Бензоксазиновые или пиридооксазиновые соединения, способы их получения, промежуточные соединения, фармацевтические композиции, обладающие антибактериальной активностью, способы лечения бактериальных инфекций

Бензоксазиновые или пиридооксазиновые соединения, способы их получения, промежуточные соединения, фармацевтические композиции, обладающие антибактериальной активностью, способы лечения бактериальных инфекций

Реферат

 

Изобретение относится к новым бензоксазиновым и пиридооксазиновым соединениям формулы I, где часть Q - конденсированный фенил или конденсированный пиридил; Z₁ - водород, галоген, C₁-С₆ алкил, фенил, нитро, сульфониламино или трифторметил; Z₂ - водород или галоген; Х - водород или кислород; А - C₁-С₆-алкил, С₁-С₆-алкиларил или C₁-С₆-алкилгетероциклил, где арил и гетероциклил описаны в формуле изобретения, n = 0 - 3; Y - часть, описанная в формуле изобретения, и их фармацевтически приемлемым солям, эфирам и пролекарственным формам. Также раскрыты способы их получения, промежуточные соединения, фармацевтические композиции на их основе, обладающие антибактериальной активностью, и способы лечения бактериальных инфекций. Изобретение может быть использовано в медицине в качестве антиинфекционных средств. 10 с. и 22 з.п.ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к бензоксазиновым и пиридооксазиновым антибактериальным соединениям, фармацевтическим композициям, содержащим эти соединения, и способам их получения и применения. Эти соединения эффективны при ингибировании действия бактериальной гистидинпротеинкиназы и, следовательно, полезны в качестве антиинфекционных средств против ряда бактериальных организмов, включая организмы, которые устойчивы к другим известным антибиотикам.

Прокариоты регулируют транскрипцию многих их генов в ответ на изменения в окружающей среде организмов (J. В. Stock, A.M. Stock and J.M. Mottonen, Nature, 344, 395-400 (1990)). Такая регуляция существенна, если организм должен сам адаптироваться к выживанию в изменяемой окружающей среде, и патогенные бактерии используют такие системы регуляции, которые дают возможность им выживать в организме хозяина (J.F. Miller, J.J. Mekalanos, S. Falkow, Science, 243, 1059 (1989)). Можно предположить, что химические соединения, которые препятствуют механизмам регуляции, являются полезными противоинфекционными лекарственными средствами, так как они могут мешать бактериям обеспечивать необходимые адаптивные изменения в характере экспрессии генов.

Вирулентность, хемотаксис, продуцирование токсина, споруляция и репродукция являются примерами бактериальных процессов, которые находятся под контролем регуляции и которые могли бы ингибироваться такими соединениями. Предполагается, что ингибирование одного или нескольких этих процессов ведет к снижению вирулентности, замедлению или остановке бактериального роста и репродукции и даже к гибели бактериальных клеток, если прерываются жизненные функции.

Было показано, например, что виды Salmonella экспрессируют определенные белки при контроле регуляции и в ответ на присутствие кишечных эпителиальных клеток, которые дают возможность им прикрепляться к клеткам и заселять эти клетки. Бактерии, неспособные синтезировать эти белки, авирулентны: они не могут вызвать инфекцию у мышей (В.В. Finlay, F. Heffron, S. Falkow, Science, 243, 940-943 (1989)). Подобный эффект можно было бы ожидать, если бы гены, кодирующие эти белки, были интактными, но оставались неэкспрессированными.

Для выполнения адаптивных ответов на окружающую среду бактерии используют фосфорзависимые механизмы, называемые в данной области как "двухкомпонентные переключения". Эти переключения имеют в качестве общего эффекта передачу информации от окружающей среды к ядру клетки, где на эту информацию появляется ответ путем включения или выключения транскрипции соответствующих генов. Первая стадия этой схемы фосфорзависимого механизма основывается на действии различных ферментов гистидинпротеинкиназ (НРК). Большинство этих ферментов НРК являются сенсорными молекулами и реагируют на стимуляцию определенными сигналами окружающей среды путем переноса фосфата от АТФ к остатку гистидина НРК-белка. Некоторые ферменты НРК стимулируются присутствием рецепторных белков (описываются ниже), концентрация которых модулируется сигналами окружающей среды. В любом случае за этим автофосфорилированием следует перенос фосфата к остатку аспартила одного или нескольких акцепторных белков (вторые компоненты двухкомпонентного переключения), которые либо являются регуляторами экспрессии генов (путем связывания с регуляторными областями ДНК или с комплексом РНК-полимеразы), либо сами являются киназами для других акцепторных молекул. Эти вторичные акцепторы, в свою очередь, могут быть регуляторными белками или киназами еще для другого белка. Этот каскад переноса фосфата от белка к белку в конце концов приводит к фосфорилированию одного или нескольких регуляторных белков, которые затем регулируют экспрессию генов.

Клетки млекопитающих не используют или, по меньшей мере, в настоящее время неизвестно, что они используют НРК-управляемые системы фосфопередачи для регуляции гена. Таким образом, нельзя было бы ожидать, что соединения, которые селективно ингибируют либо автофосфорилирование РНК-белка, либо стадию(и) фосфопереноса, или то и другое, обладают нежелательным действием на организм хозяина и являются перспективными кандидатами на противоинфекционные лекарственные средства. Возникновение устойчивых к лекарственным средствам патогенных организмов, которые устойчивы к одному или нескольким доступным в настоящее время лекарственным средствам, создавало потребность в новых антибиотиках, которые действуют по механизмам, не связанным с механизмами доступных в настоящее время средств, и ингибиторы НРК могли бы удовлетворить эту потребность. Присутствие многочисленных РНК-управляемых систем (в настоящее известно свыше пятидесяти) в бактериях придает ингибиторам НРК потенциальное преимущество по сравнению с принятыми в настоящее время антибиотиками в том, что маловероятно, что мутация одного фермента НРК придаст организму устойчивость к лекарственному средству.

Недавно исследователи в этой области описали способ обнаружения генов бактериальной "вирулентности", которые селективно экспрессируются, когда бактерии инфицируют хозяина (M.J. Mahan, J.M. Slauch and J.J. Mekalanos, Science, 259, 686-688 (1993)). Упоминалось возможное использование этой информации в разработке новых антибиотиков, но фактические методы снижения экспрессии этих генов не были описаны. В предварительном сообщении другой группы исследователей описываются ингибиторы двухкомпонентного переключения, регулирующего активацию гена альгината в Pseudomonas aeruginosa в системе in vitro (S. Roychoudhury et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 90, 965-969 (1993)), но не сообщается о антибактериальной активности этих соединений.

Изобретение представляет соединения общей структуры I где часть Q - конденсированный фенил или конденсированный пиридил; Z₁ - водород, галоген, C₁-C₆-алкил, C₁-C₆-алкокси, фенил, гидрокси, амино, нитро, сульфониламино или трифторметил; Z₂ - водород или галоген; Х - водород или кислород; А - C₁-C₆-алкил, C₁-C₆-лкиларил или C₁-C₆-алкилгетероциклил, где арил представляет бифенил, нафтил или фенил и гетероциклил представляет 5- или 6-членную насыщенную или ненасыщенную гетероциклическую группу, содержащую 1-4 атома азота, атом кислорода или серы; где эта арильная или гетероциклильная группа необязательно замещена (C₁-C₆) алкилом, бензилом, оксибензилом, фенокси, гидрокси, алкокси, галогеном, двумя атомами галогена, нитро, амино, карбоксилом, кapбo(C₁-C₆)алкокси или метилсульфониламино; n = 0 - 3; Y выбирают из (а) NHR₁R₂, N⁺R₁R₂R₃, (б) (в) CO₂H, CHO; (г) СН(R₆)СО₂Н, СН(R₆)СO₂СН₃, CH=chr₇, CH=C(CO₂H)₂; (д) остатка формулы (е) 5-тетразолила; где R₁, R₂ и R₃ независимо - водород, C₁-C₆-алкил или трет-бутоксикарбонил; R₄ и R₅ независимо - трет-бутоксикарбонил или водород или R₄ и R₅ могут быть соединены вместе с образованием кольца имидазолина, имидазолила или пиримидина; R₆ - водород, гидрокси или хлор; R₇ - СO₂Н или С (О)NH(CH₂)_pOH, где р = 1 - 4, и их фармацевтически приемлемые соли, эфиры и пролекарственные формы.

Данное изобретение касается способа лечения бактериальных инфекций у млекопитающих путем введения млекопитающему, страдающему такой инфекцией, терапевтически эффективного количества соединения, выбранного из соединений формулы I, эффективных в ингибировании действия бактериальной гистидинпротеинкиназы.

Соединения настоящего изобретения ингибируют автофосфорилирование бактериальных гистидинкиназ; они ингибируют также перенос фосфата от фосфорилированных гистидинкиназ к остаткам аспартилам белков-акцепторов фосфата, принимающих участие в регуляции бактериальной экспрессии генов. Стандартным способом, измерением минимальных ингибирующих концентраций (величины MIC), обнаружено, что соединения настоящего изобретения ингибируют рост бактерий. Соединения полезны в качестве бактериостатических и бактерицидных средств и в качестве противоинфекционных средств при лечении инфекционных болезней. Их можно также использовать для повышения восприимчивости бактерий к общепринятым антибиотикам.

Некоторые соединения формулы I предпочтительны.

Предпочтительными осуществлениями изобретения являются те соединения, где Q представляет конденсированный фенил.

Предпочтительные группы для А представляют C₁-C₅-алкил, СН₂-фенил, СН₂-тиенил, CH₂-пиридил, СН₂-фурил или этилпиперидин.

Предпочтительные группы для Y представляют (a) NHR₁R₂, N⁺R₁R₂R₃; (б) (в) СO₂Н; (г) СН(R₆)СО₂Н; (д) остаток формулы где R₁, R₂ и R₃ независимо - водород, C₁-C₆-алкил или трет-бутоксикарбонил, R₄ и R₅ независимо - трет-бутоксикарбонил или водород; R₆ - водород или гидрокси, и их фармацевтически приемлемые соли, эфиры и пролекарственные формы.

Наиболее предпочтительны те соединения формулы I, где часть Q - конденсированный фенил; Z₁ - водород, галоген, C₁-C₆-алкил, C₁-C₆-алкокси, фенил, гидрокси, амино, нитро, сульфониламино или трифторметил; Z₂ - водород или, когда Z₁ - галоген, Z₂ - также галоген; Х - кислород; А - C₁-C₅-алкил, CH₂-фенил, СН₂-тиенил, СН₂-пиридил, СН₂-фурил или этилпиперидин, где этот фенил, тиенил, пиридил, фурил или пиперидиновая часть необязательно замещена (C₁-C₆) алкилом, бензилом, оксибензилом, фенокси, гидрокси, алкокси, галогеном, двумя атомами галогена, нитро, амино, карбоксилом или карбометокси; n = 0 - 3; Y - часть, выбранная из (a) NHR₁R₂, N⁺R₁R₂R₃; (б) (в) СO₂Н; (г) СН(R₆)СO₂Н; (д) остатка формулы где R₁, R₂ и R₃ независимо - водород, C₁-C₆алкил или трет-бутоксикарбонил; R₄ и R₅ независимо - трет-бутоксикарбонил или водород; R₆ - водород или гидрокси, и их фармацевтически приемлемые соли, эфиры и пролекарственные формы.

Настоящее изобретение касается также некоторых новых промежуточных продуктов, пригодных для получения конечных соединений. Таким образом, изобретение содержит промежуточные продукты следующей формулы где часть Q - фенил или пиридил; Z₁ - водород, галоген, C₁-C₆-алкил, C₁-C₆-алкокси, фенил, гидрокси, амино, нитро, сульфониламино или трифторметил и Z₂ - водород или галоген.

Включены также промежуточные продукты общей формулы где часть Q - фенил или пиридил и Z₁ представляет водород, галоген, C₁-C₆-алкил, C₁-C₆-алкокси, фенил, гидрокси, амино, нитро, сульфониламино или трифторметил; Z₂ представляет водород или галоген, А представляет C₁-C₆-алкиларил или C₁-C₆-алкилгетероциклил, где арил представляет бифенил, нафтил или фенил и гетероциклил представляет 5- или 6-членную насыщенную или ненасыщенную гетероциклическую группу, содержащую 1-4 атома азота, атом кислорода или серы; где эта арильная или гетероциклильная группа необязательно замещена (C₁-C₆)алкилом, бензилом, оксибензилом, фенокси, гидрокси, алкокси, галогеном, двумя атомами галогена, нитро, амино, карбоксилом, карбо(C₁-C₄)алкокси или метилсульфониламино; и R₈ представляет водород или гидроксизащитную группу. Подходящие гидроксизащитные группы включают любые общепринятые защитные группы для гидроксигрупп, которые обычно используют специалисты данной области, такие как группы, указанные в Т. Greene, "Protecting Groups in Organic Synthesis", J. Wiley and Sons, 1981. Они включают силиловые сложные эфиры, алифатические сложные эфиры и ароматические сложные эфиры, такие как триметилсилил, трет-бутилдиметилсилил, ацетил, бензоил и тому подобное.

Соединения настоящего изобретения получают в соответствии со способами, описанными ниже и иллюстрированными в следующих схемах. Первая стадия синтеза включает новую реакцию присоединения и циклизации -бром--бутиролактона, показанного на схеме 1 (см. в конце описания), с подходящим образом замещенным 2-нитро- или 2-аминофенолом. Реакцию можно проводить в две отдельные стадии, начиная с известных, обычно коммерчески доступных нитрофенолов, имеющих большинство определений для Z, перечисленных в описании изобретения. Растворитель обычно представляет собой ДМФ, и для завершения реакции требуется основный (щелочной) реагент, такой как К₂СО₃. Стадия циклизации протекает при восстановлении нитрогруппы любыми системами реагентов, которые, как известно, пригодны для этого восстановления, включая катализируемое палладием гидрирование, никель и борогидрид натрия и железоуксусная кислота. В альтернативном случае, особенно в случаях, когда Z представляет нитрогруппу или Q представляет конденсированный пиридил, обе стадии, присоединения и циклизации, можно проводить в одну операцию, используя основание, такое как К₂СО₃ или NaH, в ДМФ с нагреванием или без него.

Имея образованную таким образом систему бензоксазинового гетероциклического кольца, промежуточный спирт 2 можно получить трехстадийной последовательностью реакций. За стадией защиты спиртовой группы известной защитной группой, такой как трет-бутилдиметилсилилпроизводное или его эквиваленты, следует реакция в положении 4, включающая нуклеофильное замещение с участием алкил- или арилгалогенида в основных условиях: например, очень эффективен NaH в ДМФ. В альтернативном случае превращение азота в положении 4 в производное можно проводить путем реакции Mitsunobu подходящим образом замещенного спирта. Удаление защитной группы спирта при помощи любых обычных реагентов с фторид-анионом или в кислотных условиях дает соединение 2.

Как очевидно, схема 1 изображает получение бензоксазиновых соединений, где часть "Q" представляет конденсированный фенил. Пиридооксазиновые соединения, где часть "Q" представляет конденсированный пиридил, можно получить в соответствии с тем же способом путем замены фенольного исходного материала, изображенного на схеме 1, на подходящим образом замещенную 2-нитро- или 2-аминопиридоксильную часть. В остальных синтезах, изображенных на схемах 2-10 ниже, бензоксазиновые соединения, показанные на схемах, можно таким же образом заменить на пиридооксазиновые соединения.

Ключевой стадией синтеза является реакция сочетания спирта 2 с замещенным фенолом путем реакции Mitsunobu, как показано на схеме 2 (см. в конце описания). Реакция Mitsunobu может быть одним из нескольких вариантов, известных в данной области; выбор подходящего фосфина, азодикарбонильного реагента и растворителя будет предоставлен на усмотрение исследователя, основанное на опубликованных прецедентах и на эмпирических результатах с определенной комбинацией субстратов, которые нужно сочетать. Руководство для этого можно найти в обзорной статье D.L. Hughes в Organic Reactions, 42, 335-656 (1992), и в приведенных ниже подробных примерах. В большинстве случаев будет достаточным применение трифенилфосфина (Рh₃Р) и диэтилазодикарбоксилата (DEAD) или, альтернативно, трибутилфосфина (Вu₃Р) и (азодикарбонил)дипиперидина (ADDP).

Во время реакции Mitsunobu группа Y в большинстве случаев должна быть в защищенной форме более реакционноспособного соединения или же (например, когда целевым соединением является гетероцикл) группа Y должна быть предшествующей функциональной группой, превращаемой в целевой гетероцикл. После того как образована связь между двумя частями, группу Y превращают, если необходимо, в предпочтительную функциональную группу, как показано на схемах в конце описания. Подходящие защитные группы для гуанидинов и аминов включают, но не ограничиваются ими, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (Воc) и бензилоксикарбонил. Подходящие защитные группы для карбоновых кислот включают, но не ограничиваются ими, низшие алкиловые эфиры или бензиловые эфиры; подходящие предшествующие группы включают олефин, нитрил или оксазолидин. Химические процессы, представленные на схеме, в общем применимы для всех определений Y.

Для получения тех соединений, где Х=водород, реакцию сочетания Mitsunobu проводят с восстановленным производным соединения 2. Восстановление очень легко проводят с защищенным предшественником соединения 2, как показано на схеме 3 (см. в конце описания), путем использования коммерчески доступного боранового реагента, такого как комплекс боран-ТГФ. После реакции восстановления удаление защитной группы, как показано на схеме 1, дает спирт, который претерпевает реакцию Mitsunobu, как указано ранее.

В схеме 4 (см. в конце описания) показана реакция 2 (4-гидроксифенил)этиламина с дитрет-бутилдикарбонатом для получения защищенного фенольного сочетающего компонента для реакции Mitsunobu. Коммерчески доступны или являются известными соединениями различные (гидроксифенил)алкиламины; их можно синтезировать обычными способами, такими как восстановительное аминирование бензальдегидов, гидрирование арилацетонитрилов или арилоксиацетонитрилов, восстановление циннамидов или циннамиламинов и т.д. Способы их получения можно выбрать, но не ограничиваться ими, из представленных здесь примеров.

Кроме того, на схеме 4 иллюстрируется получение защищенного гуанидина из соответствующего амина, снова обеспечивающее фенольный компонент для сочетания Mitsunobu. Показанное использование N,N'-бис(трет-бутоксикарбонил)-S-метилизотиомо-чевины для этой цели является известной методикой (R.J. Веrgеron, J. S. McManis, J. Org. Chem., 52, 1700-1703 (1987)); в некоторых случаях ее улучшают добавлением к реакционной смеси ацетата серебра (см. также M. S. Bernatowicz, Y. Wu, G. R. Matsueda, Tetrahedron Letters, 34, 3389 (1993)). Эти методы обычно пригодны для всех аминов с различными определениями Ar, X, W и n.

В альтернативном случае можно получить 1 (см. описание изобретения) с Y= NH₂ и затем превратить его аминогруппу в гуанидиногруппу указанным выше или другими известными методами (например, M.S. Bernatowicz, Y. Wu, G.R. Matsueda, J. Org. Chem., 57, 2497-2502 (1992) и ссылки в ней).

Для соединений, где Y представляет карбоновую кислоту (см. определение), исходные фонолы с подходящим замещением являются известными соединениями и коммерчески доступными соединениями либо в виде карбоновых кислот, либо соответствующих алкановых эфиров. Кислоты до сочетания по реакции Mitsunobu сначала защищают превращением в алкановые эфиры обычным образом, как показано на схеме 5 (см. в конце описания). После реакции сочетания, омылением NaOH получают конечные продукты.

Когда n равно O и Y представляет СНО (схема 6), реакция с бромофором и КОН с последующим метилированием сырого продукта дает гидроксиэфир 3. Гидролиз таким образом образованного эфира дает соответствующую гидроксикислоту 4. Кислоту 4 можно обработать реагентами, такими как тионилхлорид, для образования хлорпроизводного и затем реакцией с тиомочевиной получить тиазолидиндион, как показано на схеме 6 (см. в конце описания).

Для соединений, где Y в действительности представляет защищенный амин или гуанидин (схема 7 в конце описания), реакция в кислотных условиях, например в среде трифторуксусной кислоты или соляной кислоты в изопропаноле, дает соли амина и гуанидина соответственно.

В случаях, где А (см. описание изобретения) представляет бензильную группу, замещенную карбоновой кислотой, спирт, показанный на схеме 8, можно получить способом, изображенным на схеме 1, с использованием известных бензиловых галогенидов, имеющих в качестве заместителя эфир карбоновой кислоты. Ранее описанные превращения проводят с эфиром in situ с последующим гидролизом эфира до образования кислоты, обычно на последней стадии реакции.

Превращения, показанные на схеме 1, для получения спирта 2 и реакцию сочетания, описанную в схеме 2, можно проводить с нитрозамещенными исходными материалами для получения продуктов, показанных на схеме 9 (см. в конце описания). Восстановление нитрогруппы реагентами, такими как железо/уксусная кислота или катализируемое палладием гидрирование, можно проводить, например, на соединениях, полученных из защищенных амино- или гуанидинофенолов, показанных на схеме 2. В альтернативном случае восстановление можно проводить на незащищенных соединениях при условии, что не требуются их дальнейшие превращения. В случае защищенного соединения получаемый амин можно далее функционализировать электрофильными реагентами для получения продуктов, показанных на схеме 9. Подобные превращения можно проводить с соединениями, полученными из соединения 2, имеющего нитробензильный заместитель, как показано на схеме 10 (см. в конце описания).

Вышеупомянутые реакции проводят в растворителе, подходящем для этих реагентов и материалов, используемых и пригодных для осуществления. Специалистам в области органического синтеза должно быть понятно, что различные функциональные группы, присутствующие в молекуле, должны быть совместимы с предполагаемыми химическими превращениями. От этого будет зависеть порядок стадий синтеза, защиты реакционноспособных групп и выбора условий реакции. Условия реакции, совместимые с используемыми заместителями, должны быть известны специалисту в данной области, так же как выбор защитных групп в тех случаях, когда они требуются.

Из формулы I очевидно, что некоторые соединения изобретения в их структуре могут иметь один или несколько асимметричных атомов углерода. Предполагается, что настоящее изобретение включает в свой объем стереохимически чистые изомерные формы соединений, а также их рацематы. Стереохимически чистые изомерные формы можно получить путем известных в данной области приемов. Диастереоизомеры можно разделить физическими способами разделения, такими как фракционная кристаллизация и хроматографические методы, и энантиомеры можно разделить друг от друга селективной кристаллизацией диастереомерных солей с оптически активными кислотами или основаниями или хиральной хроматографией. Чистые стереоизомеры можно также получить синтетически из подходящих стереохимически чистых исходных материалов или с использованием стереоспецифических реакций.

Подходящими фармацевтическими солями являются соли неорганических или органических кислот, таких как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, щавелевая кислота, яблочная кислота и тому подобное. Подходящими солями являются также соли неорганических и органических оснований, таких как КОН, NaOH, Са(ОН)₂, Аl(ОН)₃, пиперидин, морфолин, этиламин, триэтиламин и тому подобное.

В объем изобретения включаются также гидратированные формы соединений, которые содержат различные количества воды, например гидратные, полугидратные и полуторагидратные формы.

Способность бактерий быстро реагировать на изменения в окружающей среде имеет самое большое значение для их выживания. Бактерии способны быстро отвечать и адаптироваться к таким разнообразным стимулам, как изменения питательных веществ, осмолярности, температуры, света или среды хозяина. Эти ответы могут быть кратковременными, такими как ответы, требуемые для изменений в подвижности или для вхождения в клетку хозяина. В альтернативном случае ответы могут требовать большие изменения в экспрессии генов и клеточной морфологии, такие как изменения, требуемые для споруляции или для выживания в макрофаге. Механизм, которым бактерии способны чувствовать стимулы из физического окружения (или из цитоплазмы) и преобразовывать эти сигналы в подходящие ответы, часто включает так называемые "двухкомпонентные" системы.

Как утверждалось выше, способ лечения по настоящему изобретению основывается на ингибировании этой системы "двухкомпонентного включения". Все бактерии используют этот механизм для регуляции различных адаптивных/вирулентных факторов для облегчения приживаемости бактериальной популяции в окружающей среде (например, бактериальной инфекции в хозяине). Система неизменно состоит из сенсора, который либо активирует киназу, либо является частью киназы, и который при стимуляции автофосфорилируется. Эта фосфорилированная молекула является очень активным фосфодонором, который сразу переносит свой фосфат в "регуляторный" компонент, который, в свою очередь, инициирует биологический ответ, такой как транскрипция или дальнейший фосфоперенос в каскаде, который в конце концов заканчиваться регуляцией бактериальной экспрессии генов. Несмотря на то что каждая из киназ и регуляторов ответов имеют уникальную последовательность (фактически, даже функционально идентичные белки имеют несколько различные последовательности в различных видах), они разделяют гомологический биохимический механизм и обладают значительной гомологией в активном сайте.

Как указано, настоящее изобретение представляет соединения, которые проявляют антибиотическую активность путем ингибирования автофосфорилирования бактериальных гистидинкиназ. Они ингибируют также перенос фосфата от фосфорилированных гистидинкиназ к остаткам аспартилам белков-акцепторов фосфата, принимающих участие в регуляции бактериальной экспрессии генов.

Это изобретение представляет далее способ лечения бактериальных инфекций или повышения или потенцирования активности других антибактериальных средств у теплокровных животных, который заключается во введении животным соединения по изобретению, отдельно или в смеси с другим антибактериальным средством, в форме лекарственного препарата по настоящему изобретению.

Когда соединения используют для указанного выше использования, их можно комбинировать с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, например растворителями, разбавителями и тому подобное, и их можно вводить перорально в таких формах, как таблетки, капсулы, диспергируемые порошки, гранулы или суспензии, содержащие, например, от около 0,5 до 5% суспендирующего агента, сиропы, содержащие, например, от около 10 до 50% сахара, и эликсиры, содержащие, например, от около 20 до 50% этанола, и тому подобное, или парентерально в форме стерильных инъецируемых растворов или суспензий, содержащих от около 0,5 до 5% суспендирующего агента в изотонической среде. Эти фармацевтические препараты могут содержать, например, от около 0,5 до около 90% активного ингредиента в комбинации с носителем, более обычно от 5 до 60% по массе.

Композиции для местного применения могут принимать форму жидкостей, кремов или гелей, содержащих терапевтически эффективную концентрацию соединения по изобретению в смеси с дерматологически приемлемым носителем.

При получении композиций в пероральной лекарственной форме можно применять любую обычную фармацевтическую среду. Твердые носители включают крахмал, лактозу, дикальцийфосфат, микрокристаллическую целлюлозу, сахарозу и каолин, тогда как жидкие носители включают стерильную воду, полиэтиленгликоли, неионогенные поверхностно-активные вещества и съедобные масла, такие как кукурузное, арахисовое и кунжутное масла, когда они подходят для природы активного ингредиента и определенной формы желаемого введения. Может быть полезно включение вспомогательных средств, обычно применяемых при получении фармацевтических композиций, таких как корригенты, красящие агенты, консерванты и антиокислители, например витамин Е, аскорбиновая кислота, ВНТ и ВНА.

Предпочтительными фармацевтическими композициями с точки зрения легкости получения и введения являются твердые композиции, особенно таблетки и наполненные твердой или жидкой композицией капсулы. Предпочтительно пероральное введение соединений.

Эти активные соединения можно также вводить парентеральным или внутрибрюшинным способом. Растворы или суспензии этих активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемой соли можно получить в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Можно также получить дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. При хранении и использовании в обычных условиях эти препараты могут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для инъецируемого использования, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий для немедленного приема. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей до степени, которая позволяет легко вводить ее с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях приготовления и хранения и должна быть предохранена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носителем может быть растворитель или дисперсная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), их подходящие смеси и растительные масла.

Эффективная доза применяемого активного ингредиента может изменяться в зависимости от конкретного используемого соединения, способа введения и тяжести состояния, которое лечат. Однако в общем удовлетворительные результаты получают, когда соединения по изобретению вводят при суточной дозе от около 0,1 до около 400 мг/кг массы тела животного, предпочтительно в разделенных дозах, вводимых от двух до четырех раз в день, или в форме с пролонгированным действием. Для большинства больших млекопитающих общая суточная доза составляет от около 0,07 до 7,0 г, предпочтительно от около 100 до 1000 мг. Лекарственные формы, подходящие для внутреннего применения, содержат от около 100 до 500 мг активного соединения в тесной смеси с твердым или жидким фармацевтически приемлемым носителем. Эту схему приема лекарственного средства можно регулировать для обеспечения оптимальной терапевтической восприимчивости. Например, ежедневно можно вводить несколько разделенных доз или дозу можно пропорционально снизить, что определяется необходимостью терапевтической ситуации.

Получение вышеуказанных фармацевтических композиций и лекарственных препаратов проводят любым способом, известным в данной области, например смешиванием активного ингредиента(ов) с разбавителем(ями) для образования фармацевтической композиции (например, гранулята) и затем превращением композиции в лекарственный препарат (например, таблетки).

Соединения по настоящему изобретению обладают антибактериальной активностью, как определено следующими испытаниями. Сначала соединения испытывали на их способность ингибировать автофосфорилирование киназы А и перефосфорилирования SpoOF, двух белков, принимающих участие в одной из описанных выше систем трансдукции сигналов, регулирующих экспрессию генов в бактериях. Представленные соединения затем испытывали на антибактериальную активность против выбранных организмов стандартным способом MIC. Результаты приводятся ниже.

В таблице 1 перечислены примеры соединений изобретения вместе с их величинами IC₅₀ в анализе НРК in vitro, описанном ниже, и диапазон величин MIC для выбранных микроорганизмов, идентифицированных ниже. Эти примеры только иллюстрируют изобретение и не предназначены никоим образом для ограничения объема притязания. В таблице 1 бензоксазиновые соединения перечисляются в соответствии с формулой В таблице 2 перечислены активности для пиридооксазиновых соединений следующей формулы, где Q представляет конденсированный пиридил: Получены следующие протоколы вышеупомянутых анализов.

1. Анализ автофосфорилирования киназы А и перефосфорилирования SpoOF Для изучения влияния соединений по настоящему изобретению на процесс трансдукции сигналов в бактериях исследовали ингибирующее действие соединений на белки киназы А и SpoOF оперона споруляции. Конкретно, ингибирование автофосфорилирования киназы А и перефосфорилирования SpoOF определяли в следующих анализах. Регулятором ответной реакции SpoOF является основной субстрат для фосфорилирования протеинкиназой, кинА, принимающей участие в процессе споруляции в бактериях (см. D. Burbulys, К.A. Trach, J.A. Hoch, Cell, 64, 545-552 (1991)). SpoOF и кинА получали из рекомбинантного E.coli, сверхэкспрессирующего эти белки (J. Cavanagh et al., Amino Acids, 6, 131-140 (1994) и ссылки в ней).

Следующие исходные реагенты либо получали и сразу использовали, либо сохраняли при указанной температуре: Соли 8Х: 2 М КСl (5 мл), 1 М MgCl₂ (800 мл), 1 М CaCl₂ (100 мл), 10 мг/мл фенилметилсульфонилфторида (200 мл), 1 М дитиотреит (50 мл), 0,25 М Na₂EDTA (32 мл) и 3,82 мл Н₂О (-20^oС).

Загружаемый краситель 5Х: 0,5 М Трис-HCl, рН 6,8 (7,5 мл), 10% додецилсульфат натрия (SDS) (2 мл), 0,1% бромфенол голубой (0,5 мл), 100% глицерин (3 мл) и 12,5 М 2 меркаптоэтанол (0,3 мл).

1-1,3 мг/мл кинА: 15 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 0,6 мМ КСl; 4 мМ 2-меркаптоэтанол; 40% глицерин (-20^oС).

1 мг/мл SpoOF: 17,5 мМ Трис НСl, рН 8,0; 0,7 мМ КСl; 0,7 мМ MgCl₂; 0,7 мМ CaCl₂; 5 мМ 2-меркаптоэтанол; 30% глицерин (-20^oС).

5% Концентрирующий гель: 40% смесь акриламид:бисакриламид, 29:1 (1,25 мл), 0,5 М Трис-HCl, рН 6,8 (2,5 мл), 10% SDS (0,1 мл), D-H₂O (6,15 мл); 10% персульфат аммония (100 мл) и TEMED (25 мл).

SDS-Рабочий буфер: Трис-основание (3,02 г), глицин (14,4 г), SDS (1 г), D-H₂O (до 1 л).

Реакционную смесь получали из солей 8Х (87 мкл), 1 М Трис, рН 8 (118 мкл), 50% глицерина (63 мкл), SpoOF (14,1 мкл) и кинА (7,0 мкл). В пробирки микроцентрифуги загружали реакционную смесь (18,5 мкл) и 1,0 мМ раствор испытуемого соединения в 5% ДМСО (18,5 мкл) и инкубировали в течение 15 мин на льду. Добавляли 100 мМ раствор АТФ (3,0 мкл, содержащий 625 мкКи [³²P]-АТФ) и смесь оставляли на 10 минут при комнатной температуре. Реакцию гасили наполняющим красителем 5Х (10 мкл на пробирку) и образцы загружали на приготовленный 5% концентрирующий гель или хранили на сухом льду до тех пор, пока они не будут готовы для использования. В приготовленные лунки помещали SDS-рабочий буфер, в лунки загружали образцы и в гель подавали ток с напряжением 80 В до тех пор, пока фронт красителя не достигал нижней части концентрирующего геля. Вольтаж затем повышали до 250 В до тех пор, пока не завершался электрофорез. Изображение радиоактивных полос в геле, соответствующих фосфорилированным кинА и SpoOF, визуализировали и количественно определяли фосфовизуализатором.

Если любой фермент был ингибирован (что доказывается отсутствием меченого белка в проявленном геле), IC₅₀ вычисляли путем проведения анализа с диапазоном концентраций ингибитора от 1 до 500 мкМ. После проведения электрофореза реакционных смесей процент ингибирования определяли путем измерения концентрации радиоактивного фосфора фосфовизуализатором и вычисления величин с использованием программного обеспечения (BioRad Molecular Analyst). Соединения с величинами IC₅₀ менее 500 мкМ считаются активными.

2. Антимикробный анализ MIC Антимикробную активность соединений in vitro определяли методом микроразбавления бульона по способу испытания National Committee for Laboratory Standards (NCCLS). Этот способ описывается в NCCLS Document M7-A2, Vol. 10, No 8 "Metods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Test for Bacteria that Grow Aerobically - Second Edition".

В этом способе лекарственное средство с двукратными сери