Имплантируемые агарозно-коллагеновые шарики, содержащие клетки, которые продуцируют способный к диффузии биологический продукт, и их применение

Имплантируемые агарозно-коллагеновые шарики, содержащие клетки, которые продуцируют способный к диффузии биологический продукт, и их применение

Реферат

 

Изобретение относится к медицине. Имплантируемые шарики, которые сделаны из агарозы и коллагена и/или покрыты агарозой, содержат внутри выборки клеток. Клетки продуцируют способные к диффузии биологические продукты. Такие шарики можно применить как имплантаты, чтобы модулировать иммунный ответ реципиента. Эти шарики также можно применять в условиях in vitro, чтобы способствовать росту специфических типов клеток, продуцировать желаемые продукты в культуре или подавлять рост определенных клеток. Такие имплантаты также могут подавлять рост определенных клеток, будучи введенными какому-либо субъекту, в частности раковых клеток. Изобретение позволяет доставлять клетки в эффективной и безопасной форме. 6 с. и 17 з.п.ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к инкапсуляции клеток в агарозе и коллагене с последующим покрытием агарозой, к терапевтическим методам, которые используют такие материалы и клетки, и к их производству.

Инкапсуляция различных биологических материалов в биологически совместимых материалах является методикой, которая какое-то время уже использовалась, но с ограниченным успехом. Примерами уровня техники в этой области являются патенты США за N 5227298 (Weber, et al.): 5053332 (Cook et al.); 4997443 (Wathall et al.); 4971833 (Larsson et al.): 4902295 ((Wathall et al. ); 4798786 (Tice et al.); 4673566 (Goosen et al.); 4647563 (Mosbach et al.): 4409331 (Lim); 4392909 (Lim); 4352883 (Lim) и 4663286 (Tsang et al.). Интерес также представляет одновременно рассматриваемая заявка с серийным N 08/483738, поданная 7 июня 1995 на Jain et al., которая включена сюда путем ссылки. Jain et al. обсуждает с некоторой степенью детализации инкапсуляцию секреторных клеток в различные биосовместимые материалы. Как рассмотрено здесь, секреторными клетками являются клетки, которые секретируют биологические продукты. Обычно секреторные клетки обладают по крайней мере некоторыми свойствами эндокринных клеток, и обычно их можно рассматривать как эквиваленты клеток, которые являются эндокринными по природе. В одновременно рассматриваемой заявке обсуждаются, например, инкапсуляция клеток, продуцирующих инсулин, предпочтительно в виде островков, в агарозно-коллагеновые ширики, которые также покрыты агарозой. Получающиеся продукты полезны в лечении состояний, например диабета, когда субъекту требуется инсулиновая терапия.

В заявке от Jain et al. рассматриваются с некоторой степенью детализации существовавшие прежде подходы в этой области, которые использовались в трансплантационной терапии. Они суммированы также и здесь.

Известны пять основных подходов к защите трансплантируемой ткани от иммунного ответа хозяина. Все они включают в себя попытки изолировать трансплантированную ткань от иммунной системы хозяина. Те методики иммуноизоляции, которые применялись, включают в себя экстраваскулярные диффузионные камеры, интраваскулярные диффузионные камеры, интраваскулярные ультрафильтрационные камеры, микроинкапсуляцию и макроинкапсуляцию. Однако все эти методы оказались неудачными из-за одной или более проблем из числа следующих: фиброзная реакция хозяина на материал имплантата, нестабильность материала имплантата, ограниченная диффузия питательных веществ через полупроницаемые мембраны, проницаемость стимуляторов секреции и продуктов и задержка при диффузии через полупроницаемые мембранные барьеры.

Например, известна процедура микроинкапсуляции для заключения в полупроницаемую мембрану жизнеспособных клеток, тканей и других лабильных мембранных структур, которую Lim разработал в 1978 г. (Lim, Research report to Damon corporation (1978)). Lim применял микрокапсулы из альгинатов и поли-L-лизина, чтобы инкапсулировать островки Лангерганса. В 1980 было сообщено о первом успешном применении этой новой методики in vivo в исследованиях диабета (Lim et at., Science 210: 908 (1980)). Результатом имплантации этих микроинкапсулированных островков Лангерганса было поддержание эугликемического состояния у животных с диабетом. Однако другие исследователи, повторяя эти эксперименты, обнаружили, что альгинат вызывает тканевую реакцию, и не смогли воспроизвести результаты Lim et al. (Lamberti et al. Applied Biochemistry and Biotechnology 10: 101 (1984); Dupuy et al. J. Biomed. Material Res. 22: 1061 (1988); Weber et al. Transplantation 49: 396 (1990) и Doon-shiong et al. Transplantation Proceedings 22: 754 (1990)). Теперь считается, что причиной ограниченной стабильности и биосовместимости этих микрокапсул in vivo является растворимость этих полимеров в воде (Dupuy et al., см. выше; Weber et al., см. выше; Doon-shiong et al., см. выше: Smidsrod, Faraday Discussion of Chemical Society 57: 263 (1974)).

Недавно Iwata et al. (lwata et al., J. Biomedical Material and Res. 26: 967 (1992)) использовали агарозу для микроинкапсуляции аллогенных панкреатических островков и обнаружили, что она может использоваться как среда для приготовления микрошариков. В их исследовании 1500-2000 островков были микроинкапсулированы индивидуально в 5% агарозе и имплантатированы мышам с стрептозотоцин-индуцированным диабетом. Имплантаты сохраняли жизнеспособность в течение длительного времени, а реципиенты сохраняли нормогликемию неопределенно долго.

Однако их метод страдает множеством недостатков. Он громоздок и неаккуратен. Например, многие шарики остаются покрытыми частично, и образуются многие сотни шариков из пустой агарозы. Таким образом, требуется дополнительное время для того, чтобы отделить инкапсулированные островки от пустых шариков. Боле того, большая часть имплантированных микрошариков собирается в тазовой полости, и для достижения нормогликемии требуется большое число островков в полностью покрытых индивидуальных шариках. И, кроме того, трансплантированные шарики трудно взять обратно, они имеют склонность к ломкости и легко высвобождают островки при малейшем повреждении.

Процедура макроинкапсуляции также прошла проверку. Для иммуноизоляции островков Лангерганса готовили макрокапсулы из множества разных материалов, таких как поли-2-гидроксиэтилметакрилат, поливинилхрорид-C-акриловая кислота и ацетат целлюлозы. (Cм. Altman et al., Diabetes 35: 625 (1986); Altman et al., Transplantation: American Society of Artificial Internal Organs 30: 382 (1984): Ronel et al., J. Biomedical Material Research 17: 855 (1983); Klomp et al. , J. Biomedical Material Research 17:865-871 (1983)). Во всех этих исследованиях была достигнута только временная нормализация гликемии.

Archer et al. (Journal of Surgical Research 28: 77 (1980)) использовали полые волокна из акрилового сополимера для того, чтобы временно предотвратить отторжение ксенографтов островков. Они сообщили о длительном сохранении жизнеспособности имплантатов, представляющих собой диспергированную поджелудочную железу новорожденной мыши, в полых волокнах, которые были трансплантированы хомякам с диабетом. Недавно Lacy et al. (Science 254: 1782- 1784 (1991)) подтвердили их результаты, но обнаружили, что эугликемическое состояние является временной фазой. Они нашли, что, когда островки вводятся в волокно, они агрегируют в полых трубках, результатом чего является некроз в центральной части массы островков. Центральный некроз мешал пролонгации трансплантата. С целью решить эту проблему эти авторы использовали альгинат, чтобы диспергировать островки внутри волокна. Однако этот эксперимент не был повторен в расширенном варианте. Поэтому функционирование такой мембраны в качестве среды для трансплантации островков людям остается под вопросом.

Таким образом, существует необходимость в осуществлении пересадки секреторных клеток и, в особенности, сохранении жизнеспособности аллографтов и ксенографтов панкреатических островков без хронического применения иммуносупрессоров.

В вышеуказанной работе Jain et al. эти изобретатели сообщили, что инкапсулирование секреторных клеток в материале, представляющем собой гидрофильный гель, имеет результатом функциональный неимуногенный материал, который можно трансплантировать животным и хранить длительное время. Инкапсуляция секреторных клеток дает более эффективную и регулируемую методику для трансплантации секреторных клеток. Методика инкапсуляции была описана как полезная для инкапсуляции других биологических агентов, таких как ферменты, микроорганизмы, трофические агенты, включая получаемые рекомбинантными методами трофические агенты, цитотоксические агенты и хемотерапевтические агенты. Была обсуждена полезность инкапсулированных биологических агентов для лечения состояний, о которых известно, что они поддаются действию таких биологических агентов.

В обозначенной выше заявке никак не обсуждается включение клеток, которые продуцируют способные к диффузии биологические материалы, при том что последние полезны в терапевтическом контексте. Здесь же проведено различие между секреторными клетками и клетками, которые производят биологические материалы, способные к диффузии. Первые, как они, например, приведены в заявке Jain, обычно соответствуют продуктам, таким как гормоны, агенты клеточной сигнализации и т. д. , которые в норме считаются биологическими "мессенджерами" (посланниками). В отличие от них биологические материалы, способные к диффузии, соответствуют таким материалам, как пептиды, представляемые главным комплексом гистосовместимости (МНС: Major Histocompatibility Complex), и регуляторы клеточной экспрессии, такие как супрессоры, промоторы, индукторы и т.д. В области онкологии это различие будет видно на примере того, что будет рассмотрено ниже.

Обширные исследования рака включают работы по изучению гетерогенных клеточных экстрактов и различных клеточных компонентов. С помощью моноклональных антител в этой области идентифицированы важные связанные с раком антигены, например GM2, TF, STn, MUC-1 и различные полученные от них эпитопы. Существующая теория постулирует, что эпитопы этих разнообразных опухолевых маркеров образуют нековалентные комплексы с молекулами МНС, образуя таким образом агротипы для специфических цитолитических Т-клеток. Этот механизм не сильно отличается от разных механизмов, вовлеченных в биологическую реакцию на вирусные инфекции. В этой связи надо принять во внимание работы Van der Bruggen et al. (Science 254: 1643-1647 (1991)): Boon et al. (5, 405, 940) и Boon et al. (5, 342, 774), которые все включены путем ссылки.

Дополнительные исследования, которые шли параллельно с работой по идентификации так называемых раковых эпитопов, были сосредоточены на регуляции раковой пролиферации, такой как осуществляемая путем подавления, или, что будет более общим, биомодуляции. См. например Mitchell (J. Clin. Pharmacol 32: 2-9 1992)), MacLean et al. (Can. J. Oncol. 4: 249-254 (1994)). Целью, которая объединяет все эти различные подходы к раку, является такая модификация иммунного ответа организма-хозяина, которая привела бы к некоторому улучшению состояния пациента.

Ключевой для всех этих подходов является активность одного или нескольких способных к диффузии биологических продуктов, которые действуют совместно с другими материалами так, чтобы модулировать иммунный ответ. Boon et al. и van der Bruggen et al. описывают небольшие пептидные молекулы. Mitchell et al. обсуждают молекулы побольше, которые функционируют, например, как супрессоры.

Одна из проблем со всеми терапевтическими подходами, которые используют эти материалы, состоит в том, чтобы доставлять их в безопасной и эффективной форме. Это не просто. К удивлению, сейчас обнаружено, что методики Jain et al. , которые были так полезны в разработке способов лечения тех состояний, для которых требуются продукты секреторных клеток, теперь можно использовать в других областях.

То, как можно это осуществить, является предметом данного изобретения, детальное описание которого следует ниже.

Пример 1.

В этом и последующих примерах использованы клетки RENCA. Эти клетки представляют собой клетки спонтанной почечной аденокарциномы мышей BALB/C, которые широко доступны, будучи поддерживаемыми в культурах как in vitro, так и in vivo. См. Franco et al. Cytokine Induced Tumor Immunogenecity. 181-193 (1994).

Образцы замороженных клеток RENCA оттаивали при 37^oC и затем помещали во флаконы для тканевых культур, содержащие модифицированную эссенциальную среду Дульбекко (D-MEM: Dulbecco's Modified Essential Medium), в которую добавляли 10% бычью сыворотку, пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл) с получением того, что далее здесь будет называться "полная среда".

Клетки растили до конфлюэнтности и затем трипсинизировали с последующей промывкой сбалансированным солевым раствором Хэнка, а затем полной средой, упомянутой выше.

Чтобы определить, эффективно ли клетки RENCA образуют опухоли, по 10⁶ этих клеток вводили двум мышам BALB/C внутрибрюшинно. Мышей наблюдали в течение 3-4 недель. Клинически они выглядели нормально в первые две недели и проявляли нормальную активность. Затем становились очевидными клинические проявления рака. Одна мышь умерла через 23 дня, а вторая через 25 дней. После смерти мышей обследовали и отметили наличие множества опухолей разных размеров. Некоторые из этих опухолей были еще и кровоточащими.

Пробу одной из опухолей, взятой у одной из мышей, фиксировали в 10% формалине, чтобы позже провести гистологическое исследование.

Пример 2 После демонстрации того, что клетки RENCA действительно росли in vivo, были проведены исследования с целью определить, могут эти клетки расти в шариках по данному изобретению.

Клетки RENCA растили до конфлюэнтности, как описано, выше и трипсинизировали и промывали, как описано выше. Затем готовили пробы клеток численностью от 60000 до 90000. Затем клетки центрифугировали при 750 об./мин и удаляли жидкость. Затем клетки суспензировали в растворе 1% ателоколлагена в забуференном фосфатом физрастворе, pH 6,5.

1% раствор агарозы с низкой вязкостью готовили в минимальной эссенциальной среде (MEM: Minimal Essential Medium), выдерживали при 60^oC, a затем 100 мкл этого раствора добавляли к суспензии клеток RENCA и ателлоколлагена, описанной выше. Затем эти материалы немедленно переносили в виде одной большой капли в стерильное минеральное масло, имеющее комнатную температуру. Эта смесь образовывала один гладкий полутвердый шарик. Всю эту процедуру повторяли для получения множества таких шариков.

Через одну минуту шарики переносили в описанную выше полную среду при 37^oC. Затем шарики трижды промывали минимальной эссенциальной средой, содержащей указанные выше антибиотики. Затем шарики инкубировали в течение ночи при 37^oC в увлажненной атмосфере, состоящей из воздуха и 5% CO₂. После инкубации шарики, теперь твердые, переносили в стерильную ложку, которая содержала 1 мл 5% агарозы в минимальной эссенциальной среде. Шарики перекатывали в этом растворе 2-3 раза, чтобы равномерно покрыть их агарозой. Затем шарики до затвердевания агарозы переносили в минеральное масло, чтобы получить гладкую внешнюю поверхность. Через 60 секунд промывали шарики пять раз полной средой при 37^oC, чтобы удалить масло. Затем следовала инкубация в течение ночи (37^oC, увлажненная атмосфера, состоящая из воздуха и 5% CO₂). Эти шарики, содержащие клетки RENCA, использовали в последующих экспериментах.

Пример 3 Перед проведением исследований in vivo было необходимо определить, станут ли клетки RENCA расти в шариках, приготовленных, как описано выше.

Для этого инкубировали шарики, приготовленные, как обсуждено в примере 2, в среде, описанной в примере 2, в течение трех недель в указанных условиях. Затем три из этих шариков разрезали на маленькие кусочки и культивировали в стандартном флаконе для культивирования так, чтобы был прямой контакт как с флаконом, так и культуральной средой.

Наблюдение этих культур показало, что клетки росли и образовывали стандартные колонии клеток RENCA. Это указывало на то, что клетки в шариках оставались жизнеспособными.

Пример 4 Затем провели эксперименты in vivo. В этих экспериментах инкубировали шарики в течение семи дней при 37^oC. После этого трансплантировали шарики мышам. Для этого у каждой из четырех мышей делали срединный разрез, выполненный внутрибрюшинно, и имплантатировали три шарика, каждый с 60000 клеток RENCA. Затем разрезы закрывали (двухслойное ушивание) с помощью абсорбируемого шва. Эти четыре мыши (BALB/C) были нормальными самцами весом 24-26 г, с виду здоровыми. Ставили две серии контролей. В первой серии две мыши получали по три шарика, не содержащих клеток RENCA, а во второй серии с двумя мышами не делали вообще ничего.

Через три недели после имплантатации все мыши получали внутрибрюшинные инъекции по 10⁶ клеток RENCA. Спустя 18 дней одна контрольная мышь умерла. Всех остальных мышей забили и исследовали.

У контрольных мышей были найдены многочисленные опухоли, тогда как у мышей, которые получили имплантаты клеток, инкапсулированных в шариках, были только случайно расположенные в брюшной полости узлы.

Из этих обнадеживающих экспериментов следовала схема эксперимента, описанного в следующем примере.

Пример 5 В этих экспериментах были смоделированы сформированные раковые опухоли путем введения клеток RENCA под капсулу одной почки каждой из шести мышей BALB/C. Спустя 15 дней мышей разбили на две группы. Каждая из трех мышей первой группы получила по три шарика, как описано выше в примере 4. Вторая группа (контрольная) получила шарики, которые не содержали клеток RENCA.

Через 4-5 дней мыши, которые получили имплантаты, содержащие клетки RENCA, выглядели сонливыми, а их мех стал взъерошенным, тогда как контрольная группа оставалась энергичной, без всяких изменений в состоянии их меха. Однако через десять дней после имплантатации (25 дней после введения клеток RENCA) контрольные мыши становились вялыми, брюхо у каждой было вздутым.

Одна из трех контрольных мышей умерла на четырнадцатый день после трансплантации шариков. После этого мыши были забиты.

Полости тела контрольных мышей имели обильные кровотечения с многочисленными опухолями по всему пищеварительному тракту, печени, желудку и легким. Вся брюшная полость стала неразличимой из-за безудержного опухолевого роста. У мышей, которые получили шарики с инкапсулированными клетками RENCA, не было кровотечений и было только немного опухолевых узлов в пищеварительном тракте. Сравнение экспериментальных и контрольных групп показало, что в экспериментальной группе узлы не прогрессировали.

Пример 6 Рост свободно инокулированных клеток RENCA подавлен, когда их инкубируют с инкапсулированными клетками RENCA. Эксперименты следующей серии были проведены, чтобы определить, наблюдается ли этот эффект с другими клетками.

Линию клеток аденокарциномы, а именно ММТ (опухоль молочной железы мышей), получили из American Type Culture Collection. Инкапсулированные клетки ММТ готовили, как описано выше, но с клетками ММТ, чтобы получить шарики, содержащие 120000 или 240000 клеток в одном шарике. После приготовления шариков их использовали, чтобы определить, ингибируют ли они пролиферацию клеток RENCA in vitro. Конкретно, готовили две чашки Петри с шестью лунками посредством инокуляции в каждую лунку по 110⁴ клеток RENCA в четырех мл среды. В каждой чашке использовали три лунки как контрольные, а три как экспериментальные. Одна из трех контрольных лунок в каждой чашке получила один шарик. Каждая из остальных лунок получила либо два, либо три пустых шарика. Вторую лунку обрабатывали так же, причем лунки получали один, два или три шарика, содержащих 120000 или 240000 клеток ММТ. Инкубировали лунки при 37^oC в течение недели, после чего трипсинизировали клетки RENCA, промывали их и подсчитывали с помощью гемоцитометра. Результаты приведены в табл. 1.

Пример 7 После получения результатов примера 6 такие же эксперименты были проведены с использованием 110⁴ клеток ММТ, а не клеток RENCA. Эксперименты были выполнены в точности, как в примере 6. Результаты представлены в табл. 2.

Эти результаты побудили провести эксперимент in vivo. Он представлен в примере 8.

Пример 8 Клетки RENCA, которые использовались в предыдущих примерах, представляют собой клетки рака почек. С целью более полно продемонстрировать общую действенность данного изобретения была проведена работа с использованием других типов раковых клеток. Конкретно использовали клетки аденокарциномы.

Линию клеток опухоли молочной железы мышей (ММТ) получали из American Type Culture Collection. С использованием протокола, описанного выше, готовили имплантаты, которые содержали 120000 клеток в одном шарике и 240000 клеток в одном шарике.

Использовали экспериментальную модель на мышах, описанную выше. Двадцать две мыши разбили на группы из 4, 9 и 9 животных. Первую группу, то есть контроль, разбили далее на три группы из двух, одной и одной мыши. Первая подгруппа получала имплантаты из одного шарика, не содержавшего клеток. Одна мышь получила два пустых шарика, и одна получила три пустых шарика.

В экспериментальной группе A (9 животных) шарики содержали 120000 клеток, тогда как в группе Б шарики содержали 240000 клеток. В группах А и Б было по три подгруппы, в каждой по три мыши. Подгруппы получали один, два и три шарика, содержащих клетки ММТ.

Через двадцать один день после имплантатации все животные получали инъекции 40000 клеток RENCA. Немедленно после инъекции мыши становились сонливыми, с взъерошенным мехом. Это продолжалось около пяти дней, после чего восстанавливалось нормальное поведение.

Через двадцать дней у контрольных мышей брюхо было вздутым, а мех чрезвычайно взъерошенным. Одна контрольная мышь умерла через 25 дней после инъекции, в то время как состояние остальных контрольных мышей выглядело терминальным. Всех мышей забили и увидели, что у них развились опухоли. Эти наблюдения записаны в табл. 3.

Эти результаты показывают, что из восемнадцати проверенных мышей у тринадцати болезни не было. Из мышей группы (A) у одной было немного узлов, а у другой - немного опухолей. У одной мыши, которая получила два шарика, было немного опухолей.

В группе Б у одной мыши, которая получила один шарик, и у одной мыши, которая получила два шарика, было немного опухолей, заплетенных в кишечнике. У одной из мышей, которая получила три шарика, развилась большая твердая опухоль, и с виду мышь была очень слабой. Тем не менее, в целом результаты показали, что инкапсулированные клетки опухоли молочной железы мыши ингибируют образование опухоли.

Пример 9 Как предполагалось выше, применение данного изобретения имеет результатом получение некоего материала или фактора, который ингибирует и/или предотвращает пролиферацию опухолевых клеток. Это было исследовано далее в нижеследующих экспериментах.

Дополнительные шарики готовили, как описано выше в примере 2, за исключением того, что не включали ателлоколлаген. Следовательно, эти шарики являются агарозо-агарозными шариками. В них так, как описано выше, заключали вышеописанные клетки RENCA.

Затем в качестве контрольной и экспериментальной группы использовали две серии из трех планшетов с шестью лунками. В контрольной группе в лунки вносили по 4 мл полной среды RPMI (10% фетальной телячьей сыворотки и 11 мл/л пенициллина). Затем в каждую лунку контрольной группы инокулировали по 10000 клеток RENCA.

В экспериментальной группе полную среду RPMI кондиционировали добавлением материала, выделенного путем инкубации десяти иммуноизолированных содержащих клетки RENCA шариков (120000 клеток на шарик) в чашке Петри размером 35х100 мм, содержащей 50 мл полной среды RPMI. Через пять дней инкубации среду собирали из чашек и 4 мл среды помещали в каждую экспериментальную лунку. Затем в эти лунки инокулировали 10000 клеток RENCA.

Все планшеты (как контрольные, так и экспериментальные) инкубировали при 37^oC в течение 5 дней. После периода инкубации клетки промывали при трипсинизации и подсчитывали с помощью гемоцитометра. После трипсинизации клетки из каждой лунки планшетов объединяли и подсчитывали. Результаты приведены в табл. 4.

Эти результаты показывают, что клетки при ограничении их, например, в шариках по данному изобретению, продуцируют некий фактор, что приводит к подавлению пролиферации опухолевых клеток. Этот ингибирующий фактор ограничения продуцируется клетками ввиду их заключения в шарик и отличается от других материалов, таких как факторы контактного ингибирования, которые продуцируются, когда клетки контактируют одна с другой.

Пример 10 Эксперименты, описанные выше, показали, что рост клеток RENCA в кондиционированной среде составлял около половины от роста этих клеток в контрольной среде. В экспериментах, описанных здесь ниже, проверяется, останется ли фактор ингибирования роста активным после замораживания кондиционированной среды.

Среду, кондиционированную клетками RENCA, готовили инкубацией десяти иммуноизолированных шариков, содержащих клетки RENCA, в течение пяти дней. Инкубацию проводили в чашках Петри размером 35х100 мм с 50 мл полной среды RPMI при 37^oC. После инкубации собирали среду и хранили ее при -20^oC. Кондиционированную среду готовили инкубацией шариков, содержащих иммуноизолированные клетки ММТ (опухоль молочной железы мыши). Эти шарики содержали 240000 клеток на шарик. В других отношениях все условия были одними и теми же.

Замороженную среду оттаивали при 37^oC и затем использовали в нижеследующих тестах. По три планшета с шестью лунками использовали для каждой обработки, а именно: (1) контрольная среда RPMI, (2) замороженная среда, кондиционированная клетками RENCA и (3) замороженная среда, кондиционированная клетками ММТ. В каждую лунку вносили в целом 4 мл среды. Затем во все лунки инокулировали по 10000 клеток RENCA и инкубировали при 37^oC в течение 5 дней. После инкубации из каждой лунки брали два планшета образцов, трипсинизировали, объединяли и подсчитывали в гемоцитометре. Через восемь дней таким же образом проверяли три оставшихся планшета каждой лунки.

Результаты приведены в табл. 5.

При сравнении этих результатов с полученными в вышеприведенном примере 6 видно, что, при том что замороженная/оттаянная среда, кондиционированная клетками RENCA, не тормозила рост в той же степени, что и незамороженная среда (сравните примеры 6 и 7), она, тем не менее, тормозила рост. Замороженная среда, кондиционированная клетками ММТ, тормозила рост даже в большей степени, чем незамороженная среда, кондиционированная клетками ММТ. Эти результаты показывают, что из восемнадцати исследованных мышей у тринадцати животных болезни не было. Из мышей группы (А) у одной было немного узлов, а у другой - немного опухолей.

Далее описано изготовление имплантатируемых шариков, которые содержат один или более типов клеток, которые продуцируют какой-либо способный к диффузии биологический продукт в том смысле, в каком это выражение определено здесь. Способный к диффузии биологический продукт представляет собой такой продукт, который оказывает влияние на субъекта, которому имплантатирован этот шарик. Предпочтительно, чтобы этим влиянием была иммуномодуляция, такая как стимуляция иммунного ответа или подавление этого ответа. В случае, например, рака способным к диффузии биологическим продуктом может быть пептид, который образует комплексы с молекулами МНС на раковых клетках у субъекта и таким образом вызывает цитотоксический Т-лимфоцитарный (CTL) ответ на эти клетки, который в свою очередь приводит к снижению опухолевой нагрузки на субъект. Способным к диффузии продуктом может быть также суппрессор опухолевого роста. В связи с такой формой терапии возможно, хотя не обязательно предпочтительно, помещать имплантатируемые шарики в выявленную опухоль или рядом с ней.

Выражение "способный к диффузии биологический продукт" в используемом здесь смысле относится к материалам, таким как белки, гликопротеины, липопротеины, углеводы, липиды, гликолипиды и пептиды. Более конкретно, материалы, такие как антитела, цитокины, гормоны, ферменты и так далее могут быть примерами, но никак не единственными типами включаемых сюда материалов. Исключаются хорошо известные "конечные продукты" клеточных процессов, такие как CO₂ и H₂O.

Как показывают эксперименты, имплантатируемые шарики можно также применять для профилактики. Хорошо известно, что по меньшей мере часть больных раком предрасположены к рецидивам. Описанные здесь эксперименты показывают, что эти имплантаты могут предотвращать появление или рецидивирование рака посредством биологических эффектов, которое эти способные к диффузии продукты оказывают на какую-либо систему субъекта.

Обсуждение данного изобретения было сосредоточено на подходах in vivo. Надо также понимать, что к данному изобретению существуют подходы in vitro, некоторые из которых обсуждаются здесь. Например, хорошо известно, что многие клетки, которые продуцируют способные к диффузии продукты, при культивировании in vitro требуют присутствия питающих клеток. С такими питающими клетками всегда имеются проблемы. Они могут расти быстрее, чем желаемые клетки, что приводит к фактическому "удушению" материалов, представляющих интерес. Далее, могут быть проблемы с разного рода токсическими продуктами, которые продуцируются питающими слоями. Имплантируемые шарики по данному изобретению действуют почти как клеточные инкубаторы, которые защищают включенные клетки, при этом позволяя способным к диффузии продуктам переходить в культуральную среду, где их можно, например, собирать.

Как указано выше, приготовление имплантируемых шариков требует, во-первых, суспензирования клеток в растворе, предпочтительно водном растворе коллагена. Предпочтительно, чтобы коллаген был ателоколлагеном в растворе с концентрацией от примерно 0,5 до примерно 2%. В зависимости от типа используемых клеток число клеток в растворе в данный момент времени и, следовательно, число клеток в шарике будут варьировать. Предпочтительно, чтобы используемых клеток было от примерно 10000 до примерно 200000 на шарик, более предпочтительно от примерно 30000 до примерно 100000, наиболее предпочтительно от 40000 до 60000.

После суспензирования клеток в коллагеновом растворе к нему добавляют раствор агарозы. Предпочтительно, чтобы этот раствор агарозы имел концентрацию агарозы в пределах от примерно 0,5% до примерно 5%, предпочтительно около 1%. Путем капания смеси на или в инертный материал, такой как TEFLON или вазелиновое масло, образуется шарик. Этот шарик имеет полутвердую консистенцию. Полутвердый шарик затем переносят в стерильную среду, предпочтительно содержащую антибиотики, промывают и инкубируют, чтобы полимеризовать коллаген. Полимеризация коллагена является хорошо исследованным явлением, и здесь условия, при которых она происходит, не нужно рассматривать подробно.

После затвердевания шарика его покрывают агарозой, предпочтительно перекатывая его в растворе агарозы. Один из предпочтительных способов сделать это состоит в применении простой ложки с покрытием из TEFLON, которая содержит раствор агарозы с концентрацией предпочтительно от 5 до 10%.

Проведенное выше обсуждение способных к диффузии биологических продуктов не следует истолковывать как ограниченное материалами дикого типа. Например, можно столь же просто использовать трансформированные или трансфецированные клетки хозяина, такие как эукариотические клетки (например клетки линий 293, CHO, COS) или даже прокариотические клетки (например Е. coli), которые были обработаны так, чтобы продуцировать гетерогенный белок, или модифицированы посредством, например, гомологичной рекомбинации, чтобы продуцировать больше желаемых биологических продуктов. Можно также использовать другие материалы, например гибридомы, так что способным к диффузии биологическим продуктом оказывается моноклональное антитело.

Другие признаки и аспекты данного изобретения ясны специалистам, и нет необходимости рассказывать о них здесь.

Употребленные здесь термины и выражения использованы в описательном, а не ограничительном смысле и не предусматривают намерения использовать эти термины и выражения для того, чтобы исключить какие-либо эквиваленты показанных и описанных признаков или их сторон, при полном понимании того, что в объеме данного изобретения возможны разные модификации.

Формула изобретения

1. Покрытый агарозой твердый агарозно-коллагеновый шарик, содержащий клетки, которые будучи ограничены продуцируют фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток, причем указанный фактор диффундирует через указанный покрытый агарозой твердый агарозоколлагеновый шарик.

2. Шарик по п.1, где указанными клетками являются раковые клетки.

3. Шарик по п.2, где указанными раковыми клетками являются клетки рака почек.

4. Шарик по п.1, где указанный шарик содержит от примерно 10000 до примерно 200000 клеток.

5. Шарик по п.4, где указанный шарик содержит от примерно 30000 до примерно 100000 клеток.

6. Способ введения субъекту фактора, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток, при котором указанному субъекту имплантируют шарик по п.1, причем указанный фактор диффундирует через указанный шарик.

7. Способ по п.6, где указанный субъект страдает патологическим состоянием, которое можно лечить указанным фактором.

8. Способ по п.7, где указанное патологическое состояние характеризуется аномальным ростом клеток.

9. Способ по п.8, где указанным патологическим состоянием является рак.

10. Способ изготовления покрытого агарозой агарозно-коллагенового шарика, который содержит клетки, которые будучи ограничены продуцируют фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток и который диффундирует через указанный покрытый агарозой твердый агарозно-коллагеновый шарик, при котором суспендируют клетки, которые будучи ограничены продуцируют этот фактор, в содержащем коллаген материале; добавляют агарозу к указанному содержащему коллаген материалу; формируют полутвердый шарик из указанных коллагена, агарозы и клеток; полимеризуют коллаген в указанном полутвердом шарике для формирования твердого агарозно-коллагенового шарика, содержащего указанные клетки, и покрывают агарозной указанный твердый агарозно-коллагеновый шарик, содержащий указанные клетки.

11. Способ по п.10, где указанными клетками являются раковые клетки.

12. Способ по п.10, при котором в указанном содержащем коллаген растворе суспендируют от примерно 10000 до примерно 200000 клеток.

13. Способ по п. 10, где число клеток в указанном содержащем коллаген растворе составляет от примерно 30000 до примерно 100000.

14. Покрытый агарозой, содержащий агарозу шарик, где указанный шарик содержит клетки, которые будучи ограничены продуцируют фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток, причем указанный фактор диффундирует через указанный твердый покрытый агарозой содержащий агарозу шарик.

15. Шарик по п.14, где указанными ограниченными клетками являются раковые клетки.

16. Шарик по п.15, где указанными клетками являются клетки рака почек.

17. Шарик по п. 14, где указанный шарик содержит от примерно 10000 до примерно 200000 клеток.

18. Шарик по 17, где указанный шарик содержит от примерно 30000 до примерно 100000 клеток.

19. Способ введения субъекту фактора, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток, при котором указанному субъекту имплантируют шарик по п. 14, причем после имплантации указанный фактор диффундирует через указанный шарик.

20. Способ изготовления покрытого агарозой, содержащего агарозу шарика по п.14, причем указанный шарик содержит клетки, которые будучи ограничены в указанном шарике продуцируют фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток и который диффундирует через указанный шарик, при котором добавляют раствор, который содержит пробу клеток, которые способны продуцировать фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток и который диффундирует через указанный шарик, когда указанные клетки ограничены; формируют полутвердый шарик, включающий в себя указанную агарозу и указанные клетки; полимеризуют эту агарозу в указанном полутвердом шарике для формирования твердого агарозного шарика, содержащего и таким образом ограничивающего указанные клетки, и покрывают агарозой указанный твердый содержащий агарозу шарик, содержащий эти ограниченные клетки.

21. Способ по п.20, где указанными клетками являются раковые клетки.

22. Способ по п.20, при котором в указанном содержащем коллаген растворе суспендируют от примерно 10000 до примерно 200000 клеток.

23. Способ по п. 20, где число клеток в указанном содержащем коллаген растворе составляет от примерно 30000 до примерно 100000 клеток.

Приоритет по пунктам и признакам: 03.04.1996 по пп.1-23; 07.11.1996 - примеры 6-10 описания.

РИС