Фитаза из bacillus subtilis, ген, кодирующий эту фитазу, способ ее получения и применение

Фитаза из bacillus subtilis, ген, кодирующий эту фитазу, способ ее получения и применение

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и характеризует фитазу, фрагмент ДНК, кодирующий эту фитазу, вектор экспрессии, содержащий фрагмент ДНК. При помощи трансформации указанным вектором или фрагментом ДНК предлагаемое изобретение позволяет получить прокариотические и эукариотические клетки-хозяева. Предлагаемая фитаза, согласно изобретению, содержится как в продуктах питания, так и в качестве добавки в корме для животных. Фитаза обладает высокой удельной и относительной активностью. Данное свойство фитазы позволяет эффективно использовать ее во время переработки продуктов питания и кормов животных, а также придает ей возможность эффективно функционировать в пищеварительном тракте сельскохозяйственных животных. 12 с. и 21 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Формула изобретения

1. Фитаза, характеризующаяся тем, что она имеет удельную активность, по крайней мере, 20 Е/мг белка и рН оптимум более или равном 6,5, причем указанная активность определена при инкубации фитазы при 37С в течение 30 мин в растворе, содержащем 100 мМ трис-НСl (рН 7,5), 1 мМ СаСl₂ и 1,6 мМ фитата натрия, а рН оптимум определен при инкубации фитазы при 37С в течение 30 мин в растворе, содержащем 100 мМ трис-малеат, 1 мМ CaCl₂ и 1,6 мМ фитата натрия.

2. Фитаза по п.1, отличающаяся тем, что она имеет молекулярный вес около 43 000 и изоэлектрическую точку около 6,5.

3. Фитаза по п.1, отличающаяся тем, что она имеет рН оптимум более или равном 7, причем указанный рН оптимум определен при инкубации фитазы при 37С в течение 30 мин в растворе, содержащем 100 мМ трис-малеат, 1 мМ СаС1₂ и 1,6 мМ фитата натрия или при инкубации фитазы при 37С в течение 30 мин в растворе, содержащем экстракт пшеничных отрубей, 1 мМ CaCl₂ и 1,6 мМ фитата натрия.

4. Фитаза по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что она способна функционировать в присутствии пищеварительных ферментов, обнаруженных в тонком кишечнике животных.

5. Фитаза по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что ее относительная активность во время переработки продуктов питания или корма больше или равна 30% в сравнении с ее активностью в пищеварительном тракте сельскохозяйственного животного.

6. Фитаза по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что она получена из микробного источника.

7. Фитаза по п.6, отличающаяся тем, что микробным источником является микроорганизм Bacillus.

8. Фитаза по п.6, отличающаяся тем, что микроорганизм Bacillus выбран из группы, включающей Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.

9. Фитаза по любому из п.6 или 7, отличающаяся тем, что указанный микроорганизм Bacillus является штаммом BS 13 Bacillus subtilis, депонированным в NCIMB под номером доступа NCIMB-40819.

10. Фитаза по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID N:1, или ее функциональное производное.

11. Фитаза по любому из пп.1-10, используемая для продукции инозита, неорганического фосфата и фосфорилированных промежуточных продуктов.

12. Фитаза по любому из пп.1-10, используемая в производстве продуктов питания или корма животного.

13. Фрагмент ДНК, кодирующий фитазу по п.1 и представленный в SEQ ID N:1.

14. Экспрессионный вектор, содержащий фрагмент ДНК по п.13, характеризующийся тем, что он сконструирован на основе плазмидного вектора, причем указанный фрагмент ДНК функционально связан с регуляторной последовательностью, способной экспрессировать фитазу по п.1 из этого фрагмента ДНК, причем этот вектор содержит лидерную последовательность, способную обеспечивать секрецию этой фитазы.

15. Способ получения прокариотической клетки-хозяина, трансформированной фрагментом ДНК или экспрессионным вектором по п.13 или 14, включающий следующие стадии: а) контактирование прокариотической клетки с указанным фрагментом ДНК или указанным экспрессионным вектором; б) трансформирование указанной прокариотической клетки указанными фрагментом ДНК или экспрессионным вектором; в) отбор трансформированных клеток-хозяина.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что клетка-хозяин выбирается из группы Е. coli. Bacillus sp., Lactobacillus sp. и Lactococcus sp.

17. Способ получения эукариотической клетки-хозяина, трансформированной фрагментом ДНК или экспрессионным вектором по п.13 или 14, включающий следующие стадии: а) контактирование эукариотической клетки с указанным фрагментом ДНК или указанным экспрессионным вектором; б) трансформирование указанной эукариотической клетки указанными фрагментом ДНК или экспрессионным вектором; в) отбор трансформированных клеток-хозяина.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что клетку-хозяина выбирают из группы Aspergillus sp., Humicola sp., Pichia sp., Trichoderma sp. и Saccharomyces sp.

19. Способ рекомбинантного получения фитазы по п.1, включающий стадии: а) выращивание или культивирование клетки-хозяина, полученной по любому из п.15 или 17 в подходящих условиях, и б) извлечение указанной фитазы.

20. Продукт питания, содержащий фитазу по любому из пп.1-10.

21. Продукт питания по п.20, отличающийся тем, что он содержит фитазу по любому из пп.1-10 в качестве добавки, которая активна в пищеварительном тракте животного.

22. Продукт питания по п.20, отличающийся тем, что он содержит фитазу по любому из пп.1-10 в качестве добавки, которая активна при переработке этого продукта питания.

23. Продукт питания по любому из пп.20-23, используемый для животных, выбранных из группы, включающей в себя птиц, в том числе домашнюю птицу, жвачных, в том числе крупный рогатый скот и овец, свиней и водных, в том числе рыбу и креветок.

24. Корм животного, содержащий фитазу по любому из пп.1-10.

25. Корм животного по п.24, отличающийся тем, что он содержит фитазу по любому из пп.1-10 в качестве добавки, которая активна в пищеварительном тракте животного.

26. Корм животного по п.24, отличающийся тем, что он содержит фитазу по любому из пп.1-10 в качестве добавки, которая активна при переработке корма животного.

27. Корм животного по любому из пп.24-26, используемый для животных, выбранных из группы, включающей в себя птиц, в том числе домашнюю птицу, жвачных, в том числе крупный рогатый скот и овец, свиней и водных животных, в том числе рыбу и креветок.

28. Способ получения продукта питания, охарактеризованного в любом из пп.20-22, включающий добавление к продукту питания фитазы, отличающийся тем, что добавляют фитазу по любому из пп.1-10.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что добавление осуществляют путем разбрызгивания фитазы в жидкой форме на продукт питания или смешивания фитазы в виде сухого продукта с продуктом питания.

30. Способ получения корма животного, охарактеризованного в любом из пп.24-26, включающий добавление, к корму животного фитазы, отличающийся тем, что добавляют фитазу по любому из пп.1-10.

31. Способ по п.30, отличающийся тем, что добавление осуществляют путем разбрызгивания фитазы в жидкой форме на корм животного или смешивания фитазы в виде сухого продукта с кормом животного.

32. Способ снижения уровня фитата в навозе животного, включающий вскармливание животного кормом, отличающийся тем, что животное вскармливают кормом по пп.24-26 в количестве, эффективном для превращения фитазы, содержащейся в данном корме.

33. Способ получения фрагмента ДНК, охарактеризованного в п.13, кодирующего фитазу по любому из пп.1-10, включающий стадии: а) гибридизация зонда, содержащего фрагмент ДНК, охарактеризованный в п.13, с образцом, в котором подозревают присутствие этого фрагмента ДНК, и б) извлечение этого фрагмента ДНК.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56