Лечение в случае дефицита -галактозидазы а

Лечение в случае дефицита -галактозидазы а

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лечению заболеваний, связанных с дефицитом -галактозидазы А (-гал А). Сущность изобретения составляет способ лечения пациента, имеющего дефицит -гал А, который включает введение пациенту человеческой клетки, генетически модифицированной для сверхэкспрессии и секреции человеческой -гал А. Изобретение включает также молекулу ДНК, кодирующую полипептиз, содержащий -гал А, способ очистки и терапевтическую композицию. Техническим результатом является расширение арсенала средств для лечения патологии, связанной с дефицитом -гал А. 8 c. и 4 з. п. ф-лы, 13 ил. , 8 табл.

Предпосылки создания изобретения Изобретение относится к -галактозидазе А и лечению в случае дефицита -галактозидазы А.

Болезнь Фабри представляет болезнь, связанную с X-хромосомным унаследованным лизосомным накоплением, характеризующуюся такими симптомами, как тяжелая почечная недостаточность, ангиокератомы и сердечно-сосудистые нарушения, в том числе гипертрофия желудочков сердца и недостаточность митрального клапана. Болезнь также поражает периферическую нервную систему, вызывая мучительные приступы со жгучей болью в конечностях. Болезнь Фабри вызывается дефицитом фермента -галактозидазы А ( -гал А), который проявляется в блокировке катаболизма нейтральных гликосфинголипидов и накоплением ферментного субстрата церамид-тригексозида внутри клеток и в кровотоке.

Вследствие характера, связанного с Х- хромосомой унаследованного заболевания, по существу, все пациенты с болезнью Фабри являются мужчинами. Хотя наблюдали несколько случаев тяжелого поражения женских гетерозигот, женские гетерозиготы обычно или бессимптомны, или имеют относительно умеренные симптомы, ограниченные большей частью характерным помутнением роговицы. Нетипичный вариант болезни Фабри, при котором проявляется низкая остаточная активность -гал А и весьма умеренные симптомы или явное отсутствие симптомов, характерных для болезни Фабри, коррелирует с гипертрофией левого желудочка и болезнью сердца (Nakano et al. New Engl. J. Med. , 333: 288-293, 1995). Сделано предположение, что редукция -гал А может являться причиной таких нарушений в работе сердца.

Выделены и секвенированы кДНК и ген, кодирующий человеческую -гал A (Bishop et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4859, 1986; Kornreich et al. , Nuc. Acids Res. , 17: 3301, 1988; Oeltjen et al. Mammalian Genome, 6: 335-338, 1995). Человеческая -гал А экспрессируется в виде полипептида из 429 аминокислот, из которых 31 N-концевая аминокислота составляет сигнальный пептид. Человеческий фермент экспрессирован в клетках яичника китайского хомячка (CHO) (Desnick, патент США N 5356804; Ioannou et al. , J. Cell Biol. , 119: 1137, 1992); в клетках насекомых (Calhoun et al. , патент США N 5179023) и в COS-клетках (Tsuji et al. , Eur. J. Biochem. , 165: 275, 1987). Сообщается о пробных испытаниях по применению белка, полученного из тканей человека, при -гал А заместительной терапии (Mapes et al. , Science, 169: 987, 1970; Brady et al. , N. Engl. J. Med. , 289: 9, 1973; Desnick et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5326, 1979), но на сегодняшний день эффективного способа лечения болезни Фабри не существует.

Краткое изложение сущности изобретения Обнаружено, что при экспрессии ДНК, кодирующей человеческую -гал А, в культивированных человеческих клетках продуцируется полипептид, который соответствующим образом гликозилирован, так что он не только ферментативно активен и способен действовать на гликосфинголипидный субстрат, накапливающийся при болезни Фабри, но он также эффективно поглощается клетками через рецепторы на поверхности клетки, которые его точно нацеливают туда, где они необходимы при этой болезни: в лизосомный компартмент пораженных клеток, в частности эндотелиальных клеток, выстилающих кровеносные сосуды пациента. Это открытие, подробнее обсуждаемое ниже, означает, что индивидуума с подозрением на дефицит -гал А, как при болезни Фабри, можно лечить или (1) человеческими клетками, которые генетически модифицированы для сверхэкспресии и секреции человеческой -гал А, или (2) очищенной человеческой -гал А, полученной из культивированных, генетически модифицированных человеческих клеток.

Терапия по первому пути, т. е. с самими модифицированными клетками, включает генетическую манипуляцию с человеческими клетками (например, первичными клетками, вторичными клетками или иммортализованными клетками) in vitro или ex vivo, чтобы побудить клетки к экспресии и секреции большого количества человеческой -гал А, с последующей имплантацией клеток пациенту, что в общих чертах описано в WO 93/09222, Selden et al. (включенной в настоящее описание в качестве ссылки).

Когда клетки должны быть генетически модифицированными для целей лечения болезни Фабри или посредством генной терапии, или посредством заместительной терапии ферментами, ДНК-молекула, содержащая кДНК -гал А, или последовательность геномной ДНК может содержаться в экспрессирующей конструкции и может быть введена в первичные или вторичные человеческие клетки (например, в фибробласты, эпителиальные клетки, включая эпителиальные клетки молочной железы и кишечника, эндотелиальные клетки, форменные элементы крови, включая лимфоциты и клетки костного мозга, глиальные клетки, гепатоциты, кератиноцины, мышечные клетки, невральные клетки или в предшественников клеток таких типов) посредством стандартных способов трансфекции, в том числе, но не только перечисленными способами, липосомо-, полибрен- или DEAE-декстранопосредованной трансфекцией, электропорацией, осаждением фосфатом кальция, микроинъекцией или быстрыми частицами с управляемой скоростью ("биолистики" ["biolistics"] ). С другой стороны, можно использовать систему, которая доставляет ДНК с помощью вирусного вектора. Вирусами, известными как пригодные для переноса генов, являются аденовирусы, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса, вирус паротита, полиовирус, ретровирусы, вирус Синдбиса и вирус осповакцины, такой как вирус чумы канареек. Хотя для способов лечения данного изобретения предпочтительны культуры первичных или вторичных клеток, можно также использовать иммортализованные человеческие клетки. Примерами линий иммортализованных человеческих клеток, полезных в способах настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются перечисленным, клетки меланомы Bowes (АТСС, инвентарный N CRL 9607), клетки Дауди (АТСС, инвентарный N CCL 213), клетки HeLa и производные клеток HeLa (АТСС, инвентарные NN CCL 2, CCL 2.1 и CCL 2.2), клетки HL-60 (АТСС, инвентарный N CCL 240), клетки НТ1080 (АТСС, инвентарный N CCL 121), клетки Юрката (АТСС, инвентарный N TIB 152), клетки карциномы KB (АТСС, инвентарный N CCL 17), лейкозные клетки К-562 (АТСС, инвентарный N CCL 243), клетки рака молочной железы MCF-7 (АТСС, инвентарный N ВТН 22), клетки MOLT-4 (АТСС, инвентарный N 1562), клетки Намальвы (АТСС, 1 инвентарный N CRL 1432), Raji-клетки (АТСС, инвентарный N CCL 86), клетки RPMI 8226 (АТСС, инвентарный N CCL 155), клетки U-937 (АТСС, инвентарный N CRL 1593), клетки 2R4 сублинии WI-38VA13 (АТСС, инвентарный N CLL 75.1) и клетки карциномы яичника 2780AD (Van der Blick et al. Cancer Res. , 48: 5927-5932, 1988), а также гетерогибридомные клетки, полученные путем слияния человеческих клеток и клеток другого вида. Штаммы вторичных фибробластов человека, такие как WI-38 (АТСС, инвентарный N CCL 75) и MRC-5 (АТСС, инвентарный N CCL 171), также можно использовать.

Методами генной инженерии из человеческих клеток с ДНК-молекулой, кодирующей -гал А (или посредством другой подходящей генетической модификации, как описано ниже), для получения клетки, которая сверхэкспрессирует и секретирует -гал А, можно генерировать клональный клеточный штамм, состоящий, по существу, из множества генетически идентичных культивированных первичных человеческих клеток, или, когда клетки иммортализованы, клональную клеточную линию, состоящую, в основном, из множества генетически идентичных иммортализованых человеческих клеток. Предпочтительно клетки клонального клеточного штамма или клональной клеточной линии являются фибробластами.

Затем можно получить генетически модифицированные клетки и ввести их пациенту подходящими способами, например так, как описано в WO 93/09222, Selden et al.

Генная терапия по изобретению обладает рядом преимуществ по сравнению с ферментно-заместительной терапией с применением фермента, полученного из тканей человека или животного. Например, способ по изобретению не зависит от возможно неустойчивой доступности источников соответствующих тканей и поэтому является коммерчески осуществимым способом лечения дефицита -гал А. Он относительно безопасен по сравнению с ферментно-заместительной терапией с ферментом, полученным из человеческих тканей, которые могут быть инфицированы известными или неизвестными вирусами и другими инфицирующими агентами. Кроме того, генная терапия по изобретению обладает рядом преимуществ перед ферментно-заместительной терапией в целом. Например, способ изобретения (1) дает преимущества стратегии длительного лечения, исключающего необходимость ежедневных инъекций; (2) исключает экстремальные колебания в концентрациях в сыворотке и тканях терапевтического белка, которые типично сопровождают обычную фармокологическую доставку; и (3) является, вероятно, менее дорогостоящим, чем ферментно-заместительная терапия, поскольку нет необходимости в получении и очистки белка для частого введения.

Как описано выше, индивидуумов с дефицитом -гал A можно также лечить очищенной -гал А (т. е. ферментно-заместительной терапией). Первичные, вторичные и иммортализованные человеческие клетки, генетически модифицированные для сверхэкспресии человеческой -гал А, также полезны в случае получения белка in vitro для получения белка, который можно очистить для ферментно-заместительной терапии. Вторичные или иммортализованные человеческие клетки можно выбрать среди клеток, описанных выше, и можно генетически модифицировать методами трансфекции или трансдукции, также описанными выше. После генетической модификации клетки культивируют в условиях, допускающих сверхэкспрессию и секрецию -гал А. Белок выделяют из выращенных клеток, собирая среду, в которой выращивают клетки, и/или путем растворения клеток для высвобождения их содержимого и затем применяют стандартные методы очистки белков. Один из таких методов заключается в пропускании культуральной среды или любого образца, содержащего человеческую -гал А, через гидрофобную, вступающую во взаимодействие смолу, такую как бутилсефароза, или другую смолу с функциональной группой, содержащей бутильную группу. Пропускание образца через такую смолу может составлять первую стадию хроматографии. Если необходима дополнительная очистка, содержащий -гал А материал, элюированный из гидрофобной активной смолы, можно загрузить в колонку, содержащую другую смолу, например иммобилизованную гепариновую смолу, такую как гепаринсефароза, гидроксиапатит, анионообменную смолу, такую как Q-сефароза, или смолу для гельхроматографии, такую как супердекс 200. Предпочтительно, схема очистки включает применение каждой смолы из вышеуказанных типов смол. С другой стороны, можно применить одну или несколько из последних смол перед применением гидрофобной активной смолы или вместо нее.

Ранее описанные способы получения -гал А относительно высокой чистоты зависят от применения аффинной хроматографии с использованием сочетания аффинной хроматографии на лецитине (конканавалин A-(Con А)-сефароза) и аффинной хроматографии, основанной на связывании -гал А с аналогом субстрата N-6-аминогесаноил --D-галактозиламином, связанным с сефарозной матрицей (Bishop et al. , J. Biol. Chem. , 256: 1307-1316, 1981). Применение белковых лецитинаффинных смол и смол - аналогов субстрата типично связывается с непрерывным "сползанием" афинного агента с твердого носителя (ср. Marikar et al. , Anal. Biochem. , 201: 306-310, 1992), что приводит, в результате, к загрязнению очищенного продукта аффинным агентом или свободным в растворе или связанным с элюированным белком. Такие загрязнения делают продукт непригодным для применения в фармацевтических препаратах. Связанные аналоги субстрата и лецитины также могут весьма негативно влиять на ферментативные, функциональные и структурные свойства белков. Кроме того, такие аффинные смолы обычно дорогостоящи для получения, что делает применение таких смол менее подходящим для производства в коммерческом масштабе, чем более привычных смол для хроматографии. Таким образом, разработка схемы очистки с использованием традиционных смол для хроматографии, которые легко доступны для поставок и качественно подходящи для крупномасштабного коммерческого применения, является существенным преимуществом настоящего изобретения.

Индивидуума, у которого подозревают дефицит -гал А, можно лечить путем введения фармацевтически приемлемой очищенной человеческой -гал А стандартным способом, в том числе, но не только, внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекцией, или в виде твердого имплантата. Очищенный белок можно ввести в терапевтическую композицию, состоящую из водного раствора, содержащего физиологически приемлемый эксципиент, например носитель, такой как сывороточный альбумин человека, при pH 6,5 или ниже.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения больших количеств подходящим образом гликозилированной и поэтому терапевтически полезной, человеческой -гал А. Это делает ферментно-заместительную терапию в случае дефицита -гал А коммерчески жизнеспособной, а также относительно безопасной по сравнению с терапией ферментом, полученным из тканей человека или животного.

Специалистам в этой области техники будет понятно, что последовательность ДНК человеческой -гал А (или кДНК, или геномной ДНК) или последовательности, которые отличаются от нее либо из-за изменений молчащих кодонов, либо изменений кодонов, которые дают консервативные замещения аминокислот, можно использовать для генетической модификации культивированных человеческих клеток, так что они будут сверхэкспрессировать и секретировать фермент. Также возможно, что некоторые мутации в последовательности -гал А будут кодировать полипептиды, которые возвращают или обнаруживают повышенную ферментативную активность -гал А (что можно будет выявить путем экспрессии молекулы мутантной ДНК в культивированных клетках, очистки кодированного полипептида и измерения каталитической активности, как описано здесь). Например, можно ожидать, что консервативные замещения аминокислот оказывают слабое действие или не оказывают действия на биологическую активность, особенно если они составляют менее 10% от общего числа остатков в белке. Консервативные замещения обычно включают замещения в пределах следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серии, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.

Продуцирование -гал А клетками можно привести к максимуму путем некоторых генетических манипуляций. Например, молекула ДНК, которая кодирует -гал А, может также кодировать гетерологичный сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид человеческого гормона роста (hGH), эритропоэтина, фактора VIII, фактора IX, глюкагона, рецептора для липопротеина низкой плотности (LDL), или лизосомного фермента, иного чем -гал А. Предпочтительно, сигнальный пептид представляет сигнальный пептид hGH (ПОСЛЕД. N21) и находится в N-конце кодированного белка. ДНК-последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может содержать интрон, такой как первый интрон hGH-гена, результатом чего является такая ДНК-последовательность, как ПОСЛЕД. N 27 (см. также фиг. 10). Кроме того, молекула ДНК может также содержать 3'- нетранслируемую последовательность (UTS), которая составляет в длину по меньшей мере 6 нуклеотидов (в противоположность мРНК -гал А, обнаруженной у людей, у которой нет 3' UTS, причем требуемый сайт полиаденилирования находится в пределах кодирующей последовательности). UTS располагается сразу же 3' к терминирующему кодону кодирующей последовательности и включает сайт полиаденилирования. Она составляет в длину, предпочтительно, по меньшей мере 6 нуклеотидов, предпочтительнее - по меньшей мере 12, а наиболее предпочтительно - по меньшей мере 30 нуклеотидов, и во всех случаях она содержит последовательность ААТААА или родственную последовательность, которая служит для промотирования полиаденилирования. Описанная молекула ДНК, т. е. кодирующая сигнальный пептид hGH, связанный с -гал А, и содержащая 3' UTS, которая включает сайт полиаденилирования, и, предпочтительно, содержащая экспрессирующие регулярные последовательности, также входит в объем изобретения. Также в объем изобретения входит молекула ДНК, колирующая белок, которая содержит сигнальный пептид hGH, связанный с -гал А или любым другим гетерологичным полипептидом (т. е. , любым полипептидом, иным чем hGH, или аналогом hGH). Гетерологичный полипептид типично представляет белок млекопитающего, например любой, подходящий с медицинской точки зрения человеческий полипептид.

Другие особенности и преимущества данного изобретения станут очевидны из последующего подробного описания и из формулы изобретения.

Используемый здесь термин "генетически модифицированная" в отношении клеток охватывает клетки, которые экспрессируют определенный генный продукт после введения молекулы ДНК, кодирующей данный генный продукт и/или регуляторные элементы, которые регулируют экспрессию кодирующей последовательности. Введение молекулы ДНК можно осуществить с помощью направленной генной доставки (т. е. введения молекулы ДНК в определенный участок генома); кроме того, гомологичная рекомбинация допускает замену самого дефектного гена (дефектный ген -гал А или его часть можно заменить при болезни Фабри собственными клетками пациента с целым геном или его частью).

Используемый здесь термин "-гал А" относится к -гал А без сигнального пептида, т. е, к ПОСЛЕД. N 26 (фиг. 9). Есть определенные признаки, что остатки 371-398 или 373-398 ПОСЛЕД. 26 (фиг. 9) в лизосоме можно удалить; однако считается, что удаление этого предполагаемого пропептида не влияет на активность фермента. Это приводит к мысли, что можно удалить любую часть предполагаемого пропептида без ухудшения активности. Таким образом, используемый здесь термин "-гал А" также охватывает белок с последовательностью, соответствующей ПОСЛЕД. N 26, за исключением недостающих остатков (до 28) у C-конца этой последовательности.

"Дефицит -гал А" означает любую недостаточность количества или активности этого фермента у пациента. Такой дефицит может вызвать тяжелые симптомы, которые обычно наблюдаются у мужчин, страдающих от болезни Фабри, или он может быть только частичным и вызывать относительно умеренные симптомы, что можно наблюдать у гетерозиготных женских носителей дефектного гена.

Используемый здесь термин "первичная клетка" включает клетки, присутствующие в суспензии клеток, выделенных из источника - ткани позвоночного (до того, как их высевают, т. е. , связывают с подложкой для тканевой культуры, такой как чашка или колба), клетки, присутствующие в эксплантате, полученном из ткани, оба предыдущих типа клеток, высеянные в первый раз, и клеточные суспензии, полученные из этих высеянных клеток.

"Вторичными клетками" называются клетки на всех последующих стадиях культивирования. Иначе, высеянную первый раз первичную клетку удаляют с культурального субстрата и высевают снова (пересевают), и эта клетка, как и все клетки при последующих пересевах, называется вторичной клеткой.

"Клеточный штамм" состоит из вторичных клеток, которые пересевали один или несколько раз, которые показывают конечное число среднего удвоения популяций в культуре, показывают свойства угнетаемого контактом роста на "якорной подложке (за исключением клеток, разведенных в суспензионной культуре) и не являются иммортализованными.

"Иммортализованной клеткой" обозначают клетку из установленной клеточной линии, которая обнаруживает явно неограниченную продолжительность жизни в культуре.

"Сигнальный пептид" означает пептидную последовательность, которая направляет вновь синтезированный полипептид, с которым он связывается к эндоплазматическому ретикулуму для дальнейшего посттрансляционного процессирования и/или распределения.

Используемый здесь в контексте с -гал А термин "гетерологичный сигнальный пептид" относится к сигнальному пептиду, который не является сигнальным пептидом человеческой -гал А (т. е. , который кодируется нуклеотидами 36-128 ПОСЛЕД. N 18). Типично, он представляет сигнальный пептид какого-то другого белка млекопитающего, но не -гал А.

Термин "первая стадия хроматографии" относится к первому внесению образца в хроматографическую колонку (все стадии, связанные с получением образца, исключены).

Краткое описание чертежей На фиг. 1 изображен зонд в 210 п. о. , который используют для выделения -гал А из библиотеки кДНК фибробластов 13 человека (ПОСЛЕД. N 19). Последовательность состоит из экзона 7 гена -гал А. Зонд выделяют из геномной ДНК человека посредством полимеразной цепной реакции (PCR). Участки, подчеркнутые на чертеже, соответствуют последовательностям затравок для амплификации.

На фиг. 2 представлена последовательность ДНК-фрагмента, который завершает 5'-конец клона кДНК -гал А (ПОСЛЕД. N 20). Этот фрагмент амплифицируют посредством PCR из геномной ДНК человека. Подчеркнутые участки соответствуют последовательностям затравок для амплификации. Также показаны положения сайтов рестрикции эндонуклеазами Ncol и SacII, которые используют для субклонирования, как описано в примере 1А.

На фиг. 3 представлена последовательность кДНК -гал А, включающая последовательность, кодирующую сигнальный пептид (ПОСЛЕД. N 18).

На фиг. 4 приводится схематическая карта pXAG-16 - конструкции, экспрессирующей -гал А, которая включает промотор CMV (цитомегаловирус) и интрон, кодирующую последовательность сигнального пептида hGH и первый интрон, кДНК -гал А (т. е. , не имеющую последовательности сигнального пептида - гал А) и 3' UTS hGH.

На фиг. 5 приводится схематическая карта pXAG-28 - конструкции, экспрессирующей -гал А, которая включает коллагеновый промотор I2, интрон -актина, кодирующую последовательность сигнального пептида hGH и первый интрон, кДНК -гал А (т. е. , не имеющую последовательности сигнального пептида -гал А) и 3' UTS hGH.

На фиг. 6 приводится хроматограмма стадии очистки -гал А с использованием смолы бутилсефарозы. Показаны поглощение при 280 нм (ровная линия) и активность -гал А (линия с точками) выделенных фракций.

Фиг. 7 представляет графическое отображение фибробластами Фабри человеческой -гал А, полученной согласно изобретению. Внутриклеточную активность -гал А и общую концентрацию белка измеряют после инкубации клеток с возрастающими концентрациями человеческой -гал А, полученной по изобретению. Показаны влияние потенциальных ингибиторов интернализации маннозо-6-фосфата (М6Р; незаштрихованные ромбы) и маннана (незаштрихованные кружки).

Фиг. 8 представляет схему экспериментальной системы, созданной для исследования фибробластов Фабри после поглощения -гал А. Активность -гал А клеток Фабри измеряют после воздействия или обычных, или сверхэкспрессирующих -гал А фибробластов человека, выращенных во вставках Transwel^TM. "М6Р" = маннозо-6-фосфат; "нтрф. ФЧ" = нетрасфектированные фибробласты человека; "BRS11" = трансфектированный сверхэкспрессирующий -гал А штамм фибробластов.

На фиг. 9 приводится аминокислотная последовательность человеческой -гал А (ПОСЛЕД. N 26).

На фиг. 10 приводится ДНК-последовательность, кодирующая сигнальный пептид hGH и содержащая первый интрон hGH (подчеркнут) (ПОСЛЕД. N 27).

На фиг. 11 приводится ДНК-последовательность, кодирующая сигнальный пептид hGH, без интрона (ПОСЛЕД. N 22).

На фиг. 12 приводится аминокислотная последовательность сигнального пептида hGH (ПОСЛЕД. N 21).

На фиг. 13 приводится кДНК-последовательность, кодирующая человеческую -гал А (без сигнального пептида) (ПОСЛЕД. N 25).

Подробное описание изобретения Лизосомные ферменты, такие как -гал А, направляются к лизосомному компартменту клетки через взаимодействие с маннозо-6- фосфатным (М6Р) рецептором, который связывает остатки М6Р, присутствующие в олигосахаридных частях ферментов, предназначенных для лизосомного компартмента (Kornfeld, S. and Mellman I. , Ann. Rev. Cell Biol. , 5: 483-525, 1989). Первичное взаимодействие происходит в аппарате Гольджи, где ферменты, связанные с рецепторами для М6Р аппарата Гольджи, расщепляются для переноса к лизосомам. Полагают, что на поверхности клетки имеет место вторичный тип взаимодействия между внеклеточной -гал А и М6Р-рецепторами. Внеклеточные вещества, поглощенные клетками, переносятся через цитоплазму в эндоцитических пузырьках, и сливаются с первичными лизосомами, и выливают их содержимое в лизосомы. В этом процессе М6Р-рецепторы поверхности клеток также включаются в эндоцитические пузырьки и переносятся к лизосомам.

Присутствующая во внеклеточной среде -гал А, если она несет остатки М6Р, связываются с М6Р-рецепторами на поверхности клеток и за счет этого переносится в лизосомный компартмент вместе с рецепторами. Фермент в лизосомном компартменте в результате такого пути "утилизации" тотчас может осуществлять свою соответствующую функцию. Таким образом, даже если клетка генетически продуцирует недостаточно своей собственной -гал А, существует механизм перемещения к ней экзогенно продуцированного фермента при условии, что (а) фермент подходящим образом гликозилирован и (б) дефектная клетка несет рецепторы для М6Р.

Показано, что при болезни Фабри васкулярные эндотелиальные клетки почки и сердца отображают серьезные гистопатологические отклонения от нормы и вносят вклад в клиническую патологию болезни; эти клетки, несущие рецепторы для М6Р, представляют собой особую мишень для представленного изобретения. Полученную по изобретению -гал А можно доставлять к поврежденным клеткам или местно, или системно посредством генной терапии (т. е. , с помощью генетически модифицированных клеток, которые экспрессируют и секретируют гликозилированный фермент в организме пациента), или с помощью традиционных фармакологических способов введения. Поэтому -гал А, в которой в N-связанных олигосахаридах присутствует М6Р, имеет большое значение для лечения в соответствии с данным изобретением.

Кроме того, большое значение имеет также степень, до которой посредством сиалилирования модифицированы N-связанные олигосахариды -гал А. В отсутствии соответствующего сиалилирования -гал А будет быстро выводиться из кровообращения из-за связывания асиалогликопротеиновыми рецепторами печени с последующим поглощением и расщеплением гепатоцитами (Ashwell and Harford, Ann. Rev. Biochem. , 51: 531-554, 1982. ). Это снижает количество -гал А, доступной при циркуляции для связывания с М6Р-рецепторами на клетках, которые участвуют в клинической патологии болезни Фабри, таких как васкулярные эндотелиальные клетки почки и сердца. К удивлению заявители обнаружили, что -гал А, секретируемая устойчиво трансфектированными человеческими клетками, обладает характеристиками гликозилирования, которые подходят для лечения болезни Фабри либо генной терапией, либо посредством традиционного фармацевтического введения очищенного секретируемого белка. Это противоположно ситуации с наиболее хорошо исследованным лизосомным ферментом глюкоцереброзидазой, когда доставка к клинически соответствующим клеткам организма фермента, очищенного от человеческой плаценты или выделенного из трансфектированных CHO-клеток, требует сложной ферментной модификации фермента после очистки (ср. Beutler, New Engl. J. Med. , 325; 1354-1360, 1991).

Лечение по изобретению можно осуществить двумя основными путями: посредством введения пациенту терапевтически эффективного количества очищенной человеческой -гал А, полученной из культивированных человеческих клеток, генетически модифицированных для сверхэкспресии и секреции фермента, или путем введения пациенту самой сверхэкспрессирующей клетки. Методы осуществления необходимых генетических модификаций описываются ниже, как и способы очистки, составления композиций и лечения.

Пример 1. Получение и применение конструкций, созданных для доставки и экспрессии -гал А Конструируют две экспрессирующие плазмиды - pXAG-16 и pXAG-28. Эти плазмиды содержат кДНК человеческой -гал А, кодирующую 398 аминокислот фермента -гал А (без сигнального пептида -гал А); геномную ДНК- последовательность сигнального пептида человеческого гормона роста (hGH), которая прерывается первым интроном гена hGH; и 3'-нетранслируемую последовательность (UTS) гена hGH, которая содержит сигнал для полиаденилирования. Плазмида pXAG-16 содержит немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека (CMV IЕ) и первый интрон (фланкированный некодирующими экзонными последовательностями), в то время как pXAG-28 управляется коллагеновым промотором I2 и также содержит 5' UTS гена -актина, которая содержит первый интрон гена -актина.

А. Клонирование полной кДНК -гал А и создание экспрессирующей -гал А плазмиды pXAG-16 Человеческую -гал А клонируют из кДНК-библиотеки фибробластов человека, которую создают следующим образом. Из полной РНК выделяют мРНК поли-А⁺ и осуществляют синтез кДНК с использованием реагентов для системы лямбда ZapII по указаниям изготовителя (Stratagene Inc. , Ла-Джолла, Калифорния). Коротко, "первоцепочечную" кДНК получают посредством обратной транскрипции в присутствии затравки олиго-dT, содержащей внутренний сайт для рестрикционной эндонуклеазы XhoI. После обработки РНКазой H кДНК "ник"-транслируют с ДНК-полимеразой I образования двухцепочечной кДНК. У этой кДНК тупят концы Т4-ДНК-полимеразой и лигируют с адапторами EcoRI. Продукты этого лигирования обрабатывают Т4-ДНК-киназой и расщепляют Xhol. Фракционируют кДНК хроматографией на сефакриле-400. Фракции большого и среднего размера объединяют и лигируют кДНК с расщепленными EcoRI и XhoI плечами лямбда-ZapII. Продукты этого лигирования затем упаковывают и титруют. Первичная библиотека имеет титр 1,210⁷ бое/мл и средний размер вставки 925 п. о.

Для выделения кДНК используют зонд в 210 п. о. из экзона 7 гена человеческой -гал А (фиг. 1, ПОСЛЕД. N 19). Сам зонд выделяют из геномной ДНК посредством полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием олигонуклеотидов 5'- CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3' (олиго-1; ПОСЛЕД. 1) и 5'-TCTAGC- TGAAGCAAAACAGTG-3" (олиго-2; ПОСЛЕД. N 2). PCR-продукт затем используют для скрининга библиотеки кДНК фибробластов, и выделяют положительные клоны, и характеризуют их далее. Один из положительных клонов фаг 3А "вырезают" по схеме с системой лямбда-ZapII (Stratagene, Inc. , Ла-Джолла, Калифорния) по указаниям изготовителя. Такая процедура дает плазмиду pBSAG3A, которая содержит кДНК-последовательность -гал А в скелете плазмиды pBluescriptSK-^TM. Секвенирование ДНК показывает, что эта плазмида не содержит полного 5'-конца кДНК-последовательности. Поэтому 5'-конец реконструируют с использованием PCR-фрагмента, амплифицированного из геномной ДНК человека. Чтобы это осуществить, фрагмент геномной ДНК в 268 п. о. (фиг. 2, ПОСЛЕД. N 20) амплифицируют с использованием олигонуклеотидов 5'-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (олиго-3; ПОСЛЕД. N 3) и 5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3'(олиго-4; ПОСЛЕД. N 4). Этот фрагмент субклонируют в клонирующую плазмиду "ТА" (Invitrogen Corp. , Сан-Диего, Калифорния), и генерируют плазмиду pTAAGEI. Плазмиду pBSAG3A, которая содержит большую часть кДНК-последовательности -гал А, и плазмиду pTAAGEI, содержащую 5'-конец кДНК -гал А, расщепляют каждую с SacII и NcoI. Положения соответствующих сайтов SacII и NcoI в амплифицированном ДНК-фрагменте показаны на фиг. 2. Выделяют из pTAAGEI Sacll-Ncol-фрагмент в 0,2 кб и лигируют с эквивалентно расщепленной pBSAG3A. Эта плазмида pAGAL содержит полную кДНК-последовательность -гал А, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид -гал А. Полностью секвинируют кДНК (показано на фиг. 3), включая сигнальный пептид -гал А (ПОСЛЕД. N 18), и обнаруживают, что она идентична опубликованной последовательности кДНК -гал А (геномная библиотека последовательностей HUMGALA).

Плазмиду pXAG-16 создают через несколько проме