Фермент с активностью эндо-1,3(4)--глюканазы, кодирующая его днк и способ его получения

Фермент с активностью эндо-1,3(4)--глюканазы, кодирующая его днк и способ его получения

Реферат

 

Изобретение относится к области получения ферментных препаратов методами генной инженерии и может быть использовано в биотехнологических процессах и микробиологической промышленности. В результате скрининга кДНК-библиотеки Trichoderma harzianum получена и секвенирована последовательность ДНК, кодирующая фермент эндо-1,3(4)--глюканазу, обладающий способностью расщеплять 1,3--D-гликозидные связи в структуре -глюканов. Предложены рекомбинантные векторы, содержащие полученную последовательность ДНК и обеспечивающие ее экспрессию в дрожжевых клетках. При культивировании штаммов Aspergillus sp., трансформированных сконструированным вектором экспрессии, получена рекомбинантная эндо-1,3(4)--глюканаза. Определены физико-химические и каталитические характеристики фермента, в соответствии с которыми он может применяться в процессах, предусматривающих разрушение клеточных стенок многих микробных и растительных продуцентов. 3 с. и 12 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Предметом настоящего изобретения является фермент с активностью эндо-1,3(4)--глюканазы, конструкция ДНК, кодирующая этот фермент, способ получения данного фермента и ферментный препарат на его основе, использование этого фермента или ферментного препарата для разрушения или модификации материалов, содержащих -глюкан.

В объем настоящего изобретения также входит выделенная чистая культура Saccharomyces cerevisiae NN049006, трансформированная последовательностью ДНК, полученной из Acremonium sp. (CBS 265.95).

Известный уровень техники Эндо-1,3(4)--глюканазы (No. 3.2.1.6 классификации ферментов) образуют группу гидролаз, которые служат катализаторами для эндогидролиза 1,3--D-гликозидных связей в таких -1,3-глюканах, как курдлан, лихенан и ламинарин, которые являются основным компонентом клеточных стенок грибов (включая дрожжи) и -1,4-связей в смешанных -1,3-1,4-глюканах, таких как -D-глюканы зерновых культур. Рассматриваемое соединение имеет название 1,3 (1,3:1,4)--D-глюкан-3(4)-глюкангидролаза, общепринятым названием является ламинариназа, но в настоящем описании изобретения используется сокращенный термин эндо-1,3(4)--глюканаза.

Клеточные стенки микроорганизмов, таких как дрожжи и грибы, представляют собой комплексные структуры, которые помимо -глюкана содержат ряд других компонентов. Например, клеточные стенки дрожжей помимо слоя глюкана (Andrews and Asenjo, 1987) включает слой маннано-белкового комплекса, а клеточные стенки нитевидных грибов дополнительно включают разные количества хитина и хитозана (Hudson H.J, 1986).

Хорошо известно, что микроорганизмы образуют ряд ценных продуктов, таких как красители, ароматизаторы, витамины, которые необходимо выделить из клеток. Чтобы выделить продукты, образуемые внутри клеток, нужно разрушить или лизировать клеточные стенки микробных продуцентов.

Из-за сложного состава клеточных стенок микробов их разрушение или лизис обычно осуществляется с помощью сильных химических веществ и/или механических средств.

В качестве альтернативы химическому или механическому разрушению в процессе получения дрожжевых экстрактов или других продуктов, образуемых внутриклеточно (Andrew and Asenjo, 1987; Phaff, 1977), предлагается ферментативный лизис и разрушение микробных клеток. Кроме того, ферментативный лизис предлагается использовать для получения протопластов из грибов или дрожжей (Hamlyn и др. , 1981). Промышленность выпускает ряд ферментных препаратов, которые можно использовать для ферментативного лизиса клеток дрожжей и грибов. Такие продукты, которые включают -1,3- и/или -1,6-глюканазу, протеазу, хитиназу, манназу и другие ферменты, обычно обладают различной ферментативной активностью и способны расщеплять компоненты клеточных стенок.

Питсон и др. (1993) считают, что такие нитевидные грибы, как Rhizopus arrhizus, Trichoderma longibranchiatum и Penicillum funiculosium, образуют ферменты с активностью эндо-1,3(4)--глюконазы.

Целью настоящего изобретения является новая эндо--глюконаза и способ получения эндо--глюконазы с более высоким выходом и степенью чистоты по сравнению с достигаемыми в настоящее время, а также использование эндо-1,3(4)--глюконазы в отдельности или в сочетании с другими ферментами для разрушения клеточных стенок растений или микробов. Кроме того, целью настоящего изобретения является создание новых продуктов с большим содержанием эндо-1,3(4)--глюконазы по сравнению с исходным веществом.

Существует необходимость в увеличении способности таких ферментных препаратов разрушать или модифицировать клеточные стенки и с большей степенью точности расщеплять или модифицировать определенные компоненты клеточных стенок растений или микробов.

Краткое изложение сущности изобретения Авторы настоящего изобретения успешно выделили и охарактеризовали последовательность ДНК, кодирующую фермент с активностью эндо-1,3(4)--глюконазы, что сделало возможным получение однокомпонентных эндо-1,3(4)--глюконаз.

Поэтому первым аспектом настоящего изобретения является конструкция ДНК, представляющая собой последовательность ДНК, кодирующую фермент с активностью эндо--глюконазы, которая является: а) последовательностью ДНК с идентификационным No.3 или б) аналогом последовательности ДНК с идентификационным No.3, который i) гомологичен последовательностям ДНК с идентификационным No.3 и/или ii) образует гибрид с аналогичным олигонуклеотидным зондом в виде последовательности ДНК с идентификационным No.3, и/или iii) кодирует полипептид, который гомологичен полипептиду, закодированному последовательностью ДНК с идентификационным No.3, и/или iv) кодирует полипептид, который обладает иммунной реактивностью в отношении антитела, индуцированного против очищенной эндо-1,3(4)--глюконазы, закодированной последовательностью No.4, которую выделяют из Trichoderma harzianum, CBS 243.71.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является указанная выше последовательность ДНК, кодирующая фермент с активностью эндо-1,3(4)--глюконазы.

В контексте настоящего изобретения "аналог" последовательности ДНК с идентификационным No. 3 означает любую последовательность ДНК, кодирующую фермент с активностью эндо--глюконазы (такой как эндо-1,3--глюканаза и эндо-1,3(4)--глюканаза), которая обладает свойствами, указанными выше в пунктах i) - iv). Аналогичную последовательность ДНК обычно - выделяют из другого или родственного (в частности, такого же) микроорганизма, который, как известно, способен образовывать фермент с активностью эндо--глюканазы на основе последовательности ДНК No.3 или любой другой последовательности ДНК с идентификационным No.1 или 2, в частности, посредством описанных здесь процедур; - конструируют на основе последовательности ДНК No.3 или любой другой последовательности ДНК с идентификационным No.1 или 2, например, путем введения нуклеотидных заместителей, которые не способны образовывать другую амнокислотную последовательность эндо--глюканазы, закодированной данной последовательностью ДНК, но соответствуют кодону организма-хозяина, служащему для образования фермента, или путем введения нуклеотидных заместителей, которые способны образовывать другую аминокислотную последовательность, а следовательно, и другую белковую структуру, формирующую мутант эндо--глюкозы, свойства которого отличаются от природного фермента. Другие примеры возможных модификаций включают вставку одного или нескольких нуклеотидов в последовательность, добавление одного или нескольких нуклеотидов к концу последовательности, такой как область связывания целлюлозы, или удаление одного или нескольких нуклеотидов в конце или внутри последовательности. Например, аналогичная последовательность ДНК может представлять собой последовательность ДНК с идентификационным No.3 или с номерами 1 или 2.

Вполне понятно, что последовательности ДНК или их части с идентификационными номерами 1 и 2 представляют собой последовательности, которые можно использовать для выделения всей последовательности ДНК, кодирующей фермент с активностью эндоглюканазы. Термин "аналог" означает всю последовательность ДНК с идентификационным No.3, которая включает по крайней мере часть последовательностей, обозначаемых идентификационными номерами 1 или 2, либо их части.

Гибридизация, рассматриваемая выше в пункте i), означает, что аналогичная последовательность ДНК служит для образования гибрида с таким же зондом, что и последовательность ДНК, кодирующая фермент эндо-1,3(4)--глюканазы в особых условиях, которые подробно описываются в приводимом ниже разделе "Материалы и методы". Аналогичная последовательность ДНК, как правило, гомологична последовательности ДНК на 40-50%, гораздо предпочтительнее, если она гомологична на 60-70% любой из приведенных выше последовательностей, кодирующих эндо--глюканазу по настоящему изобретению, в частности на 75, 80, 85, 90% или даже на 95%.

Степень гомологии, рассматриваемая выше в пункте i), определяется как степень идентичности двух последовательностей, свидетельствующая о выведении первой последовательности из второй. Гомологию можно определить с помощью существующих вычислительных программ. Последовательность ДНК, как правило, характеризуется степенью идентичности, равной по крайней мере 40-50%, предпочтительнее 60-70%, еще лучше 80 или 90%, в отношении конструкции ДНК, представляющей собой последовательность ДНК с идентификационным No.3 или по крайней мере части последовательности ДНК с идентификационным No.l и/или 2.

Степень гомологии, рассматриваемая выше в пункте iii), определяется как степень идентичности двух последовательностей, свидетельствующая о выведении первой последовательности из второй. Гомологию можно определить с помощью существующих вычислительных программ. Полипептид, закодированный аналогичной последовательностью ДНК, обладает степенью гомологии, равной по крайней мере 40-50%, предпочтительнее 60-70%, еще лучше 80 или 90%, в отношении фермента, закодированного конструкцией ДНК, представляющей собой последовательность ДНК с идентификационным No. 3 или любую часть последовательности ДНК с идентификационным No.1 и/или 2.

Термин "выделенный из" относительно свойства, рассматриваемого выше в пункте iii), означает не только эндо-1,3(4)--глюканазу, полученную с помощью штамма CBS 243.71, но и эндо-1,3(4)--глюканазу, закодированную последовательностью ДНК, выделенной из штамма CBS 243.71, и образованную в организме-хозяине, трансформированном с помощью указанной последовательности ДНК. Иммунную реактивность можно определить по методу, описанному в приводимом ниже разделе "Материалы и методы".

Другие аспекты настоящего изобретения включают экспрессирующий вектор, определяющий конструкцию ДНК по этому изобретению, клетку, имеющую такую конструкцию ДНК или экспрессирующий вектор, и способ получения фермента с активностью эндо-1,3(4)--глюканазы, который включает культивирование указанной клетки в условиях, делающих возможным получение такого фермента, и выделение фермента из этой культуры.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является фермент с активностью эндо--глюканазы, который а) закодирован конструкцией ДНК по настоящему изобретению; b) получен по способу, предлагаемому настоящим изобретением; с) обладает иммунной реактивностью в отношении антитела, индуцированного против очищенной эндо-1,3(4)--глюканазы с идентификационным No.4, выделенной из Trichoderma harzianum, штамм CBS 243.71.

Выделенный фермент по настоящему изобретению имеет характеристики, описанные в приведенных ниже примерах. Например, с идентификационным No. 3 или любую часть последовательности ДНК с идентификационным No. 1 и/или 2.

Термин "выделенный из" относительно свойства, рассматриваемого выше в пункте iii), означает не только эндо-1,3(4)--глюканазу, полученную с помощью штамма CBS 243.71, но и эндо-1,3(4)--глюканазу, закодированную последовательностью ДНК, выделенной из штамма CBS 243.71, и образованную в организме-хозяине, трансформированном с помощью указанной последовательности ДНК. Иммунную реактивность можно определить по методу, описанному в приводимом ниже разделе "Материалы и методы".

Другие аспекты настоящего изобретения включают экспрессирующий вектор, определяющий конструкцию ДНК по этому изобретению, клетку, имеющую такую конструкцию ДНК или экспрессирующий вектор, и способ получения фермента с активностью эндо-1,3(4)--глюканазы, который включает культивирование указанной клетки в условиях, делающих возможным получение такого фермента, и выделение фермента из этой культуры.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является фермент с активностью эндо--глюканазы, который a) закодирован конструкцией ДНК по настоящему изобретению; b) получен по способу, предлагаемому настоящим изобретением; c) обладает иммунной реактивностью в отношении антитела, индуцированного против очищенной эндо-1,3(4)--глюканазы с идентификационным No.4, выделенной из Trichoderma harzianum, штамм CBS 243.71.

Выделенный фермент по настоящему изобретению имеет характеристики, описанные в приведенных ниже примерах. Например, было установлено, что средняя молекулярная масса (M_w), определяемая посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, составляет 31 кДа. Средняя изоэлектрическая точка (рI) равнялась 5,1.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 - активность эндо--1,3(4)-глюканазы по настоящему изобретению в зависимости от показателя рН при температуре 30^oС.

Фиг. 2 - активность эндо--1,3(4)-глюканазы по настоящему изобретению в зависимости от температуры при рН 5,0.

Фиг. 3 - деполимеризация ламинарина посредством эндо--1,3(4)-глюканазы по настоящему изобретению.

Фиг. 4 - деполимеризация -1,3-1,4-глюкана посредством эндо-1,3(4)--глюканазы по настоящему изобретению.

Фиг. 5 - деполимеризация курдлана посредством эндо-1,3(4)--глюканазы по настоящему изобретению.

Фиг. 6 - спектры ¹³С ЯМР-глюкана, полученные во время и после обработки эндо-1,3(4)--глюканазой по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения Последовательность ДНК по настоящему изобретению, кодирующая фермент с активностью эндо--глюканазы, можно выделить с помощью обычного метода, включающего клонирование в приемлемых векторах библиотеки ДНК из Trichodernaa harzianum; трансформацию приемлемых дрожжевых клеток-хозяев с помощью указанных векторов; культивирование клеток-хозяев в соответствующих условиях с целью экспрессии любого представляющего интерес фермента, закодированного клоном в библиотеке ДНК; скрининг положительных клонов путем определения активности эндо--глюканазы фермента, образуемого такими клонами; выделение из таких клонов кодирующей фермент ДНК.

Этот метод рассматривается в заявке на патент WO 93/11249, включенной в настоящее описание изобретения в качестве противопоставленного материала. Более подробное описание скрининг-метода дано в приведенном ниже примере 1.

Последовательность ДНК, кодирующую фермент, можно выделить путем скрининга библиотеки кДНК Trichoderma harzianum, в частности штамма CBS 243.71, который может быть предоставлен центром Centraalbureau voor Schimmelcultures, г. Делфт, Нидерланды, и выбора клонов, проявляющих соответствующую ферментативную активность (то есть активность эндо-1,3(4)--глюканазы, определяемую по способности фермента гидролизовать связи -1,3(4)-глюкана приемлемого субстрата, такого как AZCL-курдлан и AZCL-глюкан, как это описывается в приводимом ниже разделе "Материалы и методы"). Необходимую последовательность ДНК можно выделить из клона с помощью стандартных процедур, например, так, как это описано в примере 1.

Предполагается, что последовательность ДНК, кодирующая гомологичный фермент, то есть аналогичную последовательность ДНК, можно получить из других микроорганизмов. Последовательность ДНК можно выделить путем аналогичного скрининга библиотеки кДНК другого микроорганизма, например такого гриба, как штамм Aspergillus sp., в частности A. aculeatus или A. niger, штамм другого вида Trichoderma sp., в частности T. reesie, Т. viride, Т. longibrachiatum или Т. koningii, или штамм Fusarium sp., в частности F. oxysporum, или штамм Humicola sp. , штамм Rhizopus sp., в частности Rhizopus arrhizus, штамм Acremonium sp. , штамм Botrytis sp., штамм Penicillium sp. и штамм Scleotium sp.

Типичным примером такой последовательности ДНК, кодирующей гомологиченый фермент, может служить последовательность, выделенная из Acremonium sp. (CBS 265.95). Две частичные последовательности ДНК, кодирующие такой фермент, известны под идентификационными номерами 5 и 6.

Изолят Saccharomyces cerevisiae, трансформированный с помощью экспрессирующей плазмиды pYES 2.0 (инвитроген), представляющий собой последовательности кДНК с идентификационными номерами 5 и 6, был зарегистрирован в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-3300 Брауншвейг, ФРГ, (DSM), в соответствии с процедурой выдачи патента, дата которой указана ниже. Поскольку DSM является международным банком данных в соответствии с Будапештским договором, то здесь возможно хранение данных на основании положения 9 данного договора.

Дата регистрации - 11.05.95 Регистрационный номер депозитора - NN049006 Обозначение DSM - DSM 9970 ДНК, кодирующую эндо-1,3(4)--глюканазу по настоящему изобретению можно альтернативно выделить из ДНК любых вышеуказанных организмов посредством известных процедур с использованием синтетических олигонуклеотидных зондов, полученных на основе описываемой здесь последовательности ДНК. Например, приемлемый олигонуклеотидный зонд можно получить на основе нуклеотидной последовательности с идентификационным номером 3 или по крайней мере части нуклеотидных последовательностей с идентификационными номерами 1 и 2.

Последовательность ДНК можно затем вставить в рекомбинантный экспрессирующий вектор. Им может быть любой вектор, пригодный для выполнения процедур с использованием рекомбинантной ДНК, причем выбор вектора часто зависит от клетки-хозяина, в которую он должен вводиться. Так, вектором может быть автономно реплицирующий вектор, то есть вектор, который существует в виде внехромосомной части, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, в частности плазмиды. Альтернативно таким вектором может быть вектор, который при вводе в клетку-хозяина внедряется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой (хромосомами), в которую он был внедрен.

В векторе последовательность ДНК, кодирующая эндо--глюканазу, должна быть присоединена к приемлемой последовательности промотора и терминатора. Промотором может быть любая последовательность ДНК, которая проявляет транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине и может быть выделена из генов, кодирующих гомологичные или гетерологичные белки в клетке-хозяине. Процедуры, используемые для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих эндо-/-глюконазу, соответственно промотора и терминатора, и вставки их в соответствующие векторы, хорошо известны специалистам в этой области (см., например, Sambrook и др. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1989).

Клетка-хозяин, которая трансформируется с помощью последовательности ДНК, кодирующей фермент по настоящему изобретению, предпочтительно является эукариотической клеткой, в частности клеткой такого гриба, как дрожжи, или клеткой нитевидного гриба. В частности, эта клетка может относиться к виду Aspergillus, предпочтительнее к виду Aspergillus oryzae или Aspergillus niger. Клетки грибов можно трансформировать с помощью процесса, включающего образование протопластов и трансформацию таких протопластов с последующей регенерацией клеточной стенки в соответствии с известными способами. Использование вида Aspergillus в качестве микроорганизма-хозяина описывается в европейском патенте No 238023 (Novo Nordisk A/S), который включен в это описание изобретения в виде противопоставленного материала. Клеткой-хозяином может быть также клетка дрожжей, например, штамма Saccharomyces sp., в частности Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri или Saccharomyces uvarum, штамма Schizosaccharomyces sp. , такого как Schizosaccharomyces pombe, штамма Hansenula sp., штамма Pichia sp., штамма Yarrowia sp., такого как Yarrowia lipolytica, или штамм kluyveromyces sp., такого как Kluyveromyces lactis.

Еще одним аспектом настоящего изобретения предусматривается способ получения фермента, в соответствии с которым клетка-хозяин, трансформированная с помощью последовательности ДНК, кодирующей фермент, культивируется в условиях, отвечающих требованиям получения фермента, после чего полученный фермент выделяют из этой культуры.

В качестве среды для культивирования трансформированных клеток-хозяев можно использовать любую среду, пригодную для выращивания таких клеток-хозяев. Выраженную эндо--глюканазу можно секретировать в культурную среду и выделять из нее с помощью хорошо известных процедур, которые включают отделение клеток от среды центрифугированием или фильтрованием, осаждение белковых компонентов среды под действием такой соли, как сульфат аммония, с последующим хроматографированием посредством ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии или подобной процедуры.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является ферментный препарат, пригодный для модификации или разрушения содержащих -глюкан материалов, причем указанный препарат обогащают ферментом с активностью эндо-1,3(4)--глюканазы, описываемым выше.

Ферментный препарат, обогащенный ферментом по настоящему изобретению, может обладать различной ферментативной активностью, в частности такой, которая необходима для модификации или разрушения клеточных стенок микробов. Примеры такого ферментного препарата включают литические ферментные системы, в частности микробного (грибного или бактериального) происхождения, например полученные из штамма Trichoderma, такого как Trichoderma harzianum, Trichoderma viride или Trichoderma reesie, штамма Oerskovia sp., такого как Oerskovia xanthineolytica, штамма Arthrobacter sp., такого как Arthrobacter luteus, штамма Rhizoctonia sp. или Cytophaga sp., штамма Staphylococcus sp. или штамма Streptomyces sp. Выпускаемыми промышленностью ферментными препаратами, которые можно подвергнуть повторной иммунизации ферментом по настоящему изобретению, являются Novozyme 234, Cereflo 200L и Glucanex фирмы Novo A/S, Дания, Cellulase (фирмы Merck), Cellulase CP и Cellulfse CT (фирмы Sturge) и/или Chitinase (фирмы Sigma).

Термин "обогащенный", используемый в настоящем описании изобретения, означает усиление активности эндо-1,3(4)--глюканазы данного ферментного препарата, например, на коэффициент обогащения, равный по крайней мере 1,1, что обычно достигается путем добавления фермента по настоящему изобретению, полученного в соответствии с описанным выше методом.

Альтернативно ферментным препаратом, обогащенным ферментом с активностью эндо-1,3(4)--глюканазы, может быть препарат, который содержит фермент по настоящему изобретению в качестве основного компонента, например, однокомпонентный ферментный препарат.

Ферментный препарат можно получить в соответствии с известными методами в жидком или сухом виде. Например, ферментный препарат может быть в форме гранул или микрогранул. Фермент, включаемый в препарат, может быть стабилизирован известными методами.

Ферментный препарат по настоящему изобретению помимо эндо-1,3(4)--глюканазы может содержать еще один или несколько других ферментов, разрушающих клеточные стенки, например, таких, которые способны разлагать целлюлозу, маннан, хитин или белок; ими, в частности, являются целлюлоза, эндоглюканаза, -глюкозидаза, -1,6-глюканаза, манназа, эндо- или экзохитиназа, протеаза, - или -маннозидаза или мутаназа. Дополнительный фермент можно получить с помощью микроорганизмов, относящихся к виду Aspergillus, предпочтительно Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori или Aspergillus oryzae, или к виду Trichoderma, либо с помощью микроорганизмов, рассмотренных выше в связи с выпускаемым промышленностью ферментными препаратами.

Ниже приводятся примеры предпочтительного использования ферментных препаратов по настоящему изобретению. Дозирование ферментного препарата и другие условия его применения можно определить с помощью известных методов.

Ферментный препарат по настоящему изобретению можно предпочтительно использовать в качестве средства для разрушения или модификации содержащего -глюкан материала, такого как клеточные стенки микробов. Ферментный препарат по настоящему изобретению можно использовать для разрушения или лизиса клеточных стенок микроорганизмов, благодаря чему высвобождаются продукты, вырабатываемые микроорганизмами.

Вполне понятно, что состав ферментного препарата должен соответствовать составу клеточных стенок, подлежащих разрушению или лизису. Например, было установлено, что клеточные стенки дрожжей состоят из двух основных слоев: наружного слоя, представляющего собой комплекс белка и манна, и внутреннего слоя, содержащего глюкан. Для эффективного разрушения клеточных стенок дрожжей ферментный препарат должен включать протеазу, манназу и -глюканазу.

Экстракт, выделяемый в результате разрушения клеточных стенок микробов, обычно включает несколько разных компонентов, таких как витамины, красители, ароматизаторы, эмульгаторы и стабилизаторы. Экстракты, получаемые при разрушении дрожжей, то есть дрожжевые экстракты, используют в том виде, как есть, например, в пищевой или кормовой отраслях промышленности. Кроме того, можно выделить их компоненты, которые при необходимости подвергают дальнейшей обработке.

Примерами таких продуктов являются эмульгаторы, стабилизаторы, витамины, красители (например, каратиноиды, Q-10 и астаксантин), ферменты, белки и ароматизаторы или усилители аромата (например, MSG, 5-GMP и IMP). Получаемыми продуктами являются свойственные данным микроорганизмам продукты либо это могут быть продукты, для выработки которых микроорганизмы были специально созданы, в частности рекомбинантные продукты.

Кроме того, эндо-1,3(4)--глюканазу по настоящему изобретению можно использовать для экстракции маннано-белкового комплекса из наружного слоя клеточных стенок дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae. Маннано-белковый комплекс можно использовать в качестве эффективного биоэмульгатора.

Ферментный препарат по настоящему изобретению можно также использовать для получения протопласта из дрожжей (например, Saccharomyces sp. или Schizosaccharomyces sp.) или из грибов (например, Aspergillus sp. или Penicillium sp.). Получение и регенерация протопласта из таких микроорганизмов имеет важное значение в исследованиях по слиянию, трансформации и клонированию. Протопласты могут быть получены в соответствии с известными методами.

Ферментный препарат по настоящему изобретению можно использовать для модификации -глюканов, таких как курдлан, ламинарин и лихенан.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является ферментный препарат, предназначенный для разрушения или модификации клеточных стенок растений, причем указанный препарат обогащают ферментом с эндо-1,3(4)--глюканазой по настоящему изобретению.

Ферментным препаратом, обогащенным ферментом по настоящему изобретению и предназначенным для разрушения или модификации клеточных стенок растений, может быть. например, ферментный препарат, обладающий различной ферментативной активностью, в частности, содержащий несколько ферментов, разрушающих клеточные стенки растений, таких как Pectinex, Pectinex Ultra SP, Celluclast или Celluzyme (фирмы Novo Nordisk A/S).

Ферментный препарат по настоящему изобретению может помимо эндо-1,3(4)--глюканазы содержать еще один или несколько других ферментов, разрушающих клеточные стенки растений, например, таких, которые способны разлагать целлюлозу, ксилан или пектин; ими, в частности, являются ксиланаза, арабиназа, галактаназа, рамногалактуроназа, ацетилэстераза, галактаназа, полигалактуроназа, пектинлиаза, пектатлиаза, эндоглюканаза (например, обладающая другой специфичностью по сравнению с описываемой здесь эндо-1,3(4)--глюканазой) или пектинмети-лэстераза. Эти дополнительные ферменты можно получить с помощью микроорганизмов, относящихся к виду Aspergillus, предпочтительно Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori или Aspergillus oryzae.

Эндо-1,3(4)--глюканазу по настоящему изобретению можно получить без каких-либо других ферментов, разрушающих клеточные стенки. Это позволяет использовать данный фермент отдельно или вместе с другими однокомпонентными ферментами с целью достижения оптимального сочетания ферментов для определенного применения. Таким образом можно создавать комбинации ферментов, которые способны разрушать лишь определенные части клетки. Такое специфическое разрушение ранее было не возможно при использовании выпускаемых промышленностью препаратов на основе целлюлозы, глюкана, хитиназы, мутаназы, гемицеллюлазы и/или пектиназы.

Было установлено, что эндо-1,3(4)--глюканаза по настоящему изобретению обладает высокой специфичностью в отношении -1,3-глюканов, а также в отношении -1,3-1,4-глюканов со смешанными связями.

Активность, проявляемая в отношении смешанных -1,3-1,4-глюканов, делает эндо-1,3(4)--глюканазу и ее гомологи полезными в пивоварении, виноделии и при изготовлении соков.

В пивоварении ферменты разрушают -глюкан ячменя, благодаря чему уменьшается вязкость и улучшается фильтруемость сусла. В пивоварении преимуществом этого фермента является более высокая специфичность по сравнению с другими эндоглюканазами, так как вязкость, обуславливаемую -глюканом, можно уменьшить без одновременного разрушения целлюлозных структур, которые имеют важное значение для фильтруемости сусла, когда использованное зерно служит в качестве дополнительного фильтра.

В виноделии и изготовлении соков эндо-1,3(4)--глюканаза помогает улучшить фильтруемость, предотвращая размножение микроорганизмов, таких как Botrytis cinerea, которые инфицируют виноград.

Кроме того, активность, проявляемая в отношении смешанных -1,3-1,4-глюканов делают этот фермент полезным в пищевой и кормовой отраслях промышленности, позволяя улучшить усвоение и/или переваривание пищи. Помимо эндо-1,3(4)--глюканазу можно использовать для улучшения качества печеных изделий и других хлебных продуктов.

Эндо-1,3(4)--глюканаза по настоящему изобретению оказывается весьма полезной для получения олигосахаридов из растительных материалов со смесью -1,3-1,4-глюканов. Полученные олигосахариды можно использовать в качестве наполнителей при изготовлении пищевых продуктов.

Эндо-1,3(4)--глюканазу можно также использовать для экстракции ароматических соединений из растительных материалов.

Дозирование ферментного препарата по настоящему изобретению в вышеуказанных областях применения и создание других условий его получения следует определять на основании известных методов.

В объем настоящего изобретения входит также использование эндо-1,3(4)--глюканазы или ферментного препарата на ее основе в качестве активного ингредиента, входящего в состав средств для очистки зубных протезов. Такой состав способен эффективно удалять микроорганизмы с поверхности таких протезов.

Этот фермент можно также использовать в составах для удаления зубного налета и в зубных пастах. Налет, образующийся на поверхности зубов, состоит в основном из полисахаридов. Они скапливаются на поверхности зубов и в местах микроорганизмов во рту. Эндо-1,3(4)--глюканазу по настоящему изобретению можно использовать вместе с другими глюканазами, такими как мутаназа и декстраназа.

С помощью разных глюканаз, в том числе эндо-1,3(4)--глюканазы по настоящему изобретению, можно удалять биопленки, образующиеся на поверхности контактных линз.

С помощью составов, содержащих эндо-1,3(4)--глюканазу по настоящему изобретению, можно удалять плесень на покрытиях.

В объем настоящего изобретения также входит использование эндо-1,3(4)--глюканазы в качестве противогрибкового средства.

Эндо-1,3(4)--глюканазу по настоящему изобретению можно также использовать для удаления избытка красителя с тканей.

Это изобретение более подробно описывается в следующих примерах, которые ни в коем случае не ограничивают его объем.

Материалы и методы Донорский микроорганизм: мРНК выделяли из Trichoderma harzianum, CBS 243.71, культивируемого при перемешивании с целью улучшения аэрации в сбраживаемой среде с кукурузной крупой. Мицелий собирали после культивирования в течение 3-5 дней, сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80^oС.

Штаммы дрожжей: использовали штамм Saccharomyces cerevisiae yNG231 (MAT alpha, leu 2, ura 3-52, his4-539, pep 4-delta 1, cir+) или JG169 (MAT; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prcl::HIS3; prb 1:: LEU2; cir+).

Зарегистрированный микроорганизм: Saccharomyces cerevisiae NN049006 трансформировали с помощью последовательности ДНК, включающей две последовательности ДНК с идентифицированными номерами 5 и 6, входящие в состав экспрессирующей плазмиды pYES 2.0. Трансформированная последовательность ДНК гомологична последовательности с идентификационным номером 3.

Выделение последовательности ДНК с идентификационными номерами 5 и 6: экспрессирующий вектор дрожжей pYES 2.0, содержащий последовательность кДНК из Acremonium sp. с идентификационными номерами 5 и 6, можно выделить из зарегистрированного микроорганизма Saccharomyces cerevisiae NN049006 путем э