Способы и композиции, используемые для ингибирования v 5-опосредованного ангиогенеза

Способы и композиции, используемые для ингибирования v 5-опосредованного ангиогенеза

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к способу ингибирования ангиогенеза в тканях с использованием антагонистов витронектина _v5. _v5-Опосредованный ангиогенез коррелирует с действием цитокинов, включая эндотелиальный фактор роста, трансформирующий фактор роста- и эпидермальный фактор роста. Ингибирование _v5-опосредованного ангиогенеза особенно предпочтительно при эндотелиальных глазных болезнях с реваскуляризацией, при опухолевом росте и при воспалительных заболеваниях, где указанное ингибирование осуществляют с использованием терапевтических композиций, содержащих антагонисты интегрина _v5. Изобретение позволяет использовать композиции для лечения заболеваний, связанных с ангиогенезом. 5 с. и 31 з.п.ф-лы, 21 ил., 2 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к области медицины, более конкретно к способам и композициям для ингибирования _v5 -опосредованного ангиогенеза тканей с использованием антагонистов рецептора _v5 витронектина.

Уровень техники Интегрины представляют собой класс клеточных рецепторов, которые, как известно, связываются с белками внеклеточного матрикса и тем самым опосредуют взаимодействие между клетками и между клеткой и внеклеточным матриксом, которое обычно называют событиями клеточной адгезии. Несмотря на то, что многие интегрины и их соответствующие лиганды описаны в литературе, биологическая функция многих интегринов остается невыясненной. Интегриновые рецепторы представляют собой семейство белков, которые имеют общие структурные характеристики нековалентных гетеродимерных гликопротеиновых комплексов, образованных - и -субъединицами.

В настоящее время известно, что рецептор витронектина, названный так благодаря присущей ему способности к преимущественному связыванию с витронектином, относится к классу, состоящему из трех различных интегринов, обозначаемых _v1, _v3 и _v5. Horton, Int. J. Exp. Pathol. , 71:741-759 (1990). _v1 связывается с фибронектином и витронектином, _v3 связывается с лигандами широкого ряда, включая фибрин, фибриноген, ламинин, тромбоспондин, витронектин, фактор фон Виллебранда, остеоспонтин, и костный сиалопротеин I. _v5 связывается с витронектином. Конкретная клеточно-адгезивная роль, которую эти три интегрина играют во многих клеточных взаимодействиях в тканях, пока еще исследуется. Однако очевидно, что существуют различные биологические функции, а также существуют различные интегрины и субъединицы, имеющие одинаковые биологические специфичности.

Одним из важных сайтов, которые интегрины распознают в лигандах, является трипептидная последовательность, аргинин - глицин - аспарагиновая кислота (RGD). RGD присутствует во всех лигандах, идентифицированных выше для интегриновых рецепторов витронектина. Этот сайт распознавания RGD может имитироваться полипептидами ("пептидами"), которые содержат последовательность RGD, и такие RGD-пептиды являются известными ингибиторами функции интегрина. Однако важно отметить, что в зависимости от последовательности и структуры RGD-пептида специфичность ингибирования конкретных интегринов-мишеней может быть изменена.

Обсуждение сайта распознавания RGD можно найти в работах Pierschbacher et al. , Nature, 309:30-33 (1984), Pierschbacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:5985-5988 (1984). Различные RGD-полипептиды с различной специфичностью по отношению к интегрину были также описаны Grant et al., Cell, 58: 933-943 (1989), Cheresh et al., Cell., 58:945-953 (1989), Aumailley et al. , FEBS Letts. , 291: 50-54 (1991), и Pfaff et al., J.Biol.Chem., 269: 20233-20238 (1994), и в патентах США 4517686, 4589881, 4578079, 4614517, 4661111, 4792525, 4683291, 4879237, 4988621, 5041380 и 5061693.

Ангиогенез также называют реваскуляризацией, то есть процессом васкуляризации тканей, который заключается в образовании новых развивающихся кровеносных сосудов в ткани. Этот процесс опосредуется инфильтрацией эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц. Очевидно, этот процесс протекает в соответствии с одним из следующих механизмов: 1) сосуды могут разрастаться из уже существующих сосудов; 2) образование новых сосудов может быть вызвано клетками-предшественниками (сосудогенез); или 3) существующие мелкие сосуды могут увеличиваться в диаметре. Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032: 89-118 (1990). Известно, что эндотелиальные клетки сосудов содержат, по крайней мере, пять RGD-зависимых интегринов, включая рецептор витронектина (_v3 или _v5), рецептор коллагена Типов I и IV (₁₁), рецептор ламинина (₂₁), рецептор фибронектина/ламинина/коллагена (₃₁), и рецептор фибронектина (₅₁). Davis et al., J.Cell.Biochem., 51:206-218 (1993). Известно, что мышечные клетки желудка содержат, по крайней мере, шесть RGD-зависимых интегринов, включая ₅₁, _v3 и _v5. Ангиогенез является важным процессом при неонатальном росте, но он также играет важную роль в заживлении ран и в патогенезе широкого ряда клинически серьезных болезней, включая воспаление тканей, артрит, псориаз, рак, диабетическая ретинопатия, дегенерация желтого пятна, и другие реваскулярные заболевания глаз. Эти ассоциированные с ангиогенезом клинические состояния называются ангиогенными заболеваниями. Folkman et al., Science, 235:442-447 (1987). Ангиогенез, в основном, отсутствует в тканях взрослого индивидуума или в зрелых тканях, хотя он наблюдается при заживлении ран и в цикле роста желтого тела. См. например, Moses et al., Science, 248: 1408-1410 (1990).

Ингибирование клеточной адгезии in vitro с использованием моноклональных антител, обладающих иммуноспецифичностью для различных - или -субъединиц интегрина, основано на участии рецептора _v3 витронектина в клеточной адгезии ряда типов клеток, включая эндотелиальные клетки микрососудов. Davis et al., J.Cell.Biol., 51:206-218 (1993). Кроме того, в работе Nicosia et al. , Am. J. Pathol., 138:829-833 (1991) было описано использование RGD-пептида, GRGDS, для ингибирования in vitro-образования "микрососудов" из крысиной аорты, культивированной в коллагеновом геле.

Однако ингибирование образования "микрососудов" in vitro в культуре коллагенового геля не является моделью для ингибирования ангиогенеза в тканях, поскольку эта модель не указывает на то, что микрососудистые структуры являются аналогичными капиллярными разрастаниям или что образование микрососудов в культуре коллагенового геля является аналогичным росту новых сосудов в интактных тканях, таких как артритная ткань, опухолевая ткань или патологическая ткань, в которой было бы желательным ингибировать ангиогенез.

Роль _v3 в ангиогенезе была недавно подтверждена. См. Brooks et al., Science, 264-571 (1994). Было показано, что интегрин экспрессируется на кровеносных сосудах в гранулированной ткани раны человека, но не экспрессируется в нормальной коже. Моноклональные антитела против рецептора _v5 ингибировали ангиогенез, индуцированный факторами роста (цитокинами), основным фактором роста фибробластов (bFGF) и фактором- некроза опухоли (TNF-), а также фрагментами меланомы. Однако антагонисты ингибируют лишь вновь образованные сосуды и не ингибируют уже сформировавшиеся сосуды. Кроме того, было также показано, что специфические линейные и циклические RGD-содержащие пептиды ингибируют реваскуляризацию.

Было высказано предположение, что ингибирование ангиогенеза может быть использовано в терапии для ограничения роста опухолей. Было предположено, что ингибирование ангиогенеза может быть осуществлено (1) путем ингибирования высвобождения "ангиогенных молекул", таких как как bFGF (основный фактор роста фибробластов); (2) путем нейтрализации ангиогенных молекул, например, с использованием антител против bFGF; и (3) путем ингибирования ответа эндотелиальных клеток на ангиогенные стимуляторы. Этот последний способ заслуживает особого внимания и был описан в работе Folcman et al., Cancer Biology, 3: 89-96 (1992), где было указано несколько ингибиторов клеточно-эндотелиального ответа, включая ингибитор коллагеназы, ингибиторы базально-мембранного метаболизма, ангиостатические стероиды, грибковые ингибиторы ангиогенеза, тромбоцитарный фактор 4, тромбоспондин, лекарственные средства против артрита, такие как D-пеницилламин и тиомалат золота, аналоги витамина D₃, альфа-интерферон, и т.п., которые могут быть использованы для ингибирования ангиогенеза. Кроме того, были предложены и другие ингибиторы ангиогенеза, см. Blood et al., Bioch.Biophys.Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et al. , Science, 248: 1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest, 59:44-51 (1988), и патенты США 5092885, 5112946, 5192744 и 5202352.

Однако до появления настоящего изобретения не было высказано каких-либо предположений о роли интегрина _v5 в ангиогенезе и не было подтверждено, что какие-либо ингибиторы ангиогенеза, описанные в предшествующих работах, направлены на ингибирование _v5. Кроме того, помимо настоящего изобретения не было работ, в которых было бы описано участие интегрина _v5 в реваскуляризации, а в частности реваскуляризации, индуцированной факторами роста, сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), трансформирующим фактором роста- (TGF-), и эпидермальным фактором роста (EGF).

Хотя число факторов роста, участвующих в регулировании ангиогенеза, является ограниченным, однако для конверсии состояния покоя в состояние реваскуляризации существуют различные уровни регуляции. См., D'Amore, Investigative Ophthal, Visual Sci., 35:3974-3979 (1994). Некоторые из факторов роста, которые участвуют в ангиогенезе, регулируются на уровне синтеза, а другие регулируются в состоянии активации. Эти клеточные события происходят в том случае, когда сосуды, находящиеся в состоянии покоя, подвергаются реваскуляризации после ранения или ишемии.

В частности, VEGF является, очевидно, главным медиатором ангиогенеза в первичной опухоли и при ишемических заболеваниях глаз. См. обзор Folkman, Nature Medicine, 1:27-31 (1995). VEGF представляет собой гомодимер в 46 килодальтон (кДа), который является специфичным для эндотелиальных клеток ангиогенным (Ferrara et al., Endocrin Rev., 13:18-32 (1992)), и сосудопроницаемым фактором (Senger et al., Cancer Res., 46:5629-5632 (1986), который связывается с высокоаффинными мембраноассоциированными рецепторами с тирозинкиназной активностью (Jakeman et al., J.Clin Invest., 89-244-253 (1992)).

Недавно было показано, что активация тирозинкиназного рецептора стимулирует интегринзависимую миграцию клеток к белкам внеклеточного матрикса. В частности, Klemke et al., J.Cell.Biol., 127:859-866 (1994) считают, что EGF-рецептор (EGFR) тирозинкиназы участвует в стимуляции клеточной подвижности, но не участвует в адгезии клеток карциномы поджелудочной железы человека FG к витронектину с использованием интегрина _v5. Эти авторы непосредственно показали, что "захват" EGFR лиганда EGF стимулирует активацию EGFR тирозинкиназы, которая, в конечном счете, стимулирует РКС (протеинкиназа С)-зависимый метаболизм, приводящий к индуцированию _v5-зависимой клеточной миграции витронектинового субстрата, на который клетки обычно не способны мигрировать. Таким образом, исследования Klemke и др. свидетельствуют о корреляции присутствия цитокинов, в частности EGF, с интегринзависимой активностью миграции клеток. Было показано, что активация РКС приводит к регуляции ангиогенеза в системе модели хориоаллантоисной мембраны цыпленка. См. Tsopanoglou et al., J. Vasc. Res., 30:202-208 (1993). Эти авторы идентифицировали специфические активаторы и ингибиторы РКС, которые соответственно стимулируют и ингибируют ангиогенез в экспериментальной системе.

Однако ни у Klemke и др., ни у Tsopanoglou и др. не обсуждается роль цитокинов и экспрессии и/или активации интегрина _v5 в стимуляции ангиогенеза в различных условиях и при различных патологиях, а также их ингибирование _v5-специфическими антагонистами.

Недавно, в системе обезьяньей модели заболевания глаз было экспериментально показано, что ишемия сетчатки, индуцированная окклюзией вены сетчатки глаза, приводит к продуцированию VEGF в камере глазного яблока. Эти данные совпадают с реваскуляризацией радужной оболочки глаза, которая наблюдалась и описана Miller et al., Am. J. Path. 145:574-584 (1994). Кроме того, с использованием мышиной экспериментальной модели пролиферативной ретинопатии, в которой была индуцирована гипоксия, были получены данные, свидетельствующие о том, что уровень матричной РНК VEGF возрастает в течение 6-12 часов относительной гипоксии и остается повышенным вплоть до образования новых сосудов. По мере замедления процесса образования новых сосудов экспрессируется VEGF, Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:905-909 (1995).

Таким образом, недавно полученные данные, продемонстрированные на экспериментальных моделях ишемии, показали, что индуцирование VEGF коррелирует с ишемией и последующей реваскуляризацией. VEGF и другие факторы роста также участвуют в других состояниях и патологиях с образованием новых сосудов, как описано в обзоре Folkman, Nature Medicine, 1:27-31 (1995).

В работах Folkman и др. также систематизированы современные клинические методы, используемые для регуляции нежелательного ангиогенеза. Пациентам, участвующим в клинических испытаниях, проводили лечение ангиогенными ингибиторами, включая тромбоцитарный фактор 4, фумагиллиновое производное, карбокси-аминотриазол, и т.п. Однако ни в этих работах, ни в современной литературе по терапии нет каких-либо указаний на корреляцию экспрессии _v5 ангиогенезом и, в частности, указаний на то, что этот ангиогенез индуцируется VEGF. Таким образом, до появления настоящего изобретения ни в одной работе не было описано применение терапевтической схемы лечения с использованием антагонистов _v5 для регуляции ангиогенеза в тканях, подвергающихся ангиогенезу, который коррелирует с присутствием и активацией _v5. Поэтому помимо исследований, упоминаемых в настоящем описании и касающихся _v5 и связи факторов роста с ангиогенезом, авторам настоящей заявки не известны какие-либо другие доказательства того, что ангиогенез в тканях может быть ингибирован с использованием ингибиторов _v5-опосредованной клеточной адгезии. В частности, нигде ранее не было продемонстрировано, что функция _v5 необходима для ангиогенеза в тканях или что антигонисты _v5 могут ингибировать ангиогенез в тканях, в частности, при заболеваниях глаз с реваскуляризацией.

Сущность изобретения В настоящем изобретении было продемонстрировано, что помимо механизма _v5-опосредованного ангиогенеза в тканях существует также и другой новый зависимый механизм ангиогенеза. Таким образом, в настоящем изобретении описаны ингибиторы интегрина _v5, которые могут ингибировать ангиогенез. Кроме того, в настоящем изобретении показано, что _v5-опосредованная активность в стимулировании ангиогенеза коррелирует с активацией фактором роста (цитокином) рецепторов фактора роста тирозинкиназ и протеинкиназы С (РКС). Факторами роста (цитокинами), которые действуют подобным образом, являются эндотелиальный фактор роста (VEGF), трансформирующий фактор роста- (TGF-), эпидермальный фактор роста (EGF) и т.п.

В настоящем изобретении описаны способы ингибирования ангиогенеза в тканях, предусматривающие введение в эту ткань композиции, содержащей ангиогенез-ингибирующее количество антагониста интегрина _v5. Тканью, подвергающейся лечению, может быть любая ткань, в которой желательно ингибировать ангиогенез, такая как патологическая ткань, где происходит образование новых сосудов. Примерами такой ткани являются глазная ткань, подвергаемая реваскуляризации; воспалительная ткань; твердые опухоли; метастазы; ткани, подвергающиеся рестенозу, и т.п. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения образование новых сосудов ассоциируемое с экспрессией _v5, является результатом воздействия факторов роста, VEGF, TGF- и EGF.

Особенно предпочтительными являются терапевтические способы, направленные на ингибирование VEGF-индуцированной васкуляризации в тканях, таких как ткани глаз, где ангиогенез особенно явно выражен при их заболевании, включая такие заболевания, как диабетическая ретинопатия (также называемая пролиферативной диабетической ретинопатией), возрастная дегенерация желтого пятна, предполагаемый гистоплазмоз глаз, ретинопатия при преждевременном развитии, серповидноклеточная ретинопатия и реваскулярная глаукома. В других предпочтительных вариантах терапевтические способы направлены на ингибирование ангиогенеза, который происходит при реваскулярных нарушениях роговицы, таких как трансплантация роговицы, герпетический кератит, сифилитический кератит, птеригий, неоваскулярный паннус (поверхностный диффузный кератит), ассоциированный с использованием контактных линз, и т.п.

Антагонист интегрина _v5, предназначенный для использования в целях настоящего изобретения, обладает способностью ингибировать связывание с _v5 и конкурентно ингибировать способность _v5 связываться с природным витронектиновым лигандом. Предпочтительно, чтобы этот антагонист обладал специфичностью к _v5, а не к другим интегринам. В конкретном предпочтительном варианте антагонист _v5 ингибирует связывание витронектина или других RGD-содержащих лигандов с _v5, но в основном не ингибирует связывание витронектина с _v5 или _11b3. Предпочтительным антагонистом _v5 может быть гибридный полипептид, линейный или циклический полипептид, дериватизированный полипептид, моноклональное антитело или его фрагменты, или неорганическая молекула, которая имитирует _v5-лиганд, и которую часто называют органическим миметиком, где все указанные антагонисты специфически взаимодействуют с _v5. Введение антагонистов _v5 настоящего изобретения может быть внутриглазным, внутривенным, чрескожным, внутрисуставным, внутримышечным и пероральным. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, такое введение координируют с химиотерапевтической схемой введения для подавления образования опухолей и метастазов рака.

Краткое описание фигур Фигуры являются частью настоящего описания.

Фиг.1A-1D иллюстрируют ингибирование цитокин-индуцированного ангиогенеза в роговице глаза кролика антителами-антагонистами интегрина _v. Индуцирование ангиогенеза путем обработки либо bFGF, либо VEGF и эффекты их обработки антителами-антагонистами интегрина _v, PIF6 (_v5) и LM609 (_v5), описаны в примере 4. OD и OS соответствуют правому и левому глазу лабораторного кролика. Большие стрелки указывают на ангиогенез роговицы с отеком, а маленькие стрелки указывают на нормальные сосуды лимба конъюнктивы. На фиг.1А и 1В проиллюстрировано bFGF-индуцирование ангиогенеза, а на фиг.1С и 1D показано VEGF-индуцирование ангиогенеза. На фиг.1А и 1С показаны роговицы кролика, обработанные антителом PIG6, а на фиг.1В и 1D показаны роговицы кролика, обработанные антителом LM609.

На фиг. 2А и 2В изображены гистограммы, иллюстрирующие среднюю площадь реваскуляризации в мм² стандартная ошибка (n=8 для каждой из двух серий) после индуцирования соответственно либо bFGF, либо VEGF с последующей обработкой моноклональным антителом (mAb) либо P1F6, либо LM609. Результаты обсуждаются в примере 4.

На фиг.3А и 3В приведены гистограммы, иллюстрирующие количественные результаты. Гистограммы иллюстрируют график индекса ангиогенеза (по оси Y) в зависимости от контроля и обработки антителом. Фиг. 3А и 3В соответственно иллюстрируют bFGF- и VEGF-индуцированный ангиогенез. Результаты обсуждаются в примере 4.

На фиг.4А и 4В приведены гистограммы, иллюстрирующие количественные результаты, показанные на фиг.3A-3F. На приведенных гистограммах индекс ангиогенеза отложен по оси Y в зависимости от контроля и обработки антителом. Фиг. 4А и 4В соответственно иллюстрируют bFGF- и VEGF-индуцированный ангиогенез. Результаты обсуждаются в примере 6.

На фиг.5А-5Е проиллюстрировано влияние моноклональных антител против интегрина и влияние кальфостина С на САМ-ангиогенез, индуцированный отдельно цитокинами bFGF, VEGF и TGF-. Была также проведена оценка РМА. Анализы и результаты обсуждаются в примере 6. Результаты показаны в виде гистограммы, где на оси Y отложен индекс ангиогенеза, а на оси Х контроль или различные ингибиторы. На фиг.5А-5Е соответственно проиллюстрирован ангиогенез, индуцированный bFGF, TNF-, VEGF, TGF- и РМА.

На фиг. 6 приведена гистограмма, иллюстрирующая влияние обработки антителом на рост меланомы CS1 в САМ куриного эмбриона, анализ которого осуществляли, как описано в примере 5С и 6D. На этой гистограмме по оси Y отложена масса опухолей в миллиграммах (мг) в зависимости от различных обработок, отложенных по оси X. CSAT - контрольное антитело, направленное против ₁-субъединицы интегрина. LM609 и P1F6 были описаны выше.

На фиг. 7 приводится гистограмма, иллюстрирующая влияние контроля по сравнению с влиянием пептида-антагониста интегрина _v5, меченого пептида 189 (SEQ ID No: 9), на опухолевый рост меланомы, измеренный в виде объема опухоли в мм³ (по оси Y). Анализ и результаты описаны в примере 8.

На фиг. 8 проиллюстрирован синтез Соединения 7, описанный в примере 10A-G.

На фиг. 9 проиллюстрирован синтез Соединения 9, описанный в примере 10А-С; Н-1.

На фиг. 10 проиллюстрирован синтез Соединения 10, описанный в примере 10J.

На фиг.11 проиллюстрирован синтез Соединений 12 и 14, описанный в примерах 10K-L и 10M-N соответственно.

На фиг. 12 показаны химические структуры Соединения 15, Соединения 16, Соединения 17, и Соединения 18. Синтез этих соединений подробно описан в примере 100-R.

На фиг. 13А и 13В показана линейная кДНК-последовательность куриного ММР-2 вместе с выведенной аминокислотной последовательностью, показанной во второй строке. На третьей и четвертой строках соответственно показана выведенная аминокислотная последовательность ММР-2 человека и цыпленка, описанная в примере 7. кДНК-последовательность цыпленка представлена в SEQ ID No:23 вместе с кодированной аминокислотной последовательностью, которая также представлена отдельно в SEQ 1D No:24. Номер первого нуклеотида 5'-нетранслируемой области и области, кодирующей профермент, обозначен на фиг.13А отрицательным числом, а в Списке последовательностей, он обозначен числом 1, в результате чего кажется, что эта последняя последовательность длиннее, чем на фигуре, однако нуклеотидная последовательность, изображенная на фигуре, по своей длине идентична последовательности, представленной в Списке последовательностей, и отличается от нее только нумерацией. В соответствии с этим ссылки на положения нуклеотидов куриной последовательности или на последовательность ММР-2 в данном описании, например, на праймеры, используемые при амплификации фрагментов ММР-2, относятся к положениям нуклеотидов, указанных на фигуре, а не в Списке последовательностей.

На фиг. 14 показана последовательность аминокислотных остатков зрелого белка ММР-2, имеющего 631 остаток. Положения аминокислотных остатков фрагментов, происходящих от ММР-2 человека, соответствуют положениям, указанным на фиг. Последовательность аминокислотных остатков представлена в SEQ 1D N 25.

На фиг.15 показано влияние пептидов 85189 и инертной соли аналога 121974 на VEGF-индуцированный ангиогенез в СДМ-модели, описанной в примере 6А. Это влияние сравнивали с необработанными (отмеченными как NT) препаратами и препаратами, обработанными контрольным (отмеченным 69601) пептидом. Влияние на ангиогенез определяли путем измерения числа точек ветвления, как описано в примере 6А.

На фиг.16, 17 и 18 соответственно показано уменьшение массы опухоли для опухолей UCLAP-3, M21-L и FgM после внутривенного введения контрольного пептида 69601 и антагониста, как описано ниже в примере 6D. Данные выражали в виде кривой зависимости массы опухоли (ось Y) от обработок пептидом (ось X).

На фиг.19 проиллюстрировано воздействие пептидов и антител на опухолевый рост меланомы в химерной модели "мышь-человек", как описано ниже в примере 8. Была также проведена оценка контрольного пептида 69601 (отмечен 601) и антагониста 85189 (отмечен 189). Тестируемым антителом было антитело LM609. Объем опухоли в мм³ (ось Y) определяли в зависимости от различных обработок (ось X).

На фиг. 20А и 20В соответственно показано влияние антагониста 85189 (отмечен 189) по сравнению с контрольным пептидом (отмечен 601) на уменьшение объема и сырой массы опухоли M21-L в зависимости от интервала доз 10, 50 и 250 мкг на инъекцию, как описано ниже в примере 8.

На фиг. 21А и 21В показана эффективность пептида-антагониста 85189 (отмечен 189, сплошная линия и заштрихованные кружки), по сравнению с контрольным пептидом 69601 (отмечен 601, пунктирная линия и незаштрихованные квадраты) в уменьшении объема опухоли M21-L в модели "мышь-человек" при двух различных режимах обработки, как описано в примере 8. Была построена кривая зависимости объемов опухоли в мм³ (ось Y) от времени в днях (ось X).

Сведения, подтверждающие осуществимость изобретения А. Определения Аминокислотный остаток - аминокислота, образованная в результате химического расщепления (гидролиза) полипептида по его пептидным связям. Аминокислотными остатками, описанными в настоящей заявке, являются предпочтительно "L" изомерные формы. Однако любой L-аминокислотный остаток может быть заменен на остаток изомерной формы "D" при условии, что при этом будут сохранены нужные функциональные свойства полипептида.

NH₂ означает свободную группу, присутствующую на амино-конце полипептида. В соответствии со стандартной номенклатурой полипептидов (описанной в J. Biol. Chem. , 243:3552-59 (1969) и принятой в $. 822(b)(2) статьи 37 CFR) в таблице A приводятся сокращения, принятые для обозначения аминокислотных остатков.

Кроме того, ниже приведены следующие обозначения: ВОС - Трет-бутилоксикарбонил DCCl - Дициклогексилкарбодиимид DMF - Диметилформамид Оме - Метокси HOBt - 1-Гидроксибензотриазол Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков представлены формулами, где левая и правая ориентация имеет общепринятое направление от амино-конца к карбокси-концу. Кроме того, следует отметить, что черточка в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков указывает на пептидную связь с другой последовательностью в одном или нескольких аминокислотных остатках.

Полипептид - линейная последовательность аминокислотных остатков, связанных друг с другом посредством пептидной связи между альфа-аминогруппой и карбоксигруппой смежных аминокислотных остатков.

Пептид - линейная последовательность из не более чем около 50 аминокислотных остатков, связанных друг с другом так же, как и в полипептиде.

Циклический пептид означает соединение, имеющее гетероатомную кольцевую структуру, которая содержит несколько амидных связей, как и в обычном пептиде. Циклический пептид может быть цивилизованным линейным полипептидом "голова к хвосту", в котором N-конец линейного пептида связан амидной связью с концевым карбоксилом линейного пептида, либо он может содержать кольцевую структуру, в котором полимер является гомогенным или гетерогенным, и содержит амидные связи и/или другие связи для замыкания кольца, такие как дисульфидные мостики, сложные тиоэфиры, тиоамиды, гуанидиногруппы, и другие подобные связи.

Белок - линейная последовательность из более чем 50 аминокислотных остатков, связанных друг с другом так же, как и в полипептиде.

Гибридный белок - полипептид, содержащий, по крайней мере, два различных полипептидных домена, правильно сшитых посредством обычной пептидной связи ("слитые"), где два домена соответствуют пептидам, не являющимся слитыми по природе.

Синтетический пептид - полученная химическим способом цепь аминокислотных остатков, правильно сшитых посредством пептидных связей, где указанная цепь не содержит природных белков и их фрагментов.

В. Общие положения Настоящее изобретение относится к открытию того факта, что ангиогенез опосредуется специфическим рецептором _v5 винтронектина и что ингибированные функции _v5 приводит к ингибированию ангиогенеза. Это открытие имеет важное значение из-за роли, которую играет ангиогенез в различных патологических процессах. Путем ингибирования ангиогенеза можно воздействовать на заболевание, ослабить его симптомы, а в некоторых случаях вылечить заболевание. В случае если рост новых сосудов является причиной патологии или вносит вклад в патологию, ассоциированную с заболеванием, то ингибирование ангиогенеза будет способствовать ослаблению неблагоприятных последствий данного заболевания. Примерами таких заболеваний являются ревматоидный артрит, диабетическая ретинопатия, воспалительные заболевания, рестеноз и т.п. В том случае, когда рост новых кровеносных сосудов требуется для поддержания роста нежелательной ткани, то ингибирование ангиогенеза будет способствовать снижению кровоснабжения тканей и тем самым способствовать снижению массы ткани, требующей соответствующего кровоснабжения. В качестве примера может служить рост новых кровеносных сосудов в ответ на ишемию, который приводит к индуцированному факторами роста ангиогенезу, росту опухолей, где реваскуляризация является постоянным и необходимым условием для поддержания роста опухоли после того, как ее толщина достигнет нескольких миллиметров, а также для возникновения метастазов твердых опухолей.

Способы настоящего изобретения являются эффективными отчасти потому, что эта терапия является в высокой степени избирательной в отношении ангиогенеза, но не в отношении других биологических процессов. Как показано в примерах, лишь вновь образованные сосуды содержат _v5, а поэтому данные терапевтические методы не оказывают неблагоприятного воздействия на зрелые сосуды.

Обнаружение того факта, что ингибирование лишь _v5 может эффективно подавлять ангиогенез, позволило разработать терапевтические композиции, которые будут обладать высокой специфичностью, а поэтому относительно низкой токсичностью. Хотя в настоящей заявке описано использование пептидных реагентов, которые способны ингибировать один или несколько интегринов, однако можно использовать и другие реагенты, которые будут более избирательно ингибировать _v5. Поэтому некоторые реагенты, полученные на основе пептидов, не обладают побочным действием, направленным на ингибирование других биологических процессов, кроме тех, которые опосредованы интегрином _v5. Так, например, как показано в описании настоящего изобретения, можно получить моноклональные антитела, которые будут в высокой степени избирательными в отношении иммунной реакции с _v5, а не с _v1,