Ингибиторы серинпротеазы

Ингибиторы серинпротеазы

Реферат

 

Изобретение относится к соединениям формулы I (значения радикалов определены в описании), их пролекарствам и их фармацевтически приемлемым солям. Соединения обладают высокой антикоагуляционной активностью и могут использоваться при лечении и предупреждении заболеваний, связанных с тромбином. Описана также фармацевтическая композиция, включающая соединение по п. 1. 2 c. и 9 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к ингибитору серинпротеазы, имеющему ацилгуанидиновую боковую цепь, к содержащим его фармацевтическим композициям, а также к использованию указанного ингибитора для лечения и профилактики заболеваний, связанных с тромбином.

Серинпротеазы представляют собой ферменты, которые среди прочего играют важную роль в каскаде коагуляции крови. Членами этой группы являются, например, тромбин, трипсин, факторы VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa и протеин С.

Тромбин является серинпротеазой, которая регулирует последнюю стадию в каскаде коагуляции. Главной функцией тромбина является расщепление фибриногена для генерирования мономеров фибрина, которые образуют нерастворимый гель путем поперечного сшивания. Кроме того, тромбин регулирует свое собственное продуцирование, активируя факторы V и VIII на ранних стадиях каскада. Он также оказывает важные воздействия на клеточном уровне, где он воздействует на специфичные рецепторы, вызывая агрегацию тромбоцитов, активацию клеток эндотелия и пролиферацию фибробласта. Таким образом, тромбин играет центральную регуляторную роль в гемостазе и образовании тромбов. Поскольку ингибиторы тромбина могут иметь широкий круг терапевтических применений, в этой области проводились интенсивные исследования.

При разработке синтетических ингибиторов серинпротеазы, и более конкретно тромбина, возрос интерес к малым синтетическим пептидам, которые распознаются протеолитическими ферментами так же, как природные субстраты. В результате были получены новые пептидоподобные ингибиторы, такие как ингибиторы переходного состояния тромбина и низкомолекулярный ингибитор тромбина Иногатран (Inogatran) (Thromb. Haemostas. 1995, 73:1325 (Abs. 1633), WO 93/11152 (Example 67)), который, как описано, должен быть сильным и селективным ингибитором тромбина. Родственные соединения описаны в WO 95/23609, в отличие от Иногатрана и его гомологов соединения, описанные в этой заявке, имеют ароматическую группу в агматиноподобной группе.

Не ослабевает поиск более эффективных и более селективных ингибиторов серинпротеазы для того, чтобы получить ингибиторы, которые могут вводиться в меньших дозах и дают меньше побочных действий, и эти действия менее тяжелы.

Был найден новый класс очень сильных ингибиторов серинпротеазы, в особенности являющихся селективными ингибиторами тромбина или Ха, имеющих формулу I: в которой А представляет Н, R¹, R¹-O-C(O)-, R¹-SO₂-, R²ООС-(chr²)_m- или N-защитную группу, где R¹ выбран из групп (C_1-12)алкил, (С_3-8)циклоалкил и из (С_6-14)арил, (C_7-15)аралкил, арильные группы которых могут быть необязательно замещены (C_1-6)алкокси или галогеном; каждая группа R² независимо представляет Н или имеет те же значения, что и R¹; m = 1, 2 или 3; В представляет собой связь, D-1-Piq, или L- или D-аминокислоту, имеющую гидрофобную, основную боковую цепь, причем аминокислота может быть необязательно замещена N(C_1-6)алкилом; или А и В вместе представляют остаток R³R⁴N-chr⁵-C(O)-, в котором R³ и R⁴ независимо представляют R¹ или N-защитную группу и R⁵ представляет гидрофобную или основную боковую цепь; Х представляет L-аминокислоту с гидрофобной боковой цепью, представляющей (C_1-12)алкил, необязательно замещенную одной или более (С_6-14)арильными группами, или Х представляет циклическую аминокислоту, -NR²-CH₂-C(O)- или фрагмент в котором n = 2, 3 или 4, Q представляет Н или -C(O)Y, где Y представляет Н или 2-тиазол, Z представляет Н, r = 0 или 1, если Q представляет -C(O)Y, или r = 0, 1, 2, 3 или 4, если Q представляет Н; или их пролекарством, или их фармацевтически приемлемой солью.

Вещества по настоящему изобретению используются для лечения и профилактики опосредованных тромбином или связанных с тромбином заболеваний. Они включают ряд тромботических и протромботических состояний, в которых активирован коагуляционный каскад, включающих, но не ограничивающихся, глубокий тромбоз вен, легочную эмболию, тромбофлебит, закупорку артерий в результате тромбоза или эмболии, откупорку артерий во время или после пластической хирургии сосудов или тромболиза, рестеноз после повреждения артерий или инвазивных кардиологических процедур, послеоперационный венозный тромбоз или эмболию, острый или хронический атеросклероз, удар, инфаркт миокарда, рак и метастазы, и нейродегенеративные заболевания. Вещества по изобретению могут быть также использованы как антикоагулянты в экстракорпоральных потоках кровообращения, которые необходимы при диализе и хирургии. Вещества по изобретению могут быть также использованы как антикоагулянты in vitro.

Предпочтительные соединения по изобретению имеют формулу I, в которой Х представляет L-аминокислоту с гидрофобной боковой цепью или -NR²-CH₂-C(O)-.

Другими предпочтительными соединениями формулы I являются те, у которых Х представляет циклическую аминокислоту или Х представляет -NR²-CH₂-C(О)- или фрагмент Особенно предпочтительными соединениями являются соединения, в которых А представляет R²OOC-(chr²)_m-, В представляет D-аминокислоту, имеющую гидрофобную боковую цепь, и Х представляет азетидинкарбоновую кислоту, пролин, пипеколиновую кислоту, 3,4-дегидропролин, 2-октагидроиндолкарбоновую кислоту.

Еще более предпочтительными соединениями являются соединения, в которых А представляет НООС-СН₂- и В представляет D-Phe, D-Cha, D-Coa, D-Dpa, p-Cl-D-Phe, p-OMethyl-D-Phe, p-OEthyl-D-Phe, D-Nle, m-Cl-D-Phe, 3,4-ди-OMe-D-Phe или D-Chg.

Когда А представляет R¹-SO₂-, предпочтительно В представляет связь, D-1-Piq, или D-аминокислоту, имеющую гидрофобную боковую связь, и Х представляет 2-азетидинкарбоновую кислоту, пролин, пипеколиновую кислоту, 3,4-дегидропролин, 2-октагидроиндолкарбоновую кислоту или фрагмент Более предпочтительными являются соединения, в которых А представляет этил-SO₂- или бензил-SO₂-, В представляет связь, D-Phe, D-Cha, D-Coa, D-Dpa, p-Cl-D-Phe, p-OMethyl-D-Phe, p-OEthyl-D-Phe, D-NIe, м-Cl-D-Phe, 3,4-ди-ОМе-D-Рhе, D-Chg.

Наиболее предпочтительными являются соединения формулы I, в которых Q представляет Н и r = 0, 1 или 2.

N-защитная группа, как она определена при определении группы А, является любой N-защитной группой, применяемой в пептидах. Подходящие N-защитные группы можно найти в Т.W. Green and P.G.M. Wuts: Protective Groops in Organic Synthesis, Second Edition (Wiley, NY, 1991) и в The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, E. Gross and J. Meienhofer, Eds. (Academic Press, New York, 1981).

Термин "необязательно замещенный D,L--гидроксиацетил" означает группу формулы HO-CR^aR^b-C(O)-, в которой R^a и R^b независимо представляют Н, гидрофобную боковую цепь или R^a и R^b вместе образуют 5- или 6-членное кольцо, которое необязательно конденсировано с одним или двумя алифатическими или ароматическими 6-членными кольцами, причем 5- или 6-членное кольцо состоит из атомов углерода и необязательно одного гетероатома, выбранного из N, О и S. Предпочтительными D,L--гидроксиацетильными группами являются 2-гидрокси-3-циклогексилпропионил- и 9-гидроксифтор-9-карбоксил.

Термин (С_1-12)алкил означает разветвленную или неразветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 12 атомов углерода, такую как метил, этил, трет-бутил, изопентил, гептил, додецил и т.п. Предпочтительными алкильными группами являются (С_1-6)алкил группы, имеющие 1-6 атомов углерода. Более предпочтительными в определении R⁶, R⁷ и R⁶ являются (С_1-3)алкил группы, имеющие 1-3 атома углерода, такие как метил, этил, изопропил. Группа (C_1-12)алкенил представляет разветвленную или неразветвленную ненасыщенную углеводородную группу, имеющую от 2 до 12 атомов углерода. Предпочтительными являются (С_2-6)алкенил группы. Примерами являются этенил, пропенил, аллил и т.п.

Термин (C_1-6)алкилен означает разветвленную или неразветвленную алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, такую как -(СН₂)_m, где m = 1 - 6, -СН(СН₃)-, -СН(СН₃)-(СН₂)- и т.д. Предпочтительными алкиленовыми группами в определении Y являются этилен и метилен.

Группа (C_2-12)алкинил представляет разветвленную или неразветвленную углеводородную группу, содержащую тройную связь и имеющую от 2 до 12 атомов углерода. Предпочтительными являются (С_2-6)алкинил группы, такие как этинил и пропинил.

Группа (С_6-14)арил представляет ароматическую группу из 6-14 атомов углерода. Арильная группа может, кроме того, содержать один или несколько гетероатомов, таких как N, S или О. Примерами арильных групп являются фенил, нафтил, изохинолил, инданил и т.п. Наиболее предпочтительной является фенильная группа.

Группы (С_7-15)аралкил и (C_8-16)аралкенил являются соответственно алкильными и алкенильными группами, замещенными одной или несколькими арильными группами, с общим числом атомов углерода соответственно от 7 до 15 или от 8 до 16.

Термин (C_1-6)алкокси означает алкокси группу, имеющую 1-6 атомов углерода, алкильная часть которой может иметь значения, определенные выше.

Термин (С_3-8)циклоалкил означает циклоалкильную группу, имеющую 3-8 атомов углерода, а именно циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил или циклооктил. Предпочтительными циклоалкильными группами являются циклопентил и циклогексил.

Термин "галоген" означает фтор, хлор, бром или йод.

Термин "эфирные производные" означает любое подходящее эфирное производное, предпочтительно (C_1-4)алкиловые эфиры, такие как метиловый, этиловый или трет-бутиловый эфиры.

Термины 1- и 3-Tiq обозначают соответственно 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1- или -3-карбоновую кислоту; 1- и 3-Piq представляют соответственно 1- и 3-карбоксипергидроизохинолин; Atc представляет 2-аминотетралин-2-карбоновую кислоту; Aic представляет аминоинданкарбоновую кислоту; Phe представляет фенилаланин; Cha представляет циклогексилаланин; Dpa представляет дифенилаланин; Соа представляет циклооктилаланин; Chg представляет циклогексилглицин; Nle представляет норлейцин.

Термин "гидрофобная боковая цепь" означает (C_1-12)алкил, необязательно замещенный одним или несколькими (С_3-8)циклоалкил группами или (С_6-14)арил группами (которые могут содержать гетероатом, например азот), такими как циклогексил, циклооктил, фенил, пиридинил, нафтил, тетрагидронафтил и т.п., причем гидрофобная боковая цепь может необязательно быть замещена заместителями, такими как галоген, трифторметил, низший алкил (например, метил или этил), низший алкокси (например, метокси), фенилокси, бензилокси и т.п.

Термин "замещенный" означает замещенный одним или несколькими заместителями.

Аминокислоты, имеющие основную боковую цепь, представляют, например, аргинин и лизин, предпочтительно аргинин, но не ограничены этим. Термин аминокислоты, имеющие нейтральную боковую цепь, относится к таким аминокислотам, как метионинсульфон и т.п.

Циклические аминокислоты представляют, например, 2-азетидинкарбоновую кислоту, пролин, пипеколиновую кислоту, 1-амино-1-карбокси-(С_3-8)циклоалкан (предпочтительно С₄, С₅ или С₆), 4-пиперидинкарбоновую кислоту, 4-тиазолидинкарбоновую кислоту, 3,4-дегидропролин, азапролин, 2-октагидроиндолкарбоновую кислоту и т.п. Предпочтительными являются 2-азетидинкарбоновая кислота, пролин, пипеколиновая кислота, 4-тиазолидинкарбоновая кислота, 3,4-дегидропролин и 2-октагидроиндолкарбоновая кислота.

Термин "пролекарство" означает соединение, в котором амидиновая группа соединения формулы I защищена, например, гидрокси или (C_1-6)алкоксикарбонильной группой.

Изобретение, кроме того, включает способ получения соединения формулы I, включающий сочетание подходящих защищенных аминокислот или аналогов аминокислот с последующим удалением защитных групп.

Соединения по формуле I могут быть получены обычным для таких соединений способом.

Для этой цели подходящие производные аминокислот или пептиды с защищенным N в -положении (и с защищенной боковой цепью, если присутствует реакционно-способная боковая цепь) активируют и вводят в реакцию сочетания с подходящими производными аминокислот или пептидами с защищенным карбоксилом либо в растворе, либо на твердом носителе. Защиту -аминогрупп обычно осуществляют уретановыми группами, такими как лабильные под действием кислот трет-бутилоксикарбонильная (Воc) группа, бензилоксикарбонильная (Z) группа и их замещенные аналоги или лабильная под действием оснований 9-фторенилметилоксикарбонильная (Fmoc) группа. Z группа может быть также удалена каталитическим гидрирированием. Другие подходящие аминозащитные группы включают Nps, Bmv, Врос, Msc и др. Хороший обзор аминозащитных групп дан в The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, E. Gross and J. Meienhofer, Eds. (Academic Press, New York, 1981). Защиту карбоксильных групп осуществляют путем образования сложных эфиров, например эфиров, лабильных под действием оснований, подобных метиловым или этиловым эфирам, или эфиров, лабильных под действием кислот, подобных трет-бутиловым эфирам, или эфиров, лабильных при гидрогенолизе, подобных бензиловым эфирам. Защита группы боковой цепи ацилгуанидина может быть осуществлена при использовании вышеупомянутых групп.

Активация карбоксильной группы подходящих защищенных аминокислот или пептидов может осуществляться азидом, смешанным ангидридом, активным эфиром или карбодиимидным методом, особенно с добавлением каталитических и подавляющих рацемизацию соединений, таких как 1-гидроксибензотриазол, N-гидроксисукцинимид, 3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазин, N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимид, что описано в The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology (см. выше) и Pure and Applied Chem. 59(3), 331-344 (1987). Сочетание ацилгуанидиновой группы с С-концом подходящих N--защищенных производных аминокислот или пептидов может быть осуществлено вышеописанными методами сочетания.

В подходящем способе для получения соединений согласно изобретению, где Q представляет -C(О)Y, защищенную глютаминовую кислоту (Glu) сочетают с группой Y, снимают защиту, после чего сочетают N-конец с А-В-Х-частью молекулы для получения соединения формулы A-B-X-Glu-Y. По отдельной процедуре S-метилизомочевину защищают и превращают в защищенный гуанидин. Защищенный гуанидин сочетают с А-В-Х-Glu-Y и после снятия защиты получают соединение формулы I.

Соединения по изобретению, которые могут быть в форме свободного основания, могут быть выделены из реакционной смеси в форме фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемые соли могут быть также получены путем реакции свободного основания формулы I с органической или неорганической кислотой, такой как хлористый водород, бромистый водород, йодистый водород, серная кислота, фосфорная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, метансульфоновая кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, щавелевая кислота, лимонная кислота, бензойная кислота и аскорбиновая кислота.

Соединения согласно настоящему изобретению могут иметь один или несколько хиральных атомов углерода и могут поэтому быть получены в виде чистого энантиомера или в виде смеси энантиомеров, или в виде смеси, содержащей диастереомеры. Способы получения чистых энантиомеров хорошо известны, например кристаллизация солей, полученных из оптически активных кислот и рацемической смеси, или хроматография с использованием хиральных колонок. Для диастереомеров могут быть использованы колонки с прямой фазой или с обращенной фазой.

Соединения согласно изобретению могут вводиться энтерально или парентерально и для человека предпочтительно в суточной дозе 0,001-100 мг на кг веса тела, предпочтительно 0,01-10 мг на кг веса тела. Эти соединения в смеси с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, описанными, например, в стандартной ссылке Gennaro et al. Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Publishing Company, 1990, см. в особенности Part 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture), могут быть спрессованы в твердые стандартные дозы, такие как пилюли, таблетки, или могут быть превращены в капсулы или свечи. Посредством фармацевтически пригодных жидкостей соединения могут быть также применены в форме раствора, суспензии, эмульсии, например, для использования как препарат для инъекций или как спрей, например, для использования в виде носового спрея.

Для изготовления дозированных единиц, например таблеток, предполагается использовать обычные добавки, такие как наполнители, красители, полимерные связующие и тому подобное. В общем, может быть использована любая фармацевтически приемлемая добавка, которая не нарушает функцию активного соединения.

Подходящие носители, с которыми могут вводиться композиции, включают лактозу, крахмал, производные целлюлозы и т.п. или их смеси, используемые в подходящих количествах.

Изобретение дополнительно поясняется нижеследующими примерами.

Термин "Glu (гуанидин)" означает Bzl - бензил; Вос - трет-бутилоксикарбонил; Cbz - бензилоксикарбонил; Ас - ацетил; РАс - фенилацетил; Glu - глютаминовая кислота; Cha - циклогексилаланин; Pro - пролин; Phe - фенилаланин; 1-Piq - 1-карбоксипергидроизохинолин; Nal - 2-нафтилаланин; Asp - аспарагиновая кислота.

Времена удерживания (R_t ЖХ), если не указано другое, приведены для жидкостной хроматографии с обращенной фазой на колонке Supelcosil LC-18-DB (2,1 мм 25 см).

ПРИМЕР 1 HOOC-CH₂-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly--Ala-гуанидин (а). N-трет-бутилоксикарбонил-S-метилизотиомочевина Полусульфат S-метилизотиомочевины (10 г) суспендировали в дихлорметане (100 мл). К суспензии добавляли при перемешивании 4 н. раствор гидроокиси натрия (10 мл). Реакционную смесь помещали в ледяную баню, добавляли по каплям дитрет-бутилдикарбонат (15,7 г) в дихлорметане (100 мл) вместе с 2 н. раствором гидроокиси натрия для поддержания рН около 11. После того, как добавление завершилось, реакционную смесь оставляли при перемешивании на ночь при комнатной температуре. Отделяли дихлорметановый слой и водный слой экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали водой, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали под вакуумом. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (элюент: гептан/этилацетат 4/1 об./об. %), получая N-трет-бутилоксикарбонил-S-метилизотиомочевину (9,38 г).

ТСХ: R_f=0,75, силикагель, этилацетат/гептан 3/1 об./об.%.

(b). N-бензилоксикарбонил-N'-трет-бутилоксикарбонил-S-метилизотиомочевина N-трет-бутилоксикарбонил-S-метилизотиомочевину (2 г) растворяли в дихлорметане (20 мл). К раствору при перемешивании добавляли 4 н. раствор гидроокиси натрия (2 мл). Реакционную смесь помещали в ледяную баню; N-бензилоксикарбонилоксисукцинимид (2,62 г) в дихлорметане (20 мл) добавляли по каплям вместе с 2 н. раствором гидроокиси натрия для поддержания рН около 11. После того, как добавление завершилось, реакционную смесь оставляли при перемешивании на ночь при комнатной температуре. Отделяли дихлорметановый слой и водный слой дважды промывали дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали водой и сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали под вакуумом. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (элюент: гептан/этилацетат 3/2 об. /об. %), получая N-бензилоксикарбонил-N'-трет-бутилоксикарбонил-S-метилизотиомочевину (3,15 г).

ТСХ: R_f=0,78, силикагель, этилацетат/гептан 1/1 об./об.%.

(с). N-Cbz-N¹-(трет-Вос)-гуанидин N-бензилоксикарбонил-N¹-трет-бутилоксикарбонил-S-метилизотиомочевину (3,15 г) растворяли в метанольном растворе аммиака (2,4 М, 50 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Смесь упаривали под вакуумом и полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (элюент: дихлорметан/метанол 95/5 об. /об. %), получая N-Cbz-N'-(трет-Вос)-гуанидин (1,83 г).

ТСХ: R_f= 0,80, силикагель, дихлорметан/метанол 9/1 об./об.%.

(d). N-(трет-Вос)-гуанидин гидрохлорид 10% палладий на древесном угле (250 мг) и 3,12 мл 2 н. раствора хлористого водорода добавляли к раствору N-Cbz-N'-(трет-Вос)-гуанидина (1,8 г) в метаноле (50 мл). Смесь гидрировали при атмосферном давлении при комнатной температуре в течение 1 ч. Палладиевый катализатор удаляли фильтрацией и растворитель удаляли выпариванием при пониженном давлении, получая количественно N-(трет-Вос)-гуанидин гидрохлорид.

ТСХ: R_f=0,10, силикагель, дихлорметан/метанол 9/1 об./об.%.

(e). Cbz--Ala-(N-трет-Вос)-гуанидин Cbz--Ala-OH (171 мг) растворяли в сухом диметилформамиде (5 мл). После добавления триэтиламина (212 мкл) реакционную смесь помещали под азот и охлаждали до -15^oС. Затем добавляли изобутилхлороформат (99 мкл) и смесь перемешивали в течение 15 мин при -15^oС. К холодной смеси добавляли N-(трет-Вос)-гуанидин гидрохлорид (150 мг) и триэтиламин (106 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -15^oС и затем выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин. Триэтиламин гидрохлорид отфильтровывали и фильтрат выпаривали до сухого остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (элюент: дихлорметан/метанол 95/5 об./об.%), получая Cbz-p-Ala-(N-трет-Вос)-гуанидин (256 мг).

ТСХ: R_f=0,50, силикагель, дихлорметан/метанол 9/1 об./об.%.

(f). H--Ala-(N-трет-Вос)-гуанидин гидрохлорид.

10% палладий на древесном угле (100 мг) и 300 мкл 4 М раствора хлористого водорода добавляли к раствору Cbz--Ala-(N-трет-Вос)-гуанидина (220 мг) в диметилформамиде (5 мл). Смесь гидрировали при атмосферном давлением при комнатной температуре в течение 1 ч. Палладиевый катализатор удаляли фильтрацией и растворитель удаляли выпариванием при пониженном давлении, получая количественно H--Ala-(N-трет-Вос)-гуанидин гидрохлорид.

ТСХ: R_f=0,10, силикагель, дихлорметан/метанол 9/1 об./об.%.

(g). N-цикпопентил-Glу-ОМе Циклопентанон (15,6 г) добавляли к раствору H-Gly-OMeHCI (23,2 г) в 200 мл метанола. Смесь перемешивали в течение 15 минут и добавляли цианборогидрид натрия (7 г). Величину рН доводили до 6. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 час при комнатной температуре. Для завершения реакции добавляли циклопентанон (1 г) и продолжали перемешивание. Протекание реакции контролировали по ТСХ. Когда весь исходный материал исчезал, смесь подкисляли до рН 2 и перемешивали в течение 30 минут. Растворитель удаляли и остаток разбавляли водой. Раствор промывали эфиром, рН доводили до 12 6 н. гидроокисью натрия и экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором хлористого натрия, сушили над сульфатом натрия и выпаривали под вакуумом, получая 16 г масла.

R_f=0,46 в смеси этилацетат/пиридин/уксусная кислота/вода 63/20/6/11 (об. %) на окиси кремния.

(h). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-OMe Трет-бутилбромацетат (17 г) добавляли при перемешивании к раствору H-D-Cha-OMeHCl (26 г) в 300 мл ацетонитрила. Величину рН смеси доводили до 8,5 диизопропилэтиламином. Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре и выпаривали под вакуумом. Остаток растворяли в дихлорметане и раствор промывали водой, сушили над сульфатом натрия и выпаривали под вакуумом. Хроматография на силикагеле в смеси гексан/этилацетат 9/1 (об./об.%) дала 20 г N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-OMe.

R_f=0,46 в смеси этилацетат/пиридин/уксусная кислота/вода 15,75/5/1,5/2,75 (об.%) на окиси кремния.

(i). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OMe Величину рН раствора N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-OMe (20 г) и дитрет-бутилдикарбоната (17 г) доводили до 8,5 диизопропилэтиламином. Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляли под вакуумом. К остатку добавляли дихлорметан и воду. Органический слой отделяли, промывали холодным 1 н. хлористым водородом, водой, 5% гидрокарбонатом натрия и водой. Органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтрат упаривали до аморфного твердого N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OMe с выходом 28 г.

R_f= 0,60 в смеси этилацетат/пиридин/уксусная кислота/вода 252/20/6/11 (об.%) на окиси кремния.

(j). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OH Раствор N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OMe (28 г) в 420 мл смеси диоксан: вода 9/1 (об.%) обрабатывали избытком 1 н. гидроокиси натрия для поддержания рН на уровне 13 в течение 90 минут при комнатной температуре. После подкисления смесь выливали в воду и экстрагировали дихлорметаном. Органический слой промывали водой и сушили над сульфатом натрия. Фильтрат упаривали, получая 24 г N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OH.

R_f=0,23 в смеси дихлорметан/метанол 9/1 (об.%) на окиси кремния.

(k). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly-OMe N-циклопентил-Gly-OMe (10,2 г) и 2-1Н-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилуронийтетрафторборат (TBTU, 21,2 г) добавляли к раствору N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OH (24 г) в 300 мл N, N-диметилформамида. Величину рН доводили до 8,5. Смесь оставляли на ночь при перемешивании при комнатной температуре и концентрировали выпариванием. К остатку добавляли воду и этилацетат. Органический слой отделяли и промывали 1 н. хлористым водородом, водой, 5% гидрокарбонатом натрия и водой и сушили над сульфатом натрия. Фильтрат выпаривали и остаток хроматографировали на силикагеле в смеси гексан/этилацетат 8/2 (об./об.%) в качестве элюента. Фракции, содержащие N-трет-бутилоксикарбонилметил-N-Вос-D-Сhа-N-циклопентил-Сlу-ОМе, разливали тонким слоем и выпаривали. Выход 17 г.

R_f=0,57 в смеси гексан/этилацетат (об.%) на окиси кремния.

(l). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly-OH N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly-OMe (17 г) омыляли в смеси диоксан/вода 1/1 (об.%, 150 мл) и разбавляли гидроокисью натрия, получая 15 г аморфного твердого вещества. Хроматография на силикагеле со смесью дихлорметан/метанол 95/5 (об.%) в качестве элюента дала 13 г N-трет-бутилоксикарбонилметил-N-Вос-О-Сhа-N-циклопентил-Glу-ОН.

R_f=0,30 в смеси дихлорметан/метанол 9/1 (об.%) на окиси кремния.

(m). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly--Ala-(N-трет-трет-Вос)-гуанидин N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly-OH (310 мг) растворяли в сухом диметилформамиде (10 мл). После добавления триэтиламина (168 мкл) реакционную смесь помещали под азот и охлаждали до -15^oС. Затем добавляли изобутилхлороформат (79 мкл) и смесь перемешивали в течение 15 мин при -15^oС. H--Ala-(N-трет-Вос)-гуанидин гидрохлорид (154 мг) растворяли в сухом диметилформамиде и добавляли по каплям к охлажденному смешанному раствору ангидрида, поддерживая рН на уровне 8,5 добавлением триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали 1 час при -15^oС и затем 1 час при 0^oС. Реакционную смесь упаривали до сухого остатка. Остаток растворяли в этилацетате и затем промывали водой, рассолом, сушили над сульфатом натрия и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали хроматографией на окиси кремния (элюент: дихлорметан/метанол 95/5 об. %), получая N-(трет-бутилоксикарбонилметил) -N-Boc-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly--Ala-(N-трет-Вос)-гуанидин (268 мг).

ТСХ: R_f=0,80, силикагель, дихлорметан/метанол 9/1 (об.%).

(n). HOOC-CH₂-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly--Ala-гуанидин N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly--Ala-(N-трет-Вос)-гуанидин (265 мг) обрабатывали 90% смесью трифторуксусная кислота/вода (10 мл) в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом, остаток растворяли в воде и напрямую подвергали препаративной ЖХВР в колонке Supelcosil LC-18-DB, используя градиентную элюирующую систему от 20% А/80% В до 20% А/20% В/60% С за 40 мин при скорости потока 15 мл/мин (А: 0,5 М фосфатный буфер, рН 2,1; В: вода; С: ацетонитрил/вода 6/4). Выход: 185 мг HOOC-CH₂-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly--Ala-гуанидина.

R_t (ЖХ): 32,22 мин, от 20% А/80% В до 20% А/20% B/60% С за 40 мин.

ПРИМЕР 2 HOOC-CH₂-D-Cha-Pro-Glu (гуанидин)-2-тиазолил (a). H-D-Cha-OMeHCl К охлажденному (-20^oС) и сухому метанолу (195 мл) добавляли по каплям тионилхлорид (28 мл). Добавляли H-D-ChaOHHCl и реакционную смесь нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 5 часов. Смесь концентрировали под вакуумом и переиспаряли с метанолом (3 раза). Остаток кристаллизовали из смеси метанол/диэтиловый эфир, получая Н-D-Cha-OMeHCl в виде кристаллического порошка (40,9 г).

ТСХ: R_f= 0,66, силикагель, н-бутанолуксусная кислота/вода 10/1/3 (об.%).

(b). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-OMe Трет-бутилбромацетат (36 г) добавляли при перемешивании к раствору H-D-Cha-OMeHCl (40,9 г) в 400 мл ацетонитрила. Величину рН смеси доводили до 8,5 диизопропилэтиламином. Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре и выпаривали под вакуумом. Остаток растворяли в дихлорметане и раствор промывали водой, сушили над сульфатом натрия и выпаривали под вакуумом. Хроматография на силикагеле в смеси гептан/этилацетат 9/1 (об. %) давала 64 г N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-OMe.

ТСХ: R_f= 0,25, силикагель, этилацетат/гептан 1/1 (об.%).

(c). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OMe Величину рН раствора N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-OMe (64 г) и дитрет-бутилдикарбоната (40,3 г) доводили до 8,5 диизопропилэтиламином. Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляли под вакуумом. К остатку добавляли дихлорметан и воду. Органический слой отделяли, промывали холодным 1 н. хлористым водородом, водой, 5% гидрокарбонатом натрия и водой. Органический слой сушили над сульфатом натрия и выпаривали фильтрат, получая аморфный твердый N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OMe с выходом 59,6 г.

ТСХ: R_f=0,50, силикагель, этилацетат/гептан 1/1 (об.%).

(d). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OH Раствор N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OMe (59,6 г) в 900 мл смеси диоксан/вода 9/1 (об.%) обрабатывали избытком 6 н. гидроокиси натрия, чтобы поддерживать рН 12, в течение 6 часов при комнатной температуре. После подкисления смесь выливали в воду и экстрагировали дихлорметаном. Органический слой промывали водой и сушили над сульфатом натрия. Фильтрат упаривали, получая 54 г N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OH.

ТСХ: R_f=0,60, силикагель, дихлорметан/метанол 9/1 (об.%).

(e). N-трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-Pro-Obzl К холодному (0^oС) раствору N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-OH (13,5 г) в N,N-диметилформамиде (150 мл) добавляли последовательно 1-гидроксибензотриазол (7,09 г), дициклогексилкарбодиимид (7,61 г), H-Pro-OBzlHCI (9,31 г) и триэтиламин (6 мл). Смесь перемешивали при 0^oС в течение 1 часа и затем оставляли на ночь при комнатной температуре. Смесь охлаждали до -20^oС и дициклогексамочевину удаляли фильтрацией. Фильтрат упаривали до сухого остатка. Остаток растворяли в этилацетате и промывали последовательно 5% гидрокарбонатом натрия, водой, 3% лимонной кислотой и рассолом, сушили над сульфатом натрия и концентрировали под вакуумом. Остаток хроматографировали на силикагеле в смеси гептан/этилацетат 3/1 (об.%) в качестве элюента. Фракции, содержащие N-трет-бутилоксикарбонилметил-N-Вос-D-Сhа-Рrо-OBzl разливали тонким слоем и выпаривали. Выход 15 г.

ТСХ: R_f= 0,70, силикагель, этилацетат/гептан 1/1 (об.%).

(f). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH 10% палладий на древесном угле (750 мг) добавляли к раствору N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-Pro-OBzl (15 г) в метаноле (150 мл). Смесь гидрировали при атмосферном давлением при комнатной температуре в течение 1 ч. Палладиевый катализатор удаляли фильтрацией и растворитель удаляли выпариванием при пониженном давлении, получая 11,2 г N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH.

ТСХ: R_f= 0,65, силикагель, этилацетат/пиридин/уксусная кислота/вода 213/20/61/11 (об.%).

(g). Boc-Glu(О-трет-Bu)-N-МеОМе К раствору Boc-Glu(O-трет-Вu)-ОН (15 г) в дихлорметане (150 мл) добавляли N, O-диметилгидроксиламин гидрохлорид (5,3 г) и [2-1Н-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилуронийтетрафторборат] (15,87 г) и рН доводили до 8-8,5 добавлением триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Смесь последовательно промывали холодным 0,3 М раствором соляной кислоты, водой, 5% водным раствором гидрокарбоната натрия и водой. Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (элюент: дихлорметан/метанол 98/2 об.%), получая Boc-Glu(O-трет-Bu)-N-MeOMe (17,5 г).

ТСХ: R_f=0,85, силикагель, дихлорметан/метанол 9/1 (об.%).

(h). Boc-Glu(O-трет-Вu)-2-тиазолил К холодному (-78^oС) раствору н-бутиллития (88,9 ммоль) в диэтиловом эфире (90,7 мл) при перемешивании добавляли по каплям раствор 2-бромтиазола (14,6 г) в диэтиловом эфире (75 мл). После перемешивания раствора при -78^oС в течение 30 мин раствор добавляли по каплям к раствору Boc-Glu(O-трет-Вu)-N-МеОМе (14 г) в сухом тетрагидрофуране (150 мл). Смесь перемешивали при -78^oС в течение 1 ч, затем смесь выливали в охлажденный льдом 5% водный раствор лимонной кислоты. Смеси давали нагреться до комнатной температуры, после чего слои разделяли. Водный слой экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали водой, насыщенным водным раствором хлористого натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали хроматографией на окиси кремния (элюент: дихлорметан/этилацетат 9/1 об.%), получая Вос-Сlu(O-трет-Вu)-2-тиазолил (6,83 г).

ТСХ: R_f= 0,92, силикагель, дихлорметан/этилацетат 7/3 (об.%).

(i). H-Glu-(2-тиазолил)TFA Boc-Glu(O-трет-Вu)-2-тиазолил (450 мг) растворяли в 3 мл трифторуксусной кислоты (TFA), 1 мл дихлорметана и 150 мкл анизола и перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. После удаления растворителя выпариванием сырой амин выделяли в виде желтого масла с количественным выходом и использовали непосредственно для получения N-Boc-N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-Pro-Glu-(2-тиазолила).

ТСХ: R_f= 0,10, силикагель, этилацетат/пиридин/уксусная кислота/вода 63/20/6/11 об.%.

(j). N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-N-Boc-D-Cha-Pro-Glu-(2-тиазолил) N-Boc-N-(трет-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-Pro-OH (590 мл) растворяли в сухом диметилформамиде (15 мл). После добавления диизопропилэтиламина (416 мкл) реакционную смесь помещали под азот и охлаждали до -15^oС. Постепенно добавляли изобутилхлороформат (158 мкл) и смесь выдерживали при перемешивании при -15^oС в течение 15 мин. H-Glu-(2-тиазолил)ТFА (300 мг) растворяли в сухом диметилформамиде (10 мл) и добавляли по каплям к холодному раствору смешанного ангидрида, поддерживая рН на уровне 8,5 добавлением диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при -15^oС. Реакционную смесь выпаривали до сухого остатка. Остаток растворяли в этилацетате и последовательно промывали водой, 5% водным раствором гидрокарбоната натрия, водой, рассолом, сушили над сульфатом натрия и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (элюент: дихлорметан/метанол 95/5 об.%), получая N-Boc-N-трет-бутилоксикарбонилметил-D-Cha-Pro-Glu-(2-тиазолил) (171 мг).

ТСХ: R_f=0,92, силикагель, дихлорметан/этилацетат 9/1 (об.%).

(k). N-(трет-бутилоксикарбонил)-S-метилизотиомочевина Полусульфат S-метилизотиомочевины (10 г) суспендировали в дихлорметане (100 мл). К суспензии при перемешивании добавляли 4 н. раствор NaOH. Реакционную смесь помещали в баню со льдом и по каплям добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (15,7 г) вместе с 2 н. раствором гидроокиси натрия для поддержания рН около 11. После завершения реакции реакционную смесь пер