Способы и композиции, используемые для ингибирования ангиогенеза

Способы и композиции, используемые для ингибирования ангиогенеза

Реферат

 

Изобретение относится к медицине. В изобретении описаны способы ингибирования ангиогенеза в тканях с использованием витронектиновых антагонистов _v3 и, в частности, для ингибирования ангиогенеза в воспалительных тканях и в опухолевых тканях и в метастазах с использованием терапевтических композиций, содержащих _v3-антагонисты. Изобретение обеспечивает возможность лечения некоторых воспалительных, опухолевых заболеваний. 7 с. и 33 з.п. ф-лы, 44 ил., 7 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится, в целом, к медицине и конкретно относится к способам и композициям для ингибирования ангиогенеза тканей с использованием антагонистов витронектинового рецептора _v3. Предпосылки изобретения Интегрины представляют собой класс клеточных рецепторов, которые, как известно, связывают внеклеточные белки матрикса, и поэтому опосредуют взаимодействия клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс, именуемые как события адгезии клетки. Однако несмотря на то, что многие интегрины и лиганды, которые связывают интегрин, и описаны в литературе, биологическая функция многих интегринов остается смутной. Интегриновые рецепторы составляют семейство белков с совпадающими структурными характеристиками нековалентных гетеродимерных гликопротеиновых комплексов, образованных - и -субъединицами.

Витронектиновый рецептор, названный по его исходной характеристике предпочтительного связывания с витронектином, известен в настоящее время как относящийся к трем разным интегринам, обозначенным _v1, _v3 и _v5. Horton, Int. J. Exp. Patnol., 71:741-759. _v1 связывает фибронектин и витронектин. _v3 связывает большое множество лигандов, в том числе фибрин, фибриноген, ламинин, тромбоспондин, витронектин, фактор фон Вилленбранда, остеопонтин и костный сиалопротеин I. _v5 связывает витронектин. Эти три интегрина важны для осуществления специфической клеточной адгезии во многих клеточных взаимодействиях в тканях и исследуются до сих пор, но очевидно, что существуют разные интегрины с разными биологическими функциями.

Существенный участок узнавания в лиганде для многих интегринов представляет собой трипептидную последовательность аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD). RGD обнаружена во всех вышеуказанных лигандах для витронектиновых рецепторных интегринов. Этот RGD-узнающий участок можно имитировать с помощью полипептидов ("пептидов"), которые содержат данную RGD-последовательность и такие RGD-пептиды представляют собой известные ингибиторы с функцией интегрина. Важно, однако, отметить, что в зависимости от последовательности и структуры RGD-пептида специфичность ингибирования может изменяться для мишенно-специфичных интегринов.

Обсуждение RGD-узнающего участка смотрите у Nature, 309:30-33 (1984) и Pierschbacher с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5985-5988 (1984). Различные RGD-полипептиды с варьирующей интегриновой специфичностью описаны у Grant с соавт., Cell, 58:933-943 (1989), Cheresh с соавт., Cell, 58-945-953 (1989), Aumailley с соавт., FEBS Letts., 291-50-54 (1991) и Pfaff с соавт., J. Biol. Chem. 269:20233-20238 (1994) в Патентах Соединенных штатов 4517686, 4578079, 4589881, 4614517, 4661111, 4792525, 4683291, 4879237, 4988621, 5041380 и 5061693.

Ангиогенез представляет собой васкуляризацию тканей, в которой происходит рост вновь образующихся сосудов, и представляет собой также так называемую реваскуляризацию. Данный процесс опосредован с помощью инфильтрации эндотелиальных клеток и клеток гладкой мускулатуры. Данный процесс осуществляется любым одним из трех путей: сосуды могут вырастать из ранее существовавших сосудов, создание сосудов de novo может осуществляться из предшественников клеток (васкулогенез) или существующие маленькие сосуды могут увеличиваться в диаметре. Blood с соавт., Biochem. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990). Известно, что в сосудистых эндотелиальных клетках содержится как минимум пять RDG-зависимых интегринов, в том числе рецептор витронектина (_v3 и _v5), рецептор коллагена типа I или IV (₁₁), рецептор ламинина (₂₁), фибронектиновый (ламининовый) коллагеновый рецептор (₃₁) рецептор фибронектина (₅₁). Davis с соавт., J. Cell. Biochem., 51:206-218 (1993). Клетки гладкой мускулатуры, как известно, содержат, по крайней мере, шесть RGD-зависимых интегринов, в том числе ₅₁, _v3 и _v5. Ангиогенез является важным процессом в неонатальном росте, и также важен в заживлении ран и в разнообразных клинических заболеваниях, в том числе воспалении ткани, артритах, опухолевом росте, диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна при образовании новых сосудов в ретине и подобных состояниях. Эти клинические проявления ассоциируются с ангиогенезом и именуются сосудистными заболеваниями. Folkman с соавт., Science, 235-442-447 (1987). Как правило, ангиогенез отсутствует во взрослой или зрелой тканях, хотя он может происходить при заживлении раны и в ростовом цикле corpeus leuteum. Смотрите, например, Moses с соавт., Science, 248:1408-1410 (1990).

Было предположено, что ингибирование ангиогенеза, должно быть, представляет собой неплохую терапию по ограничению опухолевого роста. Было предложено ингибировать ангиогенез путем (1) ингибирования высвобождения "ангиогенных молекул", таких как bFGF (фактор роста базисных фибробластов), (2) нейтрализации ангиогенных молекул, таких как используемые в качестве антител к анти-bFGF и (3) подавления ответа эндотелиальной клетки на ангиогенные стимулы. Этот последний подход привлек внимание и Folkman с соавт. , Cancer Biology, 3:89-96 (1992) описали несколько ингибиторов ответа эндотелиальной клетки, в том числе ингибитор коллагеназы, базальной мембраны оборотные ингибиторы, ангиостатические стероиды, ингибиторы ангиогенеза, производимые грибами, фактор 4 тромбоцитов, тромбоспондин, артритные лекарственные средства, такие как D-пеницилламин и тиомалат золота, аналоги витамина D₃, альфа-интерферон и другие, которые могли бы использоваться для подавления ангиогенеза. Дополнительно предлагаемые ингибиторы ангиогенеза смотрите у Blood с соавт., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses с соавт. , Science, 248-1408-1410 (1990), Ingber с соавт., Lab. Invest., 59-44-51 (1988) и Патенты Соединенных Штатов 5092885, 5112946, 5192744 и 5202352. Ни один из ингибиторов в вышеприведенных ссылках не приводит к ингибированию _v3. Описаны также RGD-содержащие пептиды, которые ингибируют витронектиновый рецептор _v3. Aumailley с соавт., FEBS Letts., 291:50-54 (1991), Choi с соавт. , J. Vasс. Surg., 19:125-134 (1994), Smith с соавт., J. Biol. Chem., 265: 12267-12271 (1990), и Pfaff с соавт., J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994). Однако роль интегрина _v3 в ангиогенезе никогда не предполагалась и не была установлена до настоящего времени.

Например, Hammes с соавт. , Nature Med., 2:529-53 (1996) подтвердил факты, обнаруженные в настоящем изобретении. В частности, в его статье показано, что циклические пептиды, включающие циклический RGDfV, структура и функция которого была описана раньше в приоритетных заявках, на которых основана настоящая заявка, ингибирует ретинальную реваскуляризацию в мышиной модели ретинальной реваскуляризации, индуцированной гипоксией. В специальном исследовании, которое также подтверждает настоящее изобретение, а также приоритетные заявки, Luna с соавт., Lab. Invest., 75:563-573 (1996) описал два отдельных циклических метилированных RGD-содержащих пептида, которые были частично эффективны в ингибировании ретинальной реваскуляризации в мышиной модели, индуцированной кислородом ишемической ретинопатии. Напротив, пептиды настоящего изобретения почти полностью ингибируют реваскуляризацию в модельных системах, описанных здесь.

Ингибирование клеточной адгезии in vitro с использованием моноклональных антител, иммуноспецифичных к разным субъединицам интегрина, или , вовлекают _v3 в клеточную адгезию разных типов клеток, в том числе эндотелиальные клетки капилляров. Davis с соавт., J. Cell. Biol., 51:206-218 (1993). Кроме того, Nicosia с соавт., Am. J. Pathol., 138:829-833 (1991), описал применение RGD-пептида GRGDS для подавления in vitro образования "микрососудов" из крысиной аорты, культивируемой в коллагеновом геле. Однако подавление образования "микрососудов" in vitro в культурах коллагенового геля не является моделью ингибирования ангиогенеза в тканях, поскольку она не показала, что микрососудистые структуры не представляют собой то же самое, что и капиллярные отростки, или что образование микрососуда в культуре коллагенового геля представляет собой то же, что и неоваскулярный рост в интактной ткани, такой как артритная ткань, опухолевая ткань или заболевание ткани, где ингибирование ангиогенеза представляется желательным.

Для осуществления ангиогенеза эндотелиальные клетки должны вначале деградировать и пересечь кровеносный сосуд базальной мембраны аналогичным способом, используемым опухолевыми клетками во время инвазии и образования метастазов.

Авторы настоящего изобретения ранее сообщали, что ангиогенез зависит от взаимодействия между интегринами сосудов и белками внеклеточного матрикса. Brooks с соавт., и Science, 264:569-571 (1994). Кроме того, он сообщил, что программируемая клеточная смерть (апоптоз) ангиогенных сосудистых клеток инициируется путем взаимодействия, которое должно быть подавлено некоторыми антагонистами васкулярного интегрина _v3. Brooks с соавт., Cell, 79:1157-1164 (1994). Совсем недавно авторы настоящего изобретения сообщили, что связывание металлопротеиназы-2 (ММР-2) матрикса с витронектиновым рецептором (_v5) можно подавить, используя антагонисты _v5 и, таким образом, ингибировать ферментативную функцию протеиназы. Brooks с соавт., Cell, 85:683-693 (1996).

Помимо исследований, сообщенных здесь, заявители не знают какой-либо другой аргументации, что ангиогенез мог бы быть ингибирован в ткани с использованием ингибиторов клеточной адгезии. В частности никогда прежде не доказывалось другими, что _v3-функция необходима для ангиогенеза в ткани или что антагонисты _v3 могут подавлять ангиогенез в ткани.

Краткое описание настоящего изобретения В настоящем изобретении описаны доказательства того, что ангиогенез в ткани нуждается в интегрине _v3 и что ингибиторы _v3 могут подавлять ангиогенез. Представленное описание также аргументирует, что антагонисты других интегринов, таких как _IIb3 или _v1, не подавляют ангиогенез, главным образом потому, что эти другие интегрины не существенны для осуществления ангиогенеза.

Поэтому в настоящем изобретении описаны способы подавления ангионеза в ткани, включающие введение в определенную ткань композиции, включающей количество _v3-антагониста, подавляющего ангиогенез.

Обрабатываемая ткань может представлять собой любую ткань, в которой желательно осуществить ингибирование ангиогенеза, такую как больную ткань, где наблюдается реваскуляризация. Иллюстративные ткани включают воспаленные ткани, твердые опухоли, метастазы, ткани, подвергающиеся рестенозу и им подобные ткани.

_v3-антагонист, используемый в настоящих способах, обладает способностью к связыванию с _v3 и к конкурентному ингибированию способности _v3 связываться с природным лигандом. Данный антагонист предпочтительно проявляет специфичность по _v3 перед другими интегринами. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный _v3-антагонист подавляет связывание фибриногена или других RGD-содержащих лигандов с _v3, но практически не подавляет связывание фибриногена с _IIb3. Предпочтительный _v3-антагонист может быть слитым полипептидом, циклическим или линейным полипептидом, производным полипептида, моноклональным антителом, иммунно реагирует с _v3, органическим имитатором _v3 или его функциональным фрагментом.

Краткое описание графических материалов В чертежах, составляющих часть данного описания: Фигуры 1A-1D иллюстрируют тканевое распределение субъединиц интегрина, ₃ и ₁, в нормальной коже и в коже, подвергнувшейся раневому заживлению, обозначаемой в качестве гранулированной ткани. Иммунохимию с антителами к ₃ и ₁ осуществляли, как описано в примере 3А. Фигуры 1А и 1В иллюстрируют соответственно иммунореактивность анти-₃ в нормальной коже и в гранулированной ткани. Фигуры 1С и 1D иллюстрируют соответственно иммунореактивность анти-₁ в нормальной коже и в гранулированной ткани.

Фигуры 2A-2D иллюстрируют тканевое распределение фактора фон Виллебранда и лигандов ламинина, которые соответственно связывают субъединицы интегрина ₃ и ₁ в нормальной коже и в коже, подвергнувшейся раневому заживлению, обозначаемой в качестве гранулированной ткани.

Иммуногистохимию с антителами к фактору фон Виллебранда (анти-vWF) и к ламинину (анти-ламинин) осуществляли, как описано в примере 3В. Фигуры 2А и 2В иллюстрируют соответственно иммунореактивность анти-vWF в нормальной коже и в гранулированной ткани. Фигуры 2С и 2D иллюстрируют соответственно иммунореактивность анти-ламинина в нормальной коже и в гранулированной ткани.

Фигуры 3A-3D иллюстрируют тканевое распределение витронектинового интегринового рецептора _v3 в тканевых биоптатах соответственно рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака молочной железы и рака легкого. Иммуногистохимию с LМ609-антителами к _v3 осуществляли, как описано в примере 3С.

Фигура 4 иллюстрирует типичную микрофотографию САМ настоящего изобретения без кровеносных сосудов в необработанном 10-дневном эмбрионе цыпленка. Данный препарат описан в примере 5В.

Фигуры 5А-5С иллюстрируют тканевое распределение интегринов ₁ и _v3 в САМ-препарате настоящего изобретения. Фигура 5А показывает распределение субъединицы ₁ в необработанном 10-дневном САМ-препарате, которую детектировали путем иммунофлуоресцентной иммунореактивности с CSAT, антителом к анти-₁. Фигура 5В показывает распределение рецептора _v3 в необработанном 10-дневном САМ-препарате, который детектировали путем иммунофлуоресцентной иммунореактивности с LM609, антителом к анти-_v3. Фигура 5С показывает распределение рецептора _v3 в bFGF-обработанном 10-дневном САМ-препарате, который детектировали путем иммунофлуоресцентной иммунореактивности с LM609, антителом к анти-_v3. Эти обработки и результаты описаны в примере 5С.

Фигура 6 иллюстрирует количественный анализ гистограммы, касающейся экспрессии _v3 и ₁ в необработанных и bFGF-обработанных 10-дневных CAMs, как описано в примере 6А. Средняя интенсивность флуоресценции отложена на оси Y, а профили интегрина отложены на оси X.

Фигуры 7А и 7С иллюстрируют внешний вид соответственно необработанных 10-дневных САМ, bFGF-обработанных САМ и САМ, обработанных TNF, методы и результаты которых описаны в примере 6А.

Фигуры 8А-8Е иллюстрируют эффект местной обработки антителами ангиогенеза, индуцированного bFGF, у 10-дневного САМ, как описано в примере 7А1). Фигура 8А показывает необработанный САМ-препарат, который избавлен от кровеносных сосудов. Фигура 8В показывает инфильтрацию новой сосудистой сети в область, ранее избавленную от сосудистой сети, вызванной обработкой bFGF. Фигуры 8С, 8D и 8Е показывают соответственно эффекты антител к ₁ (анти-₁; CSAT), _v5 (анти-_v5; P3G2) и _v3 (анти-_v3; LM609).

Фигуры 9А-9С иллюстрируют эффект внутривенной инъекции синтетического пептида 66203 на ангиогенез, индуцированный опухолями, как описано в примере 7Е2). Фигура 9 показывает отсутствие ингибирующего эффекта внутривенной обработки контрольным пептидом (контрольный опухолевый пептид) на ангиогенез, полученного в результате индукции опухоли. Ингибирование такого ангиогенеза внутривенной инъекцией пептида 66203 (циклический RGD опухоли) показано на фигуре 9В. Отсутствие ингибирующих эффектов или цитотоксичности на зрелые предсуществующие сосуды после внутривенной инфузии пептида 66203 в области, примыкающей к данной обработанной опухолевой области, показано на фигуре 9С (циклический RGD прилегающего САМ).

Фигуры 10А-10С иллюстрируют эффект внутривенного применения моноклональных антител к фактору роста, индуцирующего ангиогенез, как описано в примере 7В1). Фигура 10А показывает ангиогенез, индуцированный bFGF, не подвергнутый обработке антителом (контроль). Ингибирования ангиогенеза не происходило, когда аналогичный препарат обрабатывали Р3G2-антителом к анти-_v5, как показано на фигуре 10В. Ингибирование ангиогенеза происходило при обработке LM609-антителом к анти-_v3, как показано на фигуре 10С.

Фигуры 11А-11С иллюстрируют эффект на эмбриональный ангиогенез после местного применения антител к антиинтегрину, как описано в примере 7С. Ангиогенез не ингибировался обработкой 6-дневного САМ соответственно антителами к анти-₁ и к анти-_v5, показанной на фигурах 11А и 11В. Напротив, обработка LМ609-антителом к анти-_v3 давала ингибирование образования кровеносного сосуда, как показано на фигуре 11С.

Фигура 12 иллюстрирует количественный анализ числа сосудов, пронизывающих опухоль в САМ-препарате, как описано в примере 7D1). График показывает число сосудов, графически отложенных на оси Y, возникающих после местного применения CSAT (анти-₁), LM609 (анти-_v3) или P3G2 (анти-_v3).

Фигуры 13A-13D иллюстрируют сравнение между сырым весом опухолей на 7-й день после обработки и исходными весами, как описано в Примере 9А1а). Каждый столбик соответствует средней S. E. для группы из 5-10 опухолей. Опухоли были получены от САМ-препаратов и внутривенно обработанных препаратов человеческой меланомы (M21-L) (фигура 13А), карциномы поджелудочной железы (Fg) (фигура 13В), карциномы легкого (UCLAP-3) (фигура 13С) и от карциномы гортани (НЕр3) (фигура 13D) с помощью PBS, CSAT (анти-₁) или LM609 (анти-_v3). Построенные графики показывают вес опухоли, отложенный на оси Y, после внутривенного применения CSAT (анти-₁), LM609 (анти-_v3) или PBS, что указано на оси X.

Фигуры 14А и 14В иллюстрируют гистологические срезы опухолей, обработанных с помощью P3G2 (анти-_v5) (фигура 14А) и LM609 (анти-_v3) (фигура 14В) и окрашенных гематоксилином и эозином, как описано в примере 9А1)b. Как показано на фигуре 14А, опухоли, обработанные с помощью контрольного антитела (P3G2), показали множество жизнеспособных активно делящихся опухолевых клеток, как показано на мистических фигурах (стрелка-указатель), а также множество кровеносных сосудов (линейные стрелки), пронизывающих всю опухолевую строму. Напротив, на фигуре 14В если и есть, то в опухолях, обработанных с помощью LM609 (анти-_v3), если и были детектированы, то только несколько опухолевых клеток или кровеносных сосудов.

Фигуры 15А-15Е относятся к М21L-опухолям, обработанным с помощью M21L, как описано в примере 9А2), и представляют собой следующее: фигура 15А, контрольный циклический RAD-пептид (69601); фигура 15В, циклический RGD-пептид (66203); фигура 15С, прилегающая САМ-ткань, взятая от одних и тех же эмбрионов, обработанных циклическим RGD-пептидом (66203) и сильно увеличенные опухоли на фигуре 15D, обработанные с помощью контрольного RAD (69601) или циклическим RGD-пептидом (66203) на фигуре 15Е. Фигура 15D изображает нормальные сосуды опухоли, обработанной контрольным пептидом RAD (69601). Фигура 15Е изображает примеры разорванных кровеносных сосудов опухоли, обработанной циклическим RGD-пептидом (66203) (линейные стрелки).

Фигуры 16А-16Е изображают ингибирование ангиогенеза с помощью антагонистов ангиогенеза в глазной кроличьей модели in vivo, как описано в примере 10. Фигура 16А и 16В изображает ангиогенез глаза кролика в присутствии bFGF и mAb P1F6 (анти-_v5). Фигура 16С, 16D и 16Е изображают ингибирование ангиогенеза в глазу кролика в присутствии bFGF и mAb LM609 (анти-_v3).

Фигура 17 изображает схему последовательности операций получения in vivo мышиной модели химеры мышь: человек, как описано в примере 11. Лоскут кожи SCID-мыши заменяли неонатанальной крайней плотью человека и давали приживляться в течение 4-х недель. После приживления трансплантата человеческую крайнюю плоть инокулировали опухолевыми клетками человека. В течение последующего 4-недельного периода определяли заметную опухоль, которая включает человеческую опухоль с человеческой сосудистой сетью, прорастающей из человеческой кожи в человеческую опухоль.

Фигура 18 иллюстрирует процентную долю одиночных клеток, полученных из СAМs, обработанных mAb и пептидом и окрашенных с помощью Арор Tag, как установлено FACS-анализом и описано в примере 12. Затемненные и заштрихованные столбики соответствуют клеткам эмбрионов, обработанных соответственно за 24 часа и 48 часов до анализа. Каждый столбик соответствует средней S.E. трех повторов. CAMs обрабатывали mAb LM609 (анти-_v3) или CSAT (анти-₁) или PBS. CAMs обрабатывали также циклическим пептидом 66203 (цикло-RGDfV, указанным в качестве Пептида 203) или контрольным циклическим пептидом 69601 (цикло-RADfV, указанным в качестве Пептида 601).

Фигуры 19А и 19В иллюстрируют объединенные результаты по суспензиям одиночных клеток CAMs эмбрионов, обработанных CSAT (анти-₁) (фигура 19А) или LM609 (анти-_v3) (фигура 19В), окрашенных с помощью Арор Tag и пропидиййодидом и проанализированных с помощью FACS, как описано в примере 12С. На оси Y представлены численности клеток (Апоптоз), окрашенных Арор Tag, на оси Х представлены значения окраски пропидиййодидом (содержание ДНК). Горизонтальная линия представляет ячейку для негативного окрашивания. Левая и правая секции представляют САМ-клетки эмбрионов, обработанных соответственно CSAT (анти-₁) (фигура 19А) и LM609 (анти-_v3) (фигура 19В). Анализ клеточного цикла осуществляли путем анализа приблизительно 8000 событий на состояние.

Фигуры 20А-20С представляют САМ-ткань CSAT-(анти-₁) обработанных эмбрионов, а фигуры 20D-20E представляют САМ-ткань LM609-(анти-_v3) обработанных эмбрионов, полученных, как описано в примере 12С. Фигуры 20А и 20D изображают ткани, окрашенные с помощью Арор Tag и визуализированные путем флуоресцентного (FITC) наложения на D.I.С. изображение. Фигуры 20В и 20Е изображают те же ткани, окрашенные с помощью mAb LM609 (анти-_v3) и визуализированные с помощью флуоресценции (родамин). Фигуры 20С и 20F представляют слитые изображения одних и тех же тканей, окрашенных с помощью Арор Tag и LM609, где солокализация представлена желтым окрашиванием. Полоса соответствует 15 и 50 мкм соответственно на левой и правой панелях.

Фигура 21 показывает результат ингибирования клеточного прикрепления при испытании с пептидом 85189, как описано в примере 4А. Эффекты пептидного антагониста оценивали в диапазоне доз от 0,001 до 100 мкМ, как отложено на оси X. Прикрепление клеток откладывали на оси Y, измеряемой оптической плотностью (O.D.) при 600 нм. Прикрепление клеток измеряли для поверхностей, покрытых витронектином (прерывистая линия) по отношению к ламинину (непрерывная линия).

Фигуры 22А и 22В показывают представленные ступенчато последовательность кДНК цыпленка ММР-2 вместе с выведенной для нее во второй линии аминокислотной последовательностью. Третья и четвертая линии показывают соответственно выведенные аминокислотную последовательность ММР-2 человека и мыши, как описано в примере 4А. кДНК-последовательность цыпленка представлена в списке SEQ ID NO 29 вместе с кодируемой аминокислотной последовательностью, которая также представлена отдельно в виде SEQ ID NO 30. Нумерация первого нуклеотида 5'-нетранслируемой области и области, кодирующей проферментную последовательность, показана на фигуре 22А в виде отрицательного числа, которое в действительности представлено в качестве номера 1 в Списке Последовательностей, создавая впечатление более длинной последней, чем на фигуре; однако данная нуклеотидная последовательность на данной фигуре идентична по длине и последовательности последовательности, которая представлена в списке последовательностей, за исключением нумерации. В соответствии с этим ссылки на позицию нуклеотида куриного или человеческого ММР-2, таких как в праймерах, для использования в амплифицируемых фрагментах ММР-2 основаны на позиции нуклеотида, как указано на фигуре, а не так, как приведено в Списке Последовательностей.

Фигура 23 показывает результаты в форме гистограммы анализа твердофазного связывания рецептора йодированного ММР-2 по связыванию с _v3 при наличии и без ингибиторов, как описано далее в примере 4В. Эти данные представлены графически в виде связанного СРМ на оси Y по отношению к разным потенциальным ингибиторам и контролю.

Фигура 24 показывает специфичность ММР-2-композиций, полученных от цыпленка по интегриновым рецепторам _v3 и _IIb3 в присутствии ингибиторов ММР-2, как описано далее в примере 4В. Эти данные представлены, как описано в объяснении на фигуре 23.

Фигура 25 показывает эффект куриного ММР-2 (410-637) GST-слитого белка на ангиогенез, индуцированный bFGF, как описано в примере 7А3). Фигуры 25А-В и 25C-D показывают соответственно контроль (фрагмент ММР-2, не содержащий слитый белок) и эффекты фрагмента ММР-2 GST-слитого белка.

Фигуры 26 и 27, обе иллюстрируют гистограмму индекса ангиогенеза (измерение точек ветвления) действия куриного ММР-2 (410-637) GST-слитого белка (помеченного СТММР-2) против контроля (RAP-GST или GST-RAP) на bFGF-обработанные CAMs, как описано в примере 7А3). Индекс ангиогенеза отложен на оси Y, а отдельные обработки - на оси X.

Фигура 28 показывает действие пептидов и органических соединений на ангиогенез, индуцированный bFGF, по измерению действия на точки ветвления, отложенные на оси Y, и различные обработки, отложенные на оси X, в том числе только bFGF и bFGF, обработанные CAMs пептидами 69601 или 66203 и органическими соединениями 96112, 96113 и 96229, как описано в примерах 7В и 14.

Фигура 29 графически показывает дозовый ответ пептида 85189 на ингибирование ангиогенеза, индуцированного bFGF, как описано дополнительно в примере 7В2), где число точек ветвления отложено на оси Y, а количество пептида, введенного в эмбрион, - на оси X.

Фигура 30 показывает ингибирующую активность пептидов 66203 (помеченный 203) и 85189 (помеченный 189) на ангиогенез, индуцированный bFGF, в САМ-анализе, как описано в примере 7В2). Контроли не включают пептида в bFGF-обработанных CAMS и пептида 69601 (помеченный 601). Данные представлены графически, как описано в пояснении к фигуре 27.

Фигуры 31A-L показывают эффект разных обработок против необработанных САМ-препаратов во времени, начиная от 24 ч и заканчивая 72 ч, как дополнительно описано в примере 7В3). Фотографии необработанных классов, помеченные bFGF, bFGF + MAID (bFGF-обработанные с последующим воздействием куриного ММР-2 (2-4) GST слитым белком) и соответственно bFGF + контроль (bFGF-обработка с последующим воздействием с ММР-2 (10-1), показаны на фигурах 31А-С, 31D-F, 31G-I и 31J-L.

Фигуры 32, 33 и 34 показывают соответственно снижение веса опухоли для UCLAP-3, M21-L и FgM-опухолей после внутривенного воздействия контрольного пептида 69601 и антагониста 85189, как описано дополнительно в примере 9А. Эти данные представлены графически для веса опухоли на оси Y, а пептидные обработки - на оси X.

Фигура 35 иллюстрирует эффект пептидов и антител на рост меланомной опухоли в химерной модели мышь: человек, что описано, кроме того, в примере 11В. Испытываемые пептиды включают контроль 69601 (помеченный 601) и антагонист 85189 (помеченный 189). Испытываемым антителом являлось LM609. Объем опухоли в мм³ откладывали на оси Y, а разные обработки - на оси X.

Фигуры 36А и В показывают соответственно эффект антагониста 85189 (помеченный 189) в сравнении с контрольным пептидом 69601 (помеченный 601), на уменьшение объема и сырого веса М21L-опухолей в диапазоне от 10, 50 и 250 мкг/инъекцию, как дополнительно описано в примере 11С.

Фигуры 37А и 37В показывают эффективности пептида-антагониста 85189 (обозначенный 189 и представленный непрерывной линией с зачерненными кружками) и контрольного пептида 69601 (обозначенный 601, и представленный линией точек и чистыми квадратами) ингибирования объема опухоли M21L в модели мышь: человек при двух разных режимах обработки, как дополнительно описано в примере 11С. Объем опухоли в мм³ откладывали на оси Y, а дни - на оси X.

Фигуры 38-42 схематически иллюстрируют разные химические синтезы органической молекулы _v3-антагонистов, как дополнительно описано в примере 13.

Фигуры 43 и 44 показывают эффекты разных органических молекул на ангиогенез, индуцированный bFGF, в САМ-анализе, как описано дополнительно в примере 14. Точки ветвления откладывали на оси Y, а разные соединения, используемые при 250 мкг/мл, - на оси X на фигуре 43, и при 100 мкг/мл - на фигуре 44.

Подробное описание настоящего изобретения А. Определения Аминокислотный остаток: аминокислота, полученная при химическом расщеплении (гидролизе) полипептида по его пептидным связям. Аминокислотные остатки, описанные здесь, представлены предпочтительно в "L"-изомерной форме. Однако остатки в "D"-изомерной форме могут замещать любой L-аминокислотный остаток, пока нужное функциональное свойство сохраняется данным полипептидом. NH₂ относится к свободной аминогруппе, представленной на N-конце полипептида. СООН относится к свободной карбоксигруппе, представленной на С-конце полипептида. В соответствии со стандартной номенклатурой полипептидов (описанной в J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) и принятой в 37 CFR 1.822(b) (2)), аббревиатура аминокислотных остатков показана в Таблице Соответствия (см. в конце описания).

Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков представлены здесь формулами, чьи левая и правая ориентация находятся в