом за 24 часа до анализа живущих колоний подкрашивали красителем на основе хлористого тетразола.

Активность активного начала выражается в % выживших колоний по сравнению с числом колоний необработанных чашек (Т/С = число колоний обработанных чашек 100/число колоний необработанных чашек).

Соединение является активным, если значение Т/С 30%.

В таблице 8 это значение приведено в качестве значения KT₇₀ в мкг/мл.

Пример A.8 Испытания ин виво Метод: В день 0 мышам инокулируют 510⁶ опухолевых клеток типа B 16 F 10. У животных развиваются твердые брюшинные опухоли, после чего им ежедневно вводят испытуемые соединения или же только носитель для них. В контрольной группе обычно погибает 50% животных в период с 14 по 20 день. Испытуемые соединения вводят в буфере или в системе органических растворителей, состоящей из 20% метанола и 20% диметилсульфоксида в 0,7%-ном растворе поваренной соли.

Дача носителя не влияет на срок выживания животных. Терапевтический успех вытекает из продления времени выживания обработанных животных. Переносимость соединений анализируют параллельно на животных, не имеющих опухолей. По результатам переносимости и продления срока выживания можно ориентировочно определить терапевтический индекс.

Таблица 9 показывает терапевтическую активность соединения примера 11.12 на мышах, которым трансплантировали опухоль типа B16F10.

Пример А.9 Торможение ин виво роста опухоли при применении модели голой мыши Материал: Для всех экспериментов ин виво для испытания торможения роста опухоли использовали атимических голых мышей штамма NMRI nu/nu. Выбранный крупноклеточный рак легкого типа LXFL 529 выращивали в голых мышах серийными переносами. Человеческое происхождение опухоли было доказано изоферментативными и иммуногистохимическими методами.

Проведение эксперимента: Голым мышам штамма nu/nu в возрасте 6 - 8 недель опухоль подкожно имплантировали в оба боки. В зависимости от времени роста с удвоением объема лечение начали, как только радиус опухолей достиг 5 - 7 мм. Мышей распределяли путем рандомизации по группе лечения и контрольной группе (5 мышей в каждой группе с 8 - 10 подвергающимися анализу опухолями). Все отдельные опухоли контрольной группы росли прогрессивно.

Размеры опухолей измеряли с помощью раздвижного калибра в двух измерениях. Объем опухоли, который находится в хорошем соотношении с числом клеток, употребляли затем для всех анализов. Объем определяли по формуле "длина ширина ширина /2" ([а b²]/2, а или b означают два прямоугольно расположенных диаметра).

Значения относительного объема опухоли каждой отдельной опухоли определяли путем деления размера опухоли в день H на размер опухоли в день 0 (в момент рандомизации). Средние значения относительного объема опухоли употребляли для дальнейшего анализа.

Торможение увеличения объема опухоли (объем опухолей в испытуемой группе /контрольной группе, T/C, в %) представляло собой окончательную измеренную величину.

Лечение: Все соединения давали по интермиттирующему плану соответственно в день 1, 5 и 9. Все соединения вводили внутрибрюшинно при использовании воды в качестве растворителя.

Соединения камптотецина в данном опыте проявляли, как правило, сравнимую или лучшую активность.

Примеры серии Б: Примеры получения соединений Пример 1.1 п-аминофенил-2-O-метил- - L-фукозид 1.1.а) п-нитрофенил-3,4-O-изопропилиден- -L-фукозид Раствор 750 мг (2,63 ммоль) п-нитрофенил- -L-фукозида в 40 мл смеси диметилформамида и диоксана в соотношении 1:2 при 0^oC смешивают с 65 мг п-толуолсульфокислоты и 5 раз через каждые 30 минут 100 мкл 2-метоксипропена. После перемешивания при 20^oC в течение 16 часов сгущают и очищают путем флеш-хроматографии с применением в качестве элюента смеси дихлорметана и метанола в соотношении 99: 1. После сгущения получают 710 мг (83%) белого твердого вещества.

1.1.б) п-нитрофенил-2-O-метил-3,4-O-изопропилиден- - L-фукозид 100 мг (0,307 ммоль) соединения примера 1.1.а) смешивают с 96 мкл метил-йодида в 10 мл тетрагидрофурана, после чего порциями смешивают с 11 мг 80%-ного гидрида натрия. После перемешивания при 20^oC в течение 3 часов к смеси добавляют еще 96 мкл метилйодида и 11 мг гидрида натрия. После дальнейшего перемешивания при 20^oC в течение 16 часов к смеси добавляют небольшое количество воды и 100 мл дихлорметана. Реакционную смесь дважды встряхивают вместе с водой, органическую фазу сгущают и продукт очищают путем колоночной хроматографии с применением в качестве элюента смеси петролейного эфира и этилацетата в соотношении 8:1. Выход: 78 мг (75%).

1.1) п-аминофенил-2-О-метил--L-фукозид 78 мг (0,23 ммоль) п-нитрофенил-2-O-метил-3,4-O- изопропилиден- -L-фукозида перемешивают при 20^oC в течение 16 часов в 3 мл 80%-ной уксусной кислоты. Потом уксусную кислоту удаляют в вакууме, реакционную смесь смешивают с 10 мл метанола и после добавки двуокиси платины гидрируют в атмосфере водорода при незначительном избыточном давлении. Суспензию фильтруют на силикате марки Celite, после чего фильтруемый материал промывают метанолом. После очистки путем хроматографии с применением в качестве элюента смеси дихлорметана и метанола в соотношении 97,5: 2,5 получают 77 мг (80%) целевого продукта. Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 9:1, R_f = 0,42.

Пример 1.2 п-аминофенил-3-O-метил- -L-фукозид 1.2.а) п-нитрофенил-3-О-метил- -L-фукозид 6 г (21 ммоль) п-нитрофенил- -L-фукозида в 300 мл абсол. метанола смешивают с 7,84 г (31,5 ммоль) окиси дибутилолова и нагревают с обратным холодильником в течение двух часов. Затем сгущают, остаток сушат и подают в 300 мл диметилформамида. После добавки 15,7 мл метилйодида реакционную смесь перемешивают в течение 40 часов при 70^oC. Растворитель удаляют в вакууме и остаток подают в 300 мл дихлорметана. Суспензию фильтруют, остающийся раствор снова сгущают и подвергают флеш-хроматографии с применением в качестве элюента смеси дихлорметана и метанола в соотношении 99:1. После сгущения получают 3815 мг (61%) целевого продукта.

1.2) п-аминофенил-3-О-метил- -L-фукозид 3,81 г (12,73 ммоль) п-нитрофенил-3-O-метил- -L-фукозида гидрируют аналогично примеру 1.1. Выход: 3 г (88%). Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 9:1; R_f = 0,53.

Пример 1.3 п-аминофенил-3-О-метил- -L-фукозид Соединение получают аналогично примеру 1.2 из п-нитрофенил- -L-фукозида.

Выход: 63% через две стадии. Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 9:1; R_f = 0,39.

Пример 1.4 п-аминофенил-4-O-метил- -L-фукозид 1.4.а) п-нитрофенил-2-O-бензил-4-O-ацетил- -L-фукозид 1 г (3,5 ммоль) п-нитpoфенил- -L-фукoзидa в 100 мл абсол. тетрагидрофурана смешивают с 31 мг п-толуолсульфокислоты и 1134 мг (7 ммоль) триэтилортоацетата. После перемешивания в течение 15 минут при 20^oC растворитель отгоняют в вакууме. Остаток подают в 50 мл тетрагидрофурана и 3 мл диметилформамида, после чего смешивают с 4165 мкл бензилбромида и 210 мг 60%-ного гидрида натрия. После перемешивания при 20^oC в течение часа к смеси добавляют 10 мл 80%-ной уксусной кислоты, сгущают и остаток очищают путем флеш-хроматографии с применением в качестве элюента смеси дихлорметана и метанола в соотношении 99:1. После сгущения и сушки получают 1236 мг (85%) целевого продукта.

1.4.б) п-нитрофенил-2-O-бензил-3-O-ацетил-4-O-метил- -L- фукозид 1000 мг (2,39 ммоль) п-нитрофенил-2-O-бензил-4-O-ацетил- - L-фукозида растворяют в 60 мл бензола. После добавки 2988 мкл метилйодида и 1109 мг окиси серебра реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение 8 часов. Полученную смесь разделяют на компоненты путем флеш-хроматографии с применением в качестве элюента смеси дихлорметана и метанола в соотношении 99:1. Выделяют 239 мг (23%) п-нитрофенил-2-О-бензил-3-O-ацетил-4-O- метил- -L-фукозида и 653 мг (63%) изомерного п-нитрофенил- 2-O-бензил-3-O-метил-4-O-ацетил- -L-фукозида в виде белого твердого вещества.

1.4) п-аминофенил-4-O-метил- -L-фукозид 224 мг (0,52 ммоль) п-нитрофенил-2-O-бензил-3-O- ацетил-4-O-метил- -L-фукозида растворяют в 20 мл метанола и смешивают с 390 мкл 1н. раствора метилата натрия. После перемешивания в течение 16 часов при 20^oC нейтрализуют 80%-ной уксусной кислотой, сгущают и подают в дихлорметан. Органическую фазу промывают 1-н. раствора бикарбоната натрия и водой, сушат и сгущают. Остаток подают в 20 мл метанола и гидрируют над палладием на активном угле аналогично примеру 1.1. После сгущения продукт подают в воду и подвергают лиофилизации. Выделяют 119 мг (88%) белого аморфного твердого вещества. Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 9:1; R_f = 0,38.

Пример 1.5 п-аминофенил-3-О-н-пропил- -L-фукозид 1.5.а) п-нитрофенил-2-O-бензил-3-O-н-пропил-4-O-ацетил- L-фукозид Аналогично примеру 1.4.б) соединение примера 1.4.а) подвергают взаимодействию с пропилйодидом с получением изомерных продуктов 3- и 4-пропилирования. В результате разделения путем хроматографии получают п-нитрофенил-2-O-бензил-3-O-н-пропил-4-O-ацетил--L-фукозид (выход: 49%) и п-нитрофенил-2-O-бензил-3-O-ацетил-4-O-н-пропил--L-фукозид (выход: 29%).

1.5.б) п-аминофенил-3-O-н-пропил- -L-фукозид Фракцию 1 примера 1.5. а) подвергают реакции аналогично примеру 1.4 с получением 78% целевого соединения. Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 9:1; R_f = 0,42.

Пример 1.6 п-аминофенил-3-десокси- -L-фукозид 1.6.а) п-нитрофенил-3,6-дидесокси-3-хлор-4-O-ацетил- -L- гулозид 1 г (3,5 ммоль) п-нитрофенил- -L-фукозида в 100 мл тетрагидрофурана смешивают с 31 мг п-толуолсульфокислоты и 1134 мг (7 ммоль) триэтилортоацетата. После перемешивания в течение 15 минут при 20^oC растворитель отгоняют в вакууме. Добавляют 100 мл насыщенного раствора хлористого водорода в дихлорметане. После 10-минутной реакции сгущают и продукт очищают путем флеш-хроматографии с применением в качестве элюента смеси дихлорметана и метанола в соотношении 99:1. Получают 793 мг (65%) целевого продукта. Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 97,5: 2,5; R_f = 0,36.

1.6.б) п-нитрофен ил-З,6-дидесокси-З-хлор- -L-гулозид 375 мг (1,08 ммоль) п-нитрофенил-3,6-дидесокси-3-хлор-4-O- ацетил- -L-гулозида растворяют в 25 мл метанола и смешивают с 10 каплями 1н. раствора метилата натрия. По истечении 20 минут подкисляют уксусной кислотой, сгущают и распределяют между 400 мл дихлорметана и 60 мл воды. Органическую фазу сушат, сгущают и осаждают из смеси дихлорметана и диэтилового эфира. Получают 315 мг (96%) целевого продукта.

1.6.) п-аминофенил-3-десокси- -L-фукозид 315 мг (1,04 ммоль) п-нитрофенил-3,6-дидесокси-3-хлор- L-гулозида растворяют в 40 мл метанола, смешивают с 200 мг палладия на активном угле и 290 мкл триэтиламина, после чего смесь гидрируют в течение 4 дней в атмосфере водорода при незначительном избыточном давлении. Суспензию фильтруют, промывают, сгущают и продукт очищают путем флеш-хроматографии с применением в качестве элюента смеси дихлорметана и метанола в соотношении 97,5:2,5. Получают 160 мг (65%) десокси-соединения. Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 95:5; R_f = 0,18.

Пример 1.7 п-аминофенил-3,4-дидесокси- -L-фукозид 400 мг (1,16 ммоль) п-нитрофенил-3,6-дидесокси-3-хлор-4- O-ацетил- -L-гулозида примера 1.6.а) растворяют в 55 мл метанола, смешивают с 323 мкл триэтиламина и гидрируют в атмосфере водорода при незначительном избыточном давлении над 10%-ным палладием на активном угле. После перемешивания в течение 16 часов при 20^oC фильтруют на силикате марки Celite, промывают, сгущают и подают в 100 мл метанола. К смеси добавляют 1,5 мл 1н. раствора метилата натрия и перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Нейтрализуют уксусной кислотой, сгущают и полученные продукты разделяют путем флеш-хроматографии с применением в качестве элюента смеси дихлорметана и метанола в соотношении 97,5:2,5. После сгущения соответствующих фракций и переосаждения из смеси метанола и диэтилового эфира получают 120 мг (46%) целевого соединения. Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 95:5; R_f = 0,31 и 77 мг (28%) п-аминофенил-3-десокси- -L-фукозида. Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 95:5; R_f = 0,18.

Пример 1.8 п-аминофенил-3,4-эпокси- -L-фукозид 80 мг (0,23 ммоль) п-нитрофенил-3,6-дидесокси-3-хлор-4-O-ацетил- -L-гулозида примера 1.6. а) подают в 10 мл метанола и смешивают с 345 мкл 1н. раствора метилата натрия. После ультразвуковой обработки в течение часа подкисляют 80%-ной уксусной кислотой, сгущают и подвергают хроматографии с применением в качестве элюента смеси дихлорметана и метанола в соотношении 99: 1. После сгущения соответствующих фракций продукт подают в метанол и гидрируют над палладием на активном угле аналогично примеру 1.1. Получают 46 мг (75%) целевого соединения. Масс-спектр (бомбардировка быстрыми атомами, далее: "бба"):m/e = 238 = М+1.

Пример 1.9 п-аминофенил-4-десокси- -L-фукозид Данное соединение получают аналогично методу авторов T. Lindhorst и J. Thiem в источнике Carbohydr. Res. 209 (1991 г.), стр. 119, исходя из п-нитрофенил- -L-фукозида через п-нитрофенил-2,3-ди-O-бензоил-4,6-дидесокси- 4-йод- -L-фукозид. Тонкослойная хроматография: смесь дихлорметана и метанола в соотношении 90:10; R_f = 0,3.

Пример 1.10 п-аминофенил-3-О-карбоксиметил- -L-фукозид 1.10.а) п-нитрофенил-3-О-метоксикарбонилметил- -L- фукозид 1 г (3,5 ммоль) п-нитрофенил- -L-фукозида и 1,3 г (5,2 ммоль) окиси дибутилолова нагревают с обратным холодильником в 50 мл метанола в течение 2 часов. Раствор сгущают, остаток подают в 50 мл диоксана, смешивают с 2 мл сложного метилового эфира бромуксусной кислоты и 100 мг йодида тетрабутиламмония и нагревают с обратным холодильником