Кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-n- [4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, способ ее получения (варианты) и фармацевтическая композиция

Кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-n- [4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, способ ее получения (варианты) и фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к новой кристаллической -форме кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида формулы I, которая предназначена для получения фармацевтической композиции для лечения или диагностики опухолевых заболеваний. Кристаллическая -форма указанной соли включает по меньшей мере 90 мас.% кристаллов, имеющих -модификацию, причем кристаллы, имеющие -модификацию, являются негигроскопичными и остаются практически безводными в стеклянной климатической камере при 25^oС и при относительной влажности до 93% включительно. Предпочтительно кристаллическая -форма включает по меньшей мере 95 или 99 мас.% кристаллов, имеющих -модификацию, которая остается безводной при относительной влажности 93% и при 25^oС. При этом кристаллическая -форма обычно включает по меньшей мере 99 мас. % кристаллов, имеющих -модификацию и температуру плавления ниже 225^oС, предпочтительно температуру плавления, определяемую как начало плавления на термограмме, полученной с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, 217^oС. Кристаллическая -форма отличается наличием на рентгенограмме, полученной рентгенодифракционным анализом, пика при угле преломления 2 = 20^o, при этом этот пик имеет относительную интенсивность линии, равную 65%, по сравнению с наиболее интенсивной линией на рентгенограмме. При этом обычно относительная интенсивность линий при следующих углах преломления 2 (относительные интенсивности линий в% даны в скобках): 9,7^o (40); 13,9^o (26); 14,7^o (23); 17,5^o (57); 18,2^o (90); 20,0^o (65); 20,6^o (76); 21,1^o (100); 22,1^o (89); 22,7^o (38); 23,8^o (44); 29,8^o (23) и 30,8^o (20), составляет 20% или более по сравнению с наиболее интенсивной линией на рентгенограмме. Способы получения кристаллов -модификации заключаются в том, что осуществляют разложение другой кристаллической формы кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I с помощью подходящего полярного растворителя в суспензии при 20 - 50^oС или растворяют другую кристаллическую форму или аморфный исходный продукт кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в полярном растворителе при приемлемой температуре, находящейся в диапазоне от 25^oС до температуры дефлегмации реакционной смеси, а затем инициируют кристаллизацию, добавляя небольшое количество кристаллов -модификации в качестве затравочного кристалла при 20 - 70^oС. 2 с. и 10 з.п.ф-лы, 1 табл., 3 ил.

Изобретение относится к кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида в форме, представляющей собой определенную кристаллическую форму, к способам ее получения, к фармацевтическим композициям, включающим эту кристаллическую форму, и к их применению в методах диагностики или предпочтительно для терапевтического лечения теплокровных животных, главным образом людей, или к их применению для изготовления фармацевтических препаратов, предназначенных для применения в методах диагностики или предпочтительно для терапевтического лечения теплокровных животных, главным образом людей.

Получение 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида и его применение главным образом в качестве противоопухолевого агента, описано в примере 21 заявки ЕР-А 0564409, опубликованной 6 октября 1993 г., и эквивалентных заявках во многих других странах. Это соединение приведено в этих заявках в качестве примера только в свободной форме (но не в форме соли).

При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что в определенных условиях может быть получена кристаллическая форма, которая представляет собой метансульфонат этого соединения и которая обозначена в настоящем описании как кристаллическая -форма и обладает очень ценными свойствами.

Ниже изобретение более подробно рассмотрено со ссылкой на прилагаемые чертежи и другие материалы.

На фиг.1 представлена рентгенограмма для кристаллической -формы кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I.

На фиг.2 представлена рентгенограмма для кристаллической -формы кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая является практически свободной от -формы в пределах указанного ограничения.

На фиг.3 показаны кристаллы кристаллической -формы (вверху) и кристаллической -формы (внизу) метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида (т.е. кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I).

На обеих рентгенограммах, полученных рентгенодифракционным анализом, на горизонтальной оси (ось х) отложен угол преломления 2, а на вертикальной оси (ось y) отложена относительная интенсивность линий (интенсивность пика, скорректированная с учетом фона). Рентгенограммы получают следующим путем: сначала картину дифракции рентгеновских лучей регистрируют на пленку с использованием камеры Guinier (модель Enraf-Nonius FR 552) и пленки Guinier 258-94с и с использованием медного радиоактивного источника (радиация К1, длина волны Оптическая плотность линий на пленке пропорциональна интенсивности света. Затем пленку сканируют с использованием сканера со строчной разверткой (типа LS 18, Johansson, , Щвеция) и с программным обеспечением SCANPI.

Как показано на фиг.2, линии, относительная интенсивность которых составляет 20 или более, соответствуют следующим углам преломления 2 (относительные интенсивности линий указаны в скобках): 9,7^o (40); 13,9^o (26); 14,7^o (23); 17,5^o (57); 18,2^o (90); 20,0^o (65); 20,6^o (76); 21,1^o (100); 22,1^o (89); 22,7^o (38); 23,8^o (44); 29,8^o (23) и 30,8^o (20). Из фиг.2 относительная интенсивность линии при 30,8^o кажется более высокой, чем относительная интенсивность линии при 29,8^o вследствие того, что она очень близко расположена к дополнительной линии при 31,0^o, имеющей относительную интенсивность линии 13.

Точки плавления определяют с помощью ДСК-термограммы, используя устройство типа Mettler-Toledo TA8000. ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) представляет собой метод динамической дифференциальной калориметрии. С помощью этого метода температура плавления как кристаллической -формы, так и кристаллической -формы может быть измерена путем нагревания образцов до тех пор, пока с помощью высокочувствительных датчиков не будет выявлена термическая, т.е. эндотермическая или экзотермическая, реакция. Указанные в настоящем описании температуры плавления определяют с помощью устройства типа Mettler-Toledo TA8000, при этом температуру плавления каждого образца массой примерно от 5,5 до 6,5 мг измеряют в алюминиевом тигле с перфорированной крышкой в находящемся в покое атмосферном воздухе при скорости нагревания 10 ^oC/мин (начиная с температуры 20^oС).

Для кристаллической -формы метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида характерны игольчатые кристаллы, и она является гигроскопичной. Кристаллы этой формы недостаточно хорошо пригодны для фармацевтических композиций в виде твердых дозируемых форм из-за их физических особенностей, например их характеристики текучести являются неудовлетворительными. Однако в определенных условиях возможно получение метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида в кристаллической форме, кристаллы которой не являются игольчатыми. Эта форма обозначена в настоящем описании как кристаллическая -форма.

Преимущество кристаллической -формы метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамида состоит в том, что ее характеристики текучести существенно более предпочтительны по сравнению с характеристиками кристаллической -формы. Еще одно преимущество этой кристаллической формы заключается в том, что она является термодинамически более стабильной при температурах ниже 140^oС. И, наконец, кристаллическая -форма является менее гигроскопичной в сравнении с кристаллической -формой и поэтому лучше хранится и более легко поддается обработке.

Изобретение относится к кислотно-аддитивной соли соединения формулы I, имеющей форму неигольчатых кристаллов, в частности к кристаллической -форме кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I.

В частности, изобретение относится к определенной практически чистой кристаллической форме, предпочтительно к форме, которая в настоящем описании обозначена как кристаллическая -форма, кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, т.е. к метансульфонату соединения формулы I Когда в настоящем описании используется понятие "метансульфонат соединения формулы I или 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида", то следует понимать, что имеется в виду метансульфонат формулы II В контексте настоящего описания понятие "практически чистый" обозначает, что по меньшей мере 90 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 95 мас.% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99 мас.% кристаллов кислотно-аддитивной соли соединения формулы I присутствуют в кристаллической форме по изобретению, главным образом в кристаллической -форме.

В контексте настоящего описания в выражении "кислотно-аддитивная соль формулы II имеет практически такую же рентгенограмму, которая указана на фиг. 2, понятие "практически" обозначает, что должны присутствовать по меньшей мере основные линии рентгенограммы, приведенной на фиг.2, т.е. те, у которых относительная интенсивность линий на 10%, особенно предпочтительно на 20%, выше по сравнению с наиболее интенсивной линией на рентгенограмме.

Изобретение также относится главным образом к тем формам кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, в которых кристаллы кристаллической формы по изобретению, главным образом кристаллической -формы, присутствуют в практически чистой форме вместе с другими кристаллическими формами и/или с аморфной формой метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида. Однако особенно предпочтительной является кислотно-аддитивная соль формулы II, которая присутствует в практически чистой кристаллической -форме.

Новая кристаллическая форма, главным образом кристаллическая -форма, обладает следующими свойствами.

Температура плавления, определенная с помощью ДСК-термограммы, кристаллической -формы составляет 217^oС, а кристаллической -формы составляет 226^oС (начало плавления).

На рентгенограмме кристаллической -формы отсутствует пик кристаллической -формы, обозначенный как (1), и только в очень незначительной степени проявляется пик, обозначенный как (3) (см. фиг.1 и 2). В отличие от этого на фиг. 2 виден новый дополнительный пик, обозначенный как (4). На фиг.2 также виден новый пик, обозначенный как (5).

На рентгенограммах также видны другие заметные отличия.

В предпочтительном варианте осуществления практически чистая кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в кристаллической -форме имеет рентгенограмму, приведенную на фиг.2.

(I) Предпочтительной является кристаллическая форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая не имеет пика, обозначенного как (1) на рентгенограмме, приведенной на фиг.1, и эта кристаллическая форма предпочтительно присутствует в виде практически чистой формы.

(II) Также предпочтительной является кристаллическая форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая остается безводной при относительной влажности 93% и при температуре 25^oС, и эта кристаллическая форма предпочтительно присутствует в виде практически чистой формы.

(III) Изобретение предпочтительно относится к кристаллической -форме кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая отличается наличием кристаллов, имеющих форму, приведенную ниже на фиг. 3, главным образом к кристаллической -форме в виде практически чистой формы.

(IV) Более предпочтительной является кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая имеет температуру плавления менее 225^oС, главным образом температуру плавления, составляющую от 217 до 225^oС.

(V) Также более предпочтительной является кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая имеет температуру плавления 217^oС, обозначенную как точка начала плавления на ДСК-термограмме.

(VI) Также более предпочтительной является кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, у которой на рентгенограмме имеется пик, обозначенный как (4) на фиг.2.

(VII) Также более предпочтительной является кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, у которой на рентгенограмме имеется пик, обозначенный как (5) на фиг.2.

(VIII) Еще более предпочтительной является кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая имеет рентгенограмму типа той, которая приведена на фиг.2, главным образом рентгенограмму, на которой относительные интенсивности пиков каждого пика не отклоняются более чем на 10% от относительных интенсивностей пиков на рентгенограмме, показанной на фиг. 2, главным образом рентгенограмму, идентичную таковой, показанной на фиг.2.

(IX) Наиболее предпочтительной является кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, для которой характерны два из свойств, описанных в разделах с (I) по (VIII), наиболее предпочтительны три из свойств, указанных в этих разделах, особенно предпочтительны все свойства и наиболее предпочтительны те свойства, которые определены как предпочтительные.

Таким образом, наиболее предпочтительной является кристаллическая форма, указанная в одном из разделов (I)-(IХ) в виде практически чистой формы.

Особенно предпочтительной формой является кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, получаемая по описанной в примерах методике.

Во всех случаях форму кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, включающую соответствующую описанную выше кристаллическую форму, также следует рассматривать как объект изобретения в широком смысле.

Кристаллическую -форму (предпочтительно практически чистую) получают путем а) разложения другой кристаллической формы, в частности кристаллической -формы, или аморфного исходного продукта кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I с помощью приемлемого полярного растворителя, предпочтительно спирта, особенно предпочтительно метанола, или также кетона (предпочтительно в смеси с водой, например в смеси вода/ацетон), как правило, ацетона, N,N-ди(низш.)алкил-(низш. )алканкарбоксамида, как правило, N,N-диметилформамида или -ацетамида, или гидрофильного простого эфира, как правило, диоксана, предпочтительно в присутствии некоторого количества воды, или их смесей, в суспензии при приемлемой температуре, предпочтительно при температуре от 20 до 50^oС, например при температуре примерно 25^oС, или б) растворения другой кристаллической формы, в частности кристаллической -формы, или аморфного исходного продукта кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I с помощью приемлемого полярного растворителя, предпочтительно такого как спирт, как правило, метанол или этанол, кетон (предпочтительно в смеси с водой, например с помощью смеси вода/ацетон), как правило, ацетона, N,N-ди(низш.)алкил-(низш. )алканкарбоксамида, как правило, N,N-диметилформамида или -ацетамида, или гидрофильного простого эфира, как правило, диоксана, или их смеси, предпочтительно в присутствии некоторого количества воды, при приемлемой температуре, прежде всего после нагревания растворителя или при нагревании во время процесса растворения, в обоих случаях предпочтительно до температуры в диапазоне от 25^oС до температуры дефлегмации реакционной смеси, а затем инициации кристаллизации путем добавления небольшого количества кристаллической -формы в качестве затравочного кристалла при приемлемой температуре, например при температуре от 0 до 70^oС, предпочтительно при температуре от 20 до 70^oС.

Выделенное вещество, т. е. кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, может быть получено, например, осаждением соли из раствора в растворителе, отличном от спирта, таком как метанол, и без добавления затравочного кристалла кристаллической -формы.

Вышеуказанные условия избирательного получения индивидуальных кристаллических форм не имеют решающего значения. Обычно можно, например, изменять такие параметры, как массовое соотношение кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в растворителе. Также можно изменять время, необходимое для получения кристаллической -формы, в частности, при одновременной регулировке температур.

Одним из основных преимуществ кристаллической -формы является ее более компактная кристаллическая форма, что приводит к существенно более благоприятным свойствам текучести и вследствие этого к более высокой технологичности кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в кристаллической -форме по сравнению с кристаллической -формой, например, при изготовлении фармацевтических композиций.

Следует отметить, что кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I является метастабильной при комнатной температуре. Однако кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I представляет собой при комнатной температуре термодинамически стабильную форму. Таким образом, можно ожидать большей стабильности этой формы.

И, наконец, кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I является менее гигроскопичной, чем ее кристаллическая -форма, что можно видеть из приведенной таблицы (см. в конце описания).

При оценке гигроскопичности кристаллических форм, которую проводили в стеклянной климатической камере при 25^oС и при приведенных в таблице уровнях влажности, определяя точку, при которой достигается равновесие (не происходит дальнейшая адсорбция), были обнаружены следующие уровни содержания воды (конечное содержание воды в % в пересчете на массу сухого продукта) (см. таблицу).

Видно, что при 25^oС кристаллическая -форма является гигроскопичной и быстро впитывает воду, в результате чего при относительной влажности 93% образец в определенной степени присутствует в аморфной форме, в то время как кристаллическая -форма в этих условиях остается безводной. Обе кристаллические формы разжижаются при относительной влажности 97%, но это происходит существенно быстрее с кристаллической -формой, чем с кристаллической -формой.

Более низкая гигроскопичность является дополнительным преимуществом при обработке и хранении кислотно-аддитивной соли в кристаллической -форме.

Кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которую предпочтительно применяют в кристаллической -форме (далее в контексте настоящего описания под кислотно-аддитивной солью метансульфоновой кислоты всегда понимают кристаллическую -форму), а также 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамид в свободной форме обладают ценными фармакологическими свойствами и могут, например, применяться в качестве противоопухолевого агента, агента для лечения атеросклероза, агента для лечения рестеноза, для предупреждения связанных с трансплантацией нарушений, таких как облитеративный бронхолитиаз, и/или для предупреждения заражения клеток теплокровных животных определенными бактериями, такими как Porphyromonas gingivalis.

Уже давно известно, что фосфорилирование протеинов является основной стадией в дифференцировании и делении клеток. Фосфорилирование катализируется протеинкиназами, которые подразделяются на серин/треонин- и тирозинкиназы. Тирозинкиназы включают тирозинкиназный рецептор PDGF (тромбоцитарный фактор роста).

PDGF (тромбоцитарный фактор роста) представляет собой очень широко распространенный фактор роста, который играет важную роль как в обеспечении нормального роста клеток, так и в патологической пролиферации клеток, которая выявлена при канцерогенезе и при заболеваниях клеток гладкой мускулатуры кровеносных сосудов, например при атеросклерозе и тромбозе.

Ингибирование активности стимулируемого PDGF тирозинкиназного рецептора in vitro оценивают в отношении иммунных комплексов рецептора PDGF на 3Т3-клетках мышей линии BALB/c согласно методу, описанному Е. Andrejauskas-Buchdunger и U. Regenass в Cancer Research, 52, 5353-5358 (1992). Описанное ранее более подробно соединение формулы I и главным образом его кристаллическая -форма ингибируют фосфорилирование зависящего от PDGF внеклеточного рецептора. Ингибирование тирозинкиназного рецептора PDGF оценивают с помощью микротитрационного метода ELISA (ср. Trinks и др. , J. Med. Chem., 37, 1015-1027 (1994)). 4-(4-Метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамид и соответствующий ему метансульфонат ингибируют активность тирозинкиназного рецептора PDGF, при этом значение IC₅₀ (концентрация, при которой активность ингибируется на 50% по сравнению с контролем) составляет примерно 120 нМ и примерно 100 нМ соответственно.

Способность ингибировать PDGF делает соединение формулы I пригодным также для лечения связанных с опухолями заболеваний, таких как глиомы, саркомы, опухоли предстательной железы и опухоли толстой кишки, молочной железы и яичника.

Кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I также ингибирует происходящие в клетках процессы, связанные с так называемым фактором стволовых клеток (SCF, который также называют c-kit-лигандом или "жестким" фактором), такие как автофосфорилирование рецептора SCF (kit) или стимулируемую SCF активацию МАРК-киназы (активируемая митогеном протеинкиназа).

Таким образом, кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, главным образом в виде ее кристаллической -формы, также ингибирует автофосфорилирование рецептора SCF (а также c-kit, протоонкоген). Клетки МO7е представляют собой линию клеток промегакариотической лейкемии человека, пролиферация которых зависит от SCF. Они были получены от Grover Bagby, Oregon Health Science University, США. Клетки культивируют в среде RPMI 1649, дополненной 10%-ной фетальной бычьей сывороткой (ФБС) и 2,5 нг/мл GC-CMF. GM-SCF и SCF имеются в продаже. Получают бессывороточные клетки МO7е и инкубируют в течение 90 мин при 37^oС с тестируемым веществом перед стимулированием рекомбинантным SCF в течение 10 мин при 37^oС. Идентичные количества клеточных лизатов анализируют Вестерн-блоттингом, используя антитела к фосфотирозину (Buchdunger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 92, 2558-2562 (1995)). Иммунологически меченные протеины выявляют с помощью ECL-системы для Вестерн-блоттинга фирмы Amersham (фирма Amersham, Великобритания). Соединение формулы I, прежде всего кристаллическая форма метансульфоната формулы II, ингибирует автофосфорилирование рецептора SCF в диапазоне микромолярных концентраций.

С точки зрения описанных свойств кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, прежде всего ее кристаллическая -форма, может применяться не только в качестве ингибирующего рост опухоли соединения, например, при мелкоклеточном раке легкого, но и в качестве агента для лечения незлокачественных пролиферативных нарушений, таких как атеросклероз, тромбоз, псориаз, склеродермия и фиброз, а также для защиты стволовых клеток, например для предотвращения гемотоксического действия химиотерапевтических агентов, таких как 5-флурурацил, и для лечения астмы. Ее особенно можно рекомендовать для лечения заболеваний, чувствительных к ингибированию киназного рецептора PDGF.

Кроме того, кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, прежде всего ее кристаллическая -форма С, предупреждает развитие множественной устойчивости к лекарствам при лечении рака с помощью других химиотерапевтических агентов или устраняет уже существующую устойчивость к другим химиотерапевтическим агентам. Помимо уже указанного ранее действия кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, прежде всего ее кристаллическая -форма, может с успехом применяться в сочетании c другими противоопухолевыми агентами.

4-(4-Метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамид и его метансульфонат также ингибируют аbI-киназу, в частности v-abI-киназу. Ингибирование v-abI-тирозинкиназы оценивают по методам, описанным у N. Lydon и др., Oncogene Research, 5, 161-173 (1990), и у J. F. Geissler и др., Cancer Research, 52, 4492-4498 (1992). Согласно этим методам в качестве субстратов используют [Val⁵]-ангиотензин II и [^-32P]-АТФ. Установлено, что значение IC₅₀ для 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида составляет 38 нМ.

Аналогично этому соль соединения формулы I также обладает способностью ингибировать BCR-аbI-киназу (см. Nature Medicine, 2, 561-566 (1996)) и вследствие этого пригодна для лечения BCR-аbI-позитивного рака и связанных с опухолью заболеваний, таких как лейкозы (прежде всего хронический миелоидный лейкоз и острый лимфобластный лейкоз, для которых, в частности, характерны апоптозные механизмы действия), а также обладает активностью в отношении подгруппы лейкозных стволовых клеток и обладает потенциальной активностью в отношении очистки этих клеток in vitro после удаления указанных клеток (например, удаления костного мозга) и повторной имплантации клеток после того, как они были очищены от раковых клеток (например, повторная имплантация очищенных клеток костного мозга).

Кроме того, кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I может эффективно использоваться при лечении нарушений, возникших в результате трансплантации, например аллогенной трансплантации, главным образом при отторжении ткани, в частности при облитеративном бронхолитиазе (ОБ), т.е. хроническом отторжении аллогенных трансплантатов легкого. В отличие от пациентов, у которых отсутствует ОБ, у пациентов, страдающих ОБ, в жидкостях бронхоальвеолярного лаважа часто обнаруживается повышенная концентрация PDGF. Если метансульфонат 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, главным образом в кристаллической -форме, внутрибрюшинно вводят крысам, имеющим трахеальные аллогенные трансплантаты, например, в дозе 50 мг/кг, то после взятия через 10 и 30 дней 10 трансплантатов из каждой группы для морфометрического анализа возможных эпителиальных повреждений и окклюзии дыхательных путей и исследования активности с помощью иммуногистохимических методов можно обнаружить, что хотя кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I и не проявляет выраженной активности в отношении эпителиального некроза или инфильтрации воспалительных клеток, тем не менее она обладает способностью заметно уменьшать фибропролиферацию и окклюзию полости по сравнению с контролем. При применении с другими иммуномодулирующими и противовоспалительными веществами, например при использовании в сочетании с циклоспорином, рапамицином или аскомицином либо с их аналогами, обладающими иммунодепрессивной активностью, например с циклоспорином А (ЦсА), циклоспорином G, FK-506, рапамицином или с аналогичными соединениями, с кортикостероидами, циклофосфамидом, азатиоприном, метотрексатом, брехвинаром, лефлуномидом, мизорибином, микофеноловой кислотой, мофетилом микофенолята, 15-дезоксиспергуалином, иммунодепрессантными антителами, в частности с моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например МНС (главный комплекс гистосовместимости), CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, В7, CD45, CD58 или с их лигандами, либо с другими иммуномодуляторными соединениями, такими как CTLA4Ig, возможно достижение синергетического эффекта. Если, например, объединяют CsA (1 мг/кг, подкожно) с кислотно-аддитивной солью соединения формулы I (50 мг/кг), возможно проявление синергетического действия.

Кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I также обладает эффективностью в отношении болезней, связанных с миграцией и пролиферацией клеток гладкой мускулатуры сосудов (в которых часто также определенную роль играют PDGF и рецептор PDGF), таких как рестеноз и атеросклероз. Эти воздействия и их влияние на пролиферацию или миграцию клеток гладкой мускулатуры сосудов могут быть продемонстрированы in vitro и in vivo при введении кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, а также при исследовании in vivo ее воздействия на утолщение внутренней оболочки сосудов после механического повреждения.

В опытах in vitro кислотно-аддитивную соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I применяют в концентрации 10 мМ в 0,1 н. НСl или ДМСО. Затем маточный раствор разбавляют средой для культуры клеток и в экспериментах используют в концентрациях от 10 до 0,1 мкМ. Для введения in vivo кислотно-аддитивную соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I растворяют, например, в ДМСО в концентрации 200 мг/мл и затем разбавляют из расчета 1: 20 1%-ным Твином в 0,9%-ном физиологическом растворе. После обработки ультразвуком получают прозрачный раствор. Каждый день перед введением готовят свежие маточные растворы. (Соединение формулы I для орального введения также может быть растворено просто в деионизированной воде или для парентерального введения - в 0,9%-ном физиологическом растворе). Введение проводят за 24 ч до операции. Кислотно-аддитивную соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I вводят крысам в виде одной дозы в 50 мг/кг в день внутрибрюшинно в течение всего периода наблюдения. Контрольные крысы получают такую же дозу субстрата. Также возможно оральное введение.

Первичные культуры клеток гладкой мускулатуры аорты выделяют из аорты 9-11-дневных крыс линии DA (AG-B4, RT1a), используя модификацию метода, описанного Thyberg и др. (см. Differentiation, 25, 156-167 (1983)). Аорту открывают с помощью продольного разреза и осторожно удаляют эндотелий. Отделяют адвентицию и среднюю оболочку и последнюю разлагают с помощью 0,1%-ной коллагеназы и ДНКазы в забуференном фосфатом физиологическом растворе в течение 30 мин при 37^oС. Клетки центрифугируют, суспендируют в культуральной среде и затем выращивают в пластиковых флаконах. Первичные культуры клеток используют для экспериментов после 2-6 пересевов. Субкульутры выдерживают в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), дополненной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой, 2 ммоль/мл глутамина, 100 ммоль/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина. Для целей идентификации клеткам дают расти на стеклянных покровных стеклах и окрашивают актином SMC- (см. ниже).

Миграцию клеток гладкой мускулатуры оценивают количественно in vitro, используя вкладыш для культуры клеток типа Transwell (фирма Costar, Cambridge, MA), верхние и нижние компартменты которого разделены поликарбонатной мембраной с размером пор 8 мкм. Клетки (100 мкл в концентрации 1 млн. клеток/мл) обрабатывают в верхнем компартменте. Через 2 ч в нижний компартмент, содержащий 0,5%-ную фетальную телячью сыворотку и 0,1%-ный бычий сывороточный альбумин, добавляют 60 нг/мл PDGF-BB или PDGF-AA (фирма Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY) и тестируемое соединение в концентрациях 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 и 0,003 мкМ. Для оценки зависящей от фибронектина миграции на камеры типа Transwell наносят покрытие из фибронектина в концентрации 10 мкг/мл на 24 ч и инкубируют при 4^oС (человеческий клеточный фибронектин, фирма Upstate Biotechnology Inc.). После 24-часовой миграции фильтры удаляют, фиксируют в метаноле и окрашивают гематоксилином по Майеру или эозином. Количество клеток, которые мигрировали на нижнюю сторону фильтровальной мембраны, определяют путем подсчета их количества в специальных секционных областях на фильтрах с помощью световой микроскопии при 400-кратном увеличении. Ингибирование миграции оценивают количественно в виде процента клеток относительно контроля. С целью исключить возможность токсичного действия определяют жизнеспособность клеток путем включения ³Н-тимидина в среду DMEM, дополненную 10%-ной фетальной телячьей сывороткой. Определяют ингибирование миграции, вызванной PDGF-AA и, в частности, PDGF-BB.

Экспериментальные животные. Аорту и сонную артерию самцов крыс линии