Донор оксида азота, активирующий растворимую форму гуанилатциклазы, ингибирующий агрегацию тромбоцитов и обладающий спазмолитическим и сосудорасширяющим действием

Донор оксида азота, активирующий растворимую форму гуанилатциклазы, ингибирующий агрегацию тромбоцитов и обладающий спазмолитическим и сосудорасширяющим действием

Реферат

 

Предложено: средство-донор оксида азота, активирующий растворимую форму гуанилатциклазы. Указанное средство ингибирует агрегацию тромбоцитов, также обладает спазмолитическим, сосудорасширяющим действием и представляет собой 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин (БАФДОД) формулы (1). Изобретение может быть использовано в клинике в качестве средства со спазмолитическим и сосудорасширяющим действием и, в отличие от производных фуроксана, не оказывает заметного влияния на артериальное давление, что предполагает возможность его направленного локального применения. 1 ил.

Изобретение относится к биохимии, физиологии и фармакологии, в частности к применению известного 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина (БАФДОД) формулы I в качестве донора оксида азота, активирующего растворимую форму гуанилатциклазы (рГЦ), ингибирующего агрегацию тромбоцитов и обладающего спазмолитическим и сосудорасширяющим действием.

Данное изобретение может быть использовано в биохимии, физиологии и медицине.

Оксид азота (NO), синтезируемый эндотелиальными клетками и другими типами клеток и тканей, играет одну из ключевых ролей в поддержании нормального тонуса гладких мышц сосудов, влияющего на системное давление крови. Кроме того, NO оказывает спазмолитическое действие на мышцы желудочно-кишечного тракта, желчных путей, мочеточников, матки, бронхов и других органов, а также ингибирует процессы агрегации и адгезии тромбоцитов и нейтрофилов (М.Д. Машковский "Лекарственные средства", т.1, "Торсинг", Харьков, 1998 г., стр. 385 [1] ). Механизм молекулярного действия эндогенного оксида азота, синтезируемого из аминокислоты L-аргинина, включает его диффузию через плазматические мембраны и связывание с гемовой группой рГЦ. Гуанилатциклаза /КФ 4.6.1.2; гуанозин-5'-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/ является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3',5'-циклофосфата (цГМФ) - вторичного мессенджера, выполняющего роль универсального регулятора внутриклеточного метаболизма (F. Murad "Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: The NO-cGMP signal transduction system" Adv. Pharmacol. 1994, v. 26, p. 19-33). ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой. В настоящее время установлено, что в результате взаимодействия NO с атомом железа гема, входящего в состав фермента, и образования комплекса нитрозил-гем возникают конформационные изменения активного центра фермента, которые приводят к активации рГЦ и повышению синтеза цГМФ (см. чертеж).

К настоящему времени доказано образование оксида азота в результате энзиматической биотрансформации тринитроглицерина и других нитратов, которые используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в качестве антиишемических и антиангинальных препаратов ([1], стр. 385 - 392). Однако их существенным недостатком является слабая антиагрегантная активность, а также возникновение толерантности и других побочных эффектов при длительном применении. Кроме того, данные органические нитраты в составе различных лекарственных форм эффективно снижают артериальное давление, что существенно затрудняет их локальное применение (например, в случаях церебрального вазоспазма, легочной гипертонии, рестеноза после ангиографии и т.д.).

Известны различные гетероциклические соединения, обладающие способностью генерировать NO, активировать рГЦ и проявляющие антиагрегантные, спазмолитические и/или сосудорасширяющие свойства.

Так, известны производные 1,2,4-оксадиазол-5-она общей формулы II где R - фенил, 4-хлорфенил или стирил, которые рассматривались в качестве предшественников (депо-форм) NO-генерирующих соединений (амидоксимов). Данные производные не обладали гипотензивным действием, но ингибировали агрегацию тромбоцитов под действием коллагена в моделях ex vivo и in vivo (K. Rehse, F.Brehme "New NO-donors with antithrombotic and vasodilating activities. Part 26: Amidoximes and their prodrugs" Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, v. 331, p. 375-379).

Способность данных соединений генерировать NO в условиях in vivo не была установлена, их влияние на активность рГЦ, а также спазмолитические и сосудорасширяющие свойства не исследовались.

Известны различные 3,4-дизамещенные фуроксаны (1,2,5-оксадиазол-2-оксиды) общей формулы III где R¹ и R² - метил, фенил, фенилсульфонильная, нитрильная, метокси-, нитро- или аминогруппа, генерирующие NO, активирующие рГЦ, проявляющие антиагрегантные свойства и обладающие выраженным вазорелаксантным действием на изолированных кольцах торакальной аорты кролика, сокращенных под действием норадреналина (R. Ferioli, G.C. Folco et al. "A new class of furoxan derivatives as NO-donors: mechanism of action and biological activity" Brit. J. Pharmacol. 1995, v. 144, 3, p. 816-820; заявка РСТ 94/01422, C 07 D 271/08, А 61 К 31/41, 1993 г.).

Способность производных фуроксанов, как и органических нитратов, эффективно снижать системное давление крови (на 25-85 мм рт. ст. при внутривенном введении животным в дозах 0,05-0,1 мг/кг) (например, европейские патенты 0054872, C 07 D 271/08, А 61 К 31/41, 1984 г.; 0054873, C 07 D 271/08, А 61 К 31/41, 1984 г.) существенно затрудняет их направленное локальное применение.

Известен 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин вышеуказанной формулы I в качестве продукта химического синтеза (В.Г. Андрианов, В.Г. Семенихина, А.В. Еремеев "Галогенангидриды 4-аминофуразан-3-карбогидроксимовой кислоты" Химия гетероцикл. соед. 1992, 5, с. 687-691 [12]). Биохимические, физиологические и фармакологические свойства данного соединения не изучены.

Наиболее близким к соединению настоящего изобретения является 4,4'-дифенил-3,3',4',3''-трифуразан-2,2',2''-триоксид формулы III, где R¹=R²=4-фенилфуроксанил-3(2-оксидо-4-фенил-1,2,5-оксадиазол-3-ил), являющийся донором NO, ингибирующий агрегацию тромбоцитов под действием коллагена и вызывающий вазодилятацию на изолированных кольцах торакальной аорты кролика, сокращенных под действием норадреналина (A.M.Gasco, A.Di Stilo et al. "Synthesis and structure of a trimer of the furoxan system with high vasodilator and platelet antiaggregatory activity" Liebigs Ann. Chem. 1993, p. 441-444 - прототип).

Влияние данного соединения на активность рГЦ и его гипотензивная активность не изучены. Кроме того, оно обладало недостаточно эффективным спазмолитическим и сосудорасширяющим действием в условиях эксперимента.

Целью изобретения является поиск в ряду производных 1,2,5-оксадиазола нового донора оксида азота и активатора рГЦ, обладающего улучшенным спазмолитическим и сосудорасширяющим действием.

Указанная цель достигается применением известного химического соединения -3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина вышеуказанной формулы I в качестве донора NO, активирующего рГЦ, ингибирующего агрегацию тромбоцитов и обладающего спазмолитическим и сосудорасширяющим действием.

БАФДОД был синтезирован известным способом, основанным на реакции стереоселективной димеризации нитрилоксидов и заключающимся во взаимодействии хлорангидрида (4-аминофуразан-3-ил)гидроксамовой кислоты с триэтиламином в инертном органическом растворителе (ацетонитриле) при температуре 0-5^oС [12] .

Описание данного изобретения содержит 9 примеров, иллюстрирующих экспериментальный материал.

Примеры 1-4 показывают химические основы молекулярного механизма действия 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина, преимущественно заключающиеся в селективной генерации NO.

Пример 5 иллюстрирует биохимический эффект БАФДОД, опосредованный генерацией оксида азота, - активацию частично очищенной рГЦ из легких быка.

Примеры 6 и 7 иллюстрируют фармакологические свойства БАФДОД - способность ингибировать агрегацию тромбоцитов, а также спазмолитическую и сосудорасширяющую активность в условиях in vitro.

Пример 8 демонстрирует отсутствие у БАФДОД при внутривенном введении в дозе 0,5 мг/кг гипотензивной активности в условиях in vivo.

Пример 9 описывает изучение острой токсичности БАФДОД.

Пример 1. Образование оксида азота из 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина.

Для определения оксида азота использовали известный способ, основанный на реакции оксида азота с кислородом воздуха в водной среде с образованием нитрита, количество которого измеряли по интенсивности окрашивания пробы продуктом реакции азосочетания с помощью спектрофотометра. В качестве доказательства того, что данный способ дает возможность измерить именно оксид азота, выделяющийся из соединения в результате химической реакции, а не нитрит, реакцию проводят в присутствии оксигемоглобина, который количественно реагирует с оксидом азота (но не нитритом), образуя нитрат, который не вступает в реакцию азосочетания.

Проба конечным объемом 1 мл содержала 50 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,4) или 20 мМ калий-цитратный буфер (рН 5,0), 0,5 мМ цистеин или глутатион, изучаемое соединение в концентрации 0,1 мМ и 0,2% диметилсульфоксид (ДМСО), а при инкубации с оксигемоглобином его концентрация составляла 0,1 мМ. В качестве отрицательного контроля использовали водный раствор ДМСО в концентрации 0,2%, а в качестве положительного контроля 0,1 мМ нитрит натрия, содержащий 0,2% ДМСО. Пробы инкубировали 60 мин при 37^oС и добавляли последовательно 100 мкл 3 М ацетата натрия, 400 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте и 400 мкл 0,05% N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 10 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре.

В вышеуказанных условиях при рН 7,4 не наблюдалось образование заметного количества нитрита (<0,01 моль нитрита/моль исходного соединения (исх. соед. ) в отсутствие тиолов. В присутствии тиолов БАФДОД генерировал 0,182 моль нитрита на моль исх. соед. в присутствии цистеина и 0,154 моль нитрита на моль исх. соед. в присутствии глутатиона. Дальнейшая инкубация не приводила к дополнительному образованию нитрита.

При инкубации БАФДОД в вышеуказанных условиях в присутствии оксигемоглобина и цистеина или глутатиона наблюдалось образование метгемоглобина (см. пример 4).

Согласно известным данным NО-генерирующие свойства наиболее близкого известного аналога в условиях, близких к описанным (в присутствии тиолов), изучить не удалось вследствие его крайне низкой растворимости в условиях эксперимента.

Пример 2. Образование S-нитрозотиолов (S-нитрозоглутатиона) 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазином.

Для определения S-нитрозотиолов использовали известный способ, основанный на реакции с хлоридом ртути (II), в ходе которой происходит образование нитрита. Для учета образования нитрита в ходе реакции соединения настоящего изобретения с глутатионом реакцию проводили, как описано в примере 8, а затем определяли нитрит по способу, описанному в примере 8, в отсутствие и в присутствии хлорида ртути (II) в концентрации 0,1%. Разность полученных значений соответствует количеству S-нитрозоглутатиона.

В вышеуказанных условиях не происходит образования S-нитрозоглутатиона из соединения формулы I. Возможность генерации известным аналогом S-нитрозотиолов не исследовалась.

Пример 3. Образование восстановленной формы оксида азота из 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина.

Для определения восстановленной формы оксида азота (NO^-/HNO) использовали известный способ, основанный на том, что образовавшийся в ходе реакции нитроксил реагирует с тиолами с образованием гидроксиламина (или происходит конкурентное образование N₂O), который после окисления ионами I₃ ^- дает нитрит, определяемый по реакции азосочетания (см. пример 8). Поскольку изучаемые соединения также генерируют и нитрит, который аналогичным образом вступает в реакцию азосочетания на заключительном этапе, в качестве положительного контроля использовали гидроксиламина гидрохлорид и нитрит натрия в концентрации 0,1 мМ, а инкубацию проводили так же, как описано в примере 1, при рН 7,4. После инкубации в пробы добавляли 100 мкл 3 М ацетата натрия, 400 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте, 100 мкл 1,25% I₂ в 2% KI, 30 мкл 0,5 М 2-меркаптоэтанола и 400 мкл 0,05% N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 15 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре. Параллельно с этим опытом проводили измерения образования нитрита, как описано в примере 1. Содержание гидроксиламина рассчитывали по формуле: Х=(А-YN)/H, где Х соответствует концентрации гидроксиламина, мкМ; А - оптическая плотность пробы, содержащей исследуемое соединение, Y - концентрация образовавшегося нитрита натрия, определенная как описано в примере 1, мкМ; N - оптическая плотность положительного контроля, содержащего нитрит натрия, мкМ^-1; и Н - оптическая плотность положительного контроля, содержащего гидроксиламина гидрохлорид, мкМ^-1.

В вышеуказанных условиях не наблюдалось образования гидроксиламина из соединений данного изобретения в присутствии цистеина или глутатиона. Возможность генерации известным аналогом восстановленной формы оксида азота не исследована.

Таким образом, БАФДОД является селективным донором NO.

Пример 4. Образование метгемоглобина из оксигемоглобина под действием 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина.

Определение генерации NO в присутствии оксигемоглобина, сопровождающееся образованием метгемоглобина, изучали известным способом в спектрофотометрической кювете конечным объемом 1 мл при 25^oС. Пробы содержали 25 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,4), 3 мкМ оксигемоглобин, 0,5 мМ цистеин или глутатион и БАФДОД в концентрации 0,1 мМ. Определяли скорость возрастания оптической плотности при 401 нм, и по линейному начальному участку рассчитывали скорость образования оксида азота (коэффициент молярного поглощения метгемоглобина принимали равным 39,9 ммоль^-1см^-1). В отсутствие тиолов заметного прироста оптической плотности при 401 нм не наблюдалось. Кажущуюся константу скорости реакции первого порядка выражали в мин^-1. Из данных литературы известно, что процесс превращения оксигемоглобина в метгемоглобин может сопровождаться образованием гемихрома или холеглобина, поэтому в отдельных экспериментах проверяли отсутствие этих форм гемоглобина. Для этого пробы инкубировали в калий-фосфатном буфере рН 7,4 в присутствии 25 мкМ оксигемоглобина, 0,2 мМ цистеина или глутатиона и 20 мкМ соединений. Измеряли оптическую плотность при 560, 577, 630 и 700 нм и рассчитывали концентрации оксигемоглобина, гемихрома, метгемоглобина и холеглобина. Эти эксперименты показали, что при инкубации исследуемых соединений с оксигемоглобином в отсутствие тиолов или в присутствии цистеина или глутатиона не наблюдается образования холеглобина или гемихрома, а происходит исключительно превращение оксигемоглобина в метгемоглобин.

В вышеуказанных условиях БАФДОД вызывал образование метгемоглобина из оксигемоглобина, причем данный эффект усиливался в присутствии цистеина и глутатиона. Константа скорости реакции (NO+Гм-О₂-->NO₃ ^-+метГм) в присутствии цистеина имела значение 0,0348 мин^-1, в присутствии глутатиона - 0,0341 мин^-1. Соединение не реагировало в аналогичных условиях с метгемоглобином.

Пример 5. Активация растворимой формы гуанилатциклазы 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазином.

Активность рГЦ измеряли в препаратах из легких быка, полученных известным способом.

Для получения препарата рГЦ из легких быка ткань гомогенизировали в 5 объемах 50 мМ трис-HCl-буфера (рН 7,6), содержащего 10 мМ MgCl₂, с помощью гомогенизатора "стекло-стекло". Гомогенат центрифугировали в течение 30 мин при 30000 g, супернатант отбирали и определяли активность фермента по количеству [³²P] цГMФ, образовавшегося из [-³²P]ГТФ, известным способом. Белок (около 0,2-0,5 мкг белка частично очищенного препарата из легких быка) на льду добавляли в инкубационную смесь (конечный объем проб 100 мкл), содержащую (конечные концентрации) 50 мМ трис-НСl рН 7,6, 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантин, 5 мМ MgCl₂, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназы, 5 мМ креатинфосфат, 2 мМ цГМФ, 0,2 мМ ГТФ, 10000-20000 имп/мин/пмоль [-³²P]ГТФ (ГНЦ ФЭИ, Обнинск), а также 10 мМ ДТТ. При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в концентрации 10 мкМ в виде раствора в водном ДМСО, а в контрольные пробы добавляли ДМСО до концентрации 0,02%. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали при 37^oС в течение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением проб в течение 2 мин. После охлаждения до комнатной температуры в пробы добавляли 0,5 мл 30 мМ Na₂CO₃ и 0,6 мл 36 мМ Zn(СН₃СОО)₂, инкубировали при 4^oС в течение 10 мин и центрифугировали при 15000 g в течение 5 мин. Супернатант наносили на хроматографические колонки с окисью алюминия, уравновешенные 1 М хлорной кислотой, которые затем промывали водой. Элюцию [³²Р]цГМф проводили 0,2 М формиатом аммония во флаконы для сцинтилляционного счета, радиоактивность измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика известным способом.

Соединение настоящего изобретения в зависимости от концентрации в 11,0 (10 и 50 мкМ)-16,6 раз (100 мкМ) повышало активность рГЦ из легких крысы. Влияние известного структурного аналога на активность рГЦ не изучено.

Пример 6. Ингибирование агрегации тромбоцитов человека, вызываемое 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазином.

Влияние соединения настоящего изобретения на агрегацию тромбоцитов человека изучали известным турбидиметрическим способом Борна. Для этого венозную кровь, взятую в 8 часов утра у здоровых доноров, центрифугировали при 450 g при комнатной температуре в пластиковой посуде в течение 10 мин, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия. Супернатант, то есть богатую тромбоцитами плазму, отбирали и центрифугировали при 650 g в течение 30 мин, получая бедную тромбоцитами плазму. Концентрацию тромбоцитов доводили в богатой тромбоцитами плазме до 2,510⁸ клеток/мл с помощью разведения бедной тромбоцитами плазмой и приливали полученную суспензию в кювету объемом 0,5 мл. Агрегацию индуцировали добавлением АДФ до концентрации 2-5 мкМ. Концентрацию АДФ подбирали в каждом эксперименте так, чтобы агрегация была обратимой и максимум приходился на 2 мин после добавления АДФ, не превышая 50%. Светорассеяние суспензии тромбоцитов измеряли с помощью агрегометра, разработанного в лаборатории биоорганической химии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (Россия). Изучаемое соединение добавляли в пробу до АДФ.

Полученные результаты показывают, что БАФДОД в описанных условиях ингибировал агрегацию тромбоцитов. Значение концентрации, при которой достигалось полумаксимальное ингибирование (IС₅₀), для данного соединения составило 2,2 мкМ. Известный аналог, согласно данным прототипа, в близких условиях имел значение IС₅₀, равное 1,8 мкМ.

Пример 7. Сосудорасширяющая и спазмолитическая активности 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина.

Сосудорасширяющую и спазмолитическую активности БАФДОД изучали на модели изометрического сокращения гладких мышц изолированного сегмента аорты крысы под действием вазоконстриктора (спазмогена) - фенилэфрина. Активность БАФДОД определяли в условиях in vitro на кольцах торакальной аорты крыс-самцов линии Вистар средней массой 280 г (210-330 г) известным способом. Крыс декапитировали, вырезали торакальную аорту и очищали от жировой ткани. Затем вырезали кольца шириной 2,5 мм, которые подвешивали на двух параллельных крючках из нержавеющей стали. Один из крючков закрепляли на стенке камеры, а другой соединяли с изометрическим датчиком DY1, соединенным с восьмиканальным самописцем (фирмы Beckman, США). Камера содержала 30 мл раствора Кребса (130 мМ NaCl, 4,7 мМ КСl, 2,5 мМ СаСl₂, 1,18 мМ КН₂РO₄, 14,9 мМ NаНСО₃, 1,2 мМ MgSO₄, 11 мМ глюкоза) при 37^oС, который находился в условиях постоянной аэрации 95% O₂/5% СО₂ для поддержания рН 7,4. В раствор Кребса добавляли индометацин до концентрации 1 мкМ. При необходимости эндотелий удаляли механическим способом. Кольца перед опытом уравновешивали в течение часа под нагрузкой 2,5 г. Перед началом эксперимента кольца предсокращали 10 нМ норадреналином, а через 20 мин вызывали сокращение препарата добавлением фенилэфрина в концентрации 0,3 мкМ. После стабилизации состояния мышцы сосуда регистрировали ее расслабление в ответ на кумулятивные дозы соединений в диапазоне концентраций от 0,003 нМ до 50000 нМ. Затем изучаемое соединение отмывали 6-7 сменами среды инкубации в течение 1 часа и контролировали интактное состояние гладкой мышцы сосуда с использованием 0,5 мкМ нитропруссида натрия. В связи с невысокой растворимостью соединений в воде влияние растворителя (ДМСО) на изометрическое сокращение сосуда определяли в отдельных экспериментах. Было установлено, что ДМСО в концентрации до 0,1-0,2% практически не оказывает влияния на сосудистый тонус, что позволяет тестировать вазорелаксантную активность соединения в концентрации до 100 мкМ. Все эксперименты повторяли не менее 3 раз. Величину концентрации исследуемого соединения, соответствующую 50%-ной релаксации сосуда (IС₅₀), рассчитывали с применением программы SigmaPlot версии 2,0 по стандартному уравнению для сигмоидных зависимостей вида где R соответствует релаксации сосуда при концентрации соединения с, Rmax соответствует максимальной релаксации под действием этого же соединения, а n представляет собой виртуальный коэффициент кооперативности, варьировавший в пределах от 1,1 до 1,8. Достоверность подбора параметров (n и IC₅₀), которую контролировали по методу наименьших квадратов, составляла не менее 95-97%. Статистическую обработку результатов проводили по тесту Стьюдента (t).

В вышеописанных условиях БАФДОД вызывал уменьшение изометрического сокращения сосуда с интактным эндотелием в присутствии фенилэфрина (IC₅₀=22 нМ).

Согласно данным прототипа, известное соединение в условиях in vitro, близких к вышеописанным, обладало спазмолитическим и сосудорасширяющим действием; при этом значение IC₅₀ составляло 120 нМ. Для базового фармпрепарата (глицерилтринитрата), использованного в качестве эталона сравнения в вышеописанных условиях, данный параметр имел значение, равное 5,3 нМ.

Пример 8. Гипотензивная активность 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина.

Гипотензивную активность соединений настоящего изобретения общей формулы I определяли в условиях in vivo у бодрствующих крыс линии Вистар средней массой 280 г известным способом. Для измерения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений и для введения препарата в кровоток за сутки до эксперимента животным имплантировали полиэтиленовые катетеры (марки РЕ-10, РЕ-50) в бедренную артерию и бедренную вену. Свободные концы катетеров выводили и закрепляли на голове. Операция проводилась под гексеналовым наркозом (150 мг/кг). Через сутки крысу брали в опыт. В ходе эксперимента регистрировали артериальное давление датчиком фирмы Stadham (США) с последующей регистрацией данных с помощью компьютера (программа Bioshell, Факультет Фундаментальной Медицины, МГУ им. Ломоносова, Россия). Соединения вводили болюсно внутривенно в дозе 2,5 мг/кг в объеме 0,2 мл в 5% ДМСО. Во время всего эксперимента животные находились в состоянии бодрствования и могли свободно перемещаться по клетке. В течение часа животные свободно адаптировались к условиям эксперимента, а затем начинали регистрацию гемодинамических показателей, которая велась непрерывно в течение всего опыта. Исходные значения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений составляли 98,3 мм рт. ст. и 315,6 ударов/мин соответственно.

Болюсное введение БАФДОД в дозе 0,5 мг/кг не влияло на артериальное давление в течение 5 мин. При этом наблюдалось кратковременное незначительное повышение частоты сердечных сокращений с последующим снижением до исходного уровня. Таким образом, БАФДОД не проявляет гипотензивного действия при внутривенном введении крысам в дозах до 0,5 мг/кг. Влияние известного аналога на артериальное давление в условиях in vivo не изучалось.

Пример 9. Острая токсичность 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина.

Острую токсичность соединения настоящего изобретения определяли известным способом по ЛД₅₀ с использованием беспородных мышей обоего пола средней массой 21 г при комнатной температуре; стандартное питание и воду давали ad libitum в течение всего эксперимента; подвижность животных не ограничивали. Растворы соединений в ДМСО вводили с помощью стерильного шприца внутрибрюшинно. После инъекции за животными вели наблюдение в течение 48 часов; по истечении этого времени за мышами наблюдали дополнительно в течение 72 часов (ни одно из животных не погибло в течение дополнительного промежутка времени). Полученные результаты свидетельствуют о том, что значение ЛД₅₀ для 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина составляет ~ 150-300 мг/кг. Острая токсичность известного аналога не изучена.

Согласно известным данным, аналогичный показатель для базового фармпрепарата - глицерилтринитрата в близких условиях соответствует 7-9 мг/кг (патент РФ 2086534 (С 07 С 203/04) 1994 г., табл.2).

Вышеприведенные примеры 1 - 5 показывают, что 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин является эффективным донором оксида азота и активатором рГЦ. Из примера 7 следует вывод о том, что данное соединение обладает выраженным спазмолитическим и сосудорасширяющим действием, превосходящим соответствующий фармакологический эффект в условиях in vitro известного структурного аналога. При этом, в отличие от известных производных фуроксана, БАФДОД не оказывал заметного влияния на артериальное давление при внутривенном введении в дозе 0,5 мг/кг, что предполагает возможность его направленного локального применения.

Таким образом, 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин вышеуказанной формулы I является представителем нового класса доноров NO, активаторов рГЦ, ингибиторов агрегации тромбоцитов, спазмолитических и сосудорасширяющих средств.

Формула изобретения

Применение 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)1,4,2,5-диоксадиазина формулы I в качестве донора оксида азота, активирующего растворимую форму гуанилатциклазы, ингибирующего агрегацию тромбоцитов и обладающего спазмолитическим и сосудорасширяющим действием.

РИСУНКИ

Рисунок 1