Варианты альфа-амилазы

Варианты альфа-амилазы

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии. Вариант исходной Термамил-подобной альфа-амилазы содержит изменение в одном или нескольких положениях исходной альфа-амилазы. Такие изменения представляют собой инсерции, делеции и замены аминокислот в аминокислотной последовательности. При этом указанный вариант сохраняет альфа-амилазную активность и проявляет измененные свойства, такие как пониженная способность расщепления субстрата вблизи точки ветвления, улучшенная субстратная специфичность. Данное изобретение повышает эффективность использования альфа-амилазы в моющих композициях, при производстве этанола, для обработки тканей или одежды. 12 з.п. ф-лы, 3 табл.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится, inter alia, к новым вариантам исходных Термамил-подобных альфа-амилаз, в особенности к вариантам, проявляющим измененный характер расщепления (относительно исходной альфа-амилазы), которые являются выгодными в отношении применений этих вариантов, в частности в промышленной переработке крахмала (например, разжижении или осахаривании крахмала).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Альфа-амилазы (альфа-1,4-глюкан-4-глюканогидролазы, ЕС 3.2.1.1) составляют группу ферментов, которые катализируют гидролиз крахмала и других неразветвленных или разветвленных 1,4-глюкозидных олиго- и полисахаридов.

Имеется большая масса патентной и научной литературы, относящейся к этому очень важному в промышленном отношении классу ферментов. Ряд альфа-амилаз, таких как варианты Термамил-подобных альфа-амилаз, известны, например, из WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 96/23874 и WO 97/41213.

Среди недавних описаний, относящихся к альфа-амилазам, в WO 96/23874 приведены данные по трехмерной, рентгеновской кристаллографии для Термамил-подобной альфа-амилазы, называемой ВА2, которая состоит из 300 N-концевых аминокислотных остатков альфа-амилазы В. amyloliquefaciens, содержащей аминокислотную последовательность, показанную здесь в SEQ ID NO:6, и С-концевых аминокислот 301-483 альфа-амилазы В. licheniformis, содержащей аминокислотную последовательность, показанную здесь в SEQ ID NO:4 (последняя доступна коммерчески под товарным названием Термамил ), и которая, следовательно, является близкородственной промышленно важным альфа-амилазам Bacillus (которые в данном контексте охватываются понятием "Термамил-подобные альфа-амилазы" и которые включают в себя, inter alia, альфа-амилазы В. licheniformis, В. amyloliquefaciens и В. stearothermophilus). В WO 96/23874 описана, кроме того, методология для конструирования на основе анализа структуры исходной Термамил-подобной альфа-амилазы вариантов исходной Термамил-подобной альфа-амилазы, которые проявляют измененные свойства относительно исходного фермента.

В WO 96/23874 и WO 97/41213 (Novo Nordisk) описаны варианты Термамил-подобной альфа-амилазы с измененным характером расщепления, содержащие мутации в аминокислотных остатках V54, D53, Y56, Q333, G57 и А52 последовательности, показанной здесь в SEQ ID NO:4.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к новым альфа-амилолитическим вариантам (мутантам) Термамил-подобной альфа-амилазы, в частности вариантам, проявляющим измененный характер расщепления (относительно исходного фермента), которые являются выгодными в связи с технологией производства крахмала (разжижения крахмала, осахаривания крахмала и т.п.).

Авторы изобретения неожиданно обнаружили варианты с измененными свойствами, в частности измененным характером расщепления, которые имеют пониженную способность расщепления субстрата вблизи точки ветвления и, кроме того, имеют повышенную субстратную специфичность и/или повышенную удельную активность, в сравнении с описанными в WO 96/23874 вариантами Термамил-подобной альфа-амилазы с измененным характером расщепления, содержащими мутации в аминокислотных остатках V54, D53, Y56, Q333, G57 и А52 последовательности, показанной здесь в SEQ ID NO:4.

Далее, данное изобретение относится к конструкциям ДНК, кодирующим варианты данного изобретения, композициям, содержащим варианты данного изобретения, способам получения вариантов данного изобретения и применению вариантов и композиций данного изобретения, отдельно или в комбинации с другими альфа-амилолитическими ферментами, в различных промышленных процессах, например в разжижении крахмала, и в детергентных композициях, таких как композиции для стирки белья, мытья посуды и чистки твердых поверхностей; в производстве этанола, например в производстве топливного, питьевого и промышленного этанола; в расшлихтовке текстильных изделий, тканей или одежды и т.д.

Номенклатура

В данном описании и формуле изобретения используются общепринятые однобуквенные и трехбуквенные коды для аминокислотных остатков. Для легкости ссылки варианты альфа-амилазы данного изобретения описаны с использованием следующей номенклатуры:

Исходная аминокислота (аминокислоты):положение (положения): замененная аминокислота (аминокислоты)

Согласно этой номенклатуре, например, замена аланина на аспарагин в положении 30 представляется как:

Ala30Asn или A30N

делеция аланина в том же самом положении представляется как:

Аlа30* или А30*

и инсерция дополнительного аминокислотного остатка, такого как лизин, представляется как:

*30aLys или *30аК

Делеция последовательного отрезка аминокислотных остатков, таких как аминокислотные остатки 30-33, указывается как (30-33)* или (А30-N33) или дельта(A30-N33).

Если конкретная альфа-амилаза содержит "делецию" в сравнении с другими альфа-амилазами и произведена инсерция в таком положении, это указывается как:

*36aAsp или *36aD

для инсерции аспарагиновой кислоты в положении 36.

Множественные мутации разделяются знаками плюс, т.е.:

Ala30Asp+Glu34Ser или A30N+E34S

что обозначает мутации в положениях 30 и 34, заменяющие аланин и глутаминовую кислоту на аспарагин и серин соответственно. Множественные мутации могут также разделяться следующим образом, т.е. обозначая то же самое, что и знак плюс:

Ala30Asp/Glu34Ser или A30N/E34S

При встраивании одного или нескольких альтернативных аминокислотных остатков в конкретное положение это указывается как

A30N,E или

A30N или А30Е

Кроме того, когда положение, пригодное для модификации, идентифицируется здесь без предложения какой-либо конкретной модификации, или А30Х, следует понимать, что любой аминокислотный остаток может быть заместителем для аминокислотного остатка, присутствующего в этом положении. Так, например, при упоминании модификации аланина в положении 30, но без уточнения или указания в виде X, должно быть понятно, что этот аланин может быть делегирован или заменен любой другой аминокислотой, т.е. любой из R, N, D, С, Q, Е, G, H, I, L, К, М, F, Р, S, Т, W, Y, V.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термамил-подобная альфа-амилаза

Хорошо известно, что ряд альфа-амилаз, продуцируемых Bacillus spp., являются высокогомологичными на аминокислотном уровне. Например, было обнаружено, что альфа-амилаза В. licheniformis, содержащая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4 (коммерчески доступная как Термамил ), является гомологичной приблизительно на 89% альфа-амилазе В. amyloliquefaciens, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:6, и гомологичной приблизительно на 79% альфа-амилазе В. stearothermophilus, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8. Дополнительные гомологичные альфа-амилазы включают в себя альфа-амилазу, полученную из штамма Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 или DSM 9375, все они описаны подробно в WO 95/26397, и альфа-амилазу № 707, описанную Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31.

Другие гомологичные альфа-амилазы включают в себя альфа-амилазу, продуцируемую штаммом В. licheniformis, описанным в ЕР 0252666 (АТСС 27811), и альфа-амилазы, идентифицированные в WO 91/00353 и WO 94/18314. Другими коммерческими Термамил-подобными альфа-амилазами В. licheniformis являются Optitherm и Takatherm (доступные из Solvay), Maxamyl (доступная из Gist-Brocades/Genencor), Spezym АА и Spezyme Delta AA (доступные из Genencor), и Keistase (доступная из Daiwa).

Вследствие существенной гомологии, обнаруженной между этими альфа-амилазами, считают, что они принадлежат к одному и тому же классу альфа-амилаз, а именно классу "Термамил-подобных альфа-амилаз".

Таким образом, в данном контексте, термин "Термамил-подобная альфа-амилаза" обозначает альфа-амилазу, которая на аминокислотном уровне проявляет существенную гомологию относительно Термамил , т.е. альфа-амилазы В. licheniformis, имеющей аминокислотную последовательность, показанную здесь в SEQ ID NO:4. Другими словами, Термамил-подобная альфа-амилаза представляет собой альфа-амилазу, которая имеет последовательность, показанную здесь в SEQ ID NO:2, 4, 6 или 8, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1 или 2 WO 95/26397 или в Tsukamoto et al., 1988, или i) которая обнаруживает по меньшей мере 60%-ную, по меньшей мере 70%-ную, предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную гомологию, более предпочтительно по меньшей мере 97%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную гомологию по меньшей мере с одной из указанных аминокислотных последовательностей, и/или ii) проявляет иммунологическую перекрестную реактивность с антителом, индуцированным по меньшей мере против одной из указанных альфа-амилаз, и/или iii) кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с последовательностями ДНК, кодирующими указанные выше альфа-амилазы, которые представлены в SEQ ID NO:1, 3, 5 и 7 данной заявки и SEQ ID NO: 4 и 5 WO 95/26397 соответственно.

В связи со свойством i) "гомология" может быть определена с использованием любого общепринятого алгоритма, предпочтительно с использованием программы GAP из версии 7.3 пакета GCG (июнь 1993) с использованием величин штрафа за вставку по умолчанию, которые равны величинам штрафа за открытие вставки 3,0 и штрафа за удлинение вставки 0,1 (Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

Структурное сопоставление между альфа-амилазой Термамил и Термамил-подобной альфа-амилазой может быть использовано для идентификации эквивалентных/соответствующих положений в других Термамил-подобных альфа-амилазах. Одним из способов получения указанного структурного сопоставления является применение программы Pile up из пакета GCG с использованием величин штрафа за вставку по умолчанию, т.е. штрафа за открытие вставки 3,0 и штрафа за удлинение вставки 0,1. Другие способы структурного выравнивания включают в себя гидрофобный кластерный анализ (Gaboriaud et al., (1987, FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) и обратный фолдинг (Huber, Т; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1, pp. 142-149 (1998). Свойство ii) альфа-амилазы, т.е. иммунологическая перекрестная реактивность, может анализироваться с использованием антитела, индуцированного по меньшей мере против одного эпитопа или реактивного по меньшей мере с одним эпитопом релевантной Термамил-подобной альфа-амилазы. Это антитело, которое может быть моноклональным или поликлональным, может быть получено способами, известными в данной области, например, как описано Hudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publications. Иммунологическая перекрестная реактивность может быть определена анализами, известными в данной области, примерами которых являются Вестерн-блоттинг или анализ радиальной иммунодиффузии, например, описанный Hudson et al., 1989. В этом отношении была обнаружена иммунологическая перекрестная реактивность между альфа-амилазами, имеющими последовательности SEQ ID NO:2, 4, 6 или 8 соответственно.

Олигонуклеотидный зонд, используемый в характеристике Термамил-подобной альфа-амилазы в соответствии со свойством iii), указанным выше, может быть легко получен на основе полной или частичной нуклеотидной или аминокислотной последовательности рассматриваемой альфа-амилазы.

Подходящие условия для тестирования гибридизации включают в себя предварительное замачивание в 5 SSC и предгибридизацию в течение 1 часа при -40 С в растворе 20% формамида, 5х растворе Денхардта, 50 мМ фосфате натрия, рН 6,8, и 50 мг денатурированной обработанной ультразвуком ДНК тимуса теленка, с последующей гибридизацией в том же самом растворе, дополненном 100 мМ АТФ, в течение 18 час при -40 С, с последующими тремя промывками фильтра 2 SSC, 0,2% ДСН при 40 С в течение 30 мин (низкая жесткость), предпочтительно при 50 С (умеренная жесткость), более предпочтительно при 65 С (высокая жесткость), даже более предпочтительно при ~75 С (очень высокая жесткость). Более подробные детали относительно способа гибридизации могут быть найдены в Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989.

В данном контексте "происходящая из" обозначает не только альфа-амилазу, продуцированную или продуцируемую рассматриваемым штаммом организма, но также альфа-амилазу, кодируемую последовательностью ДНК, выделенной из такого штамма, и продуцируемую в организме-хозяине, трансформированном указанной последовательностью ДНК. Наконец, этот термин обозначает альфа-амилазу, которая кодируется последовательностью ДНК синтетического происхождения или кДНК-происхождения и которая имеет идентифицирующие характеристики рассматриваемой альфа-амилазы.

Этот термин указывает также, что исходная альфа-амилаза может быть вариантом природной альфа-амилазы, т.е. вариантом, который является результатом модификации (инсерции, замены, делении) одного или нескольких аминокислотных остатков природной альфа-амилазы.

Исходные гибридные альфа-амилазы.

Исходная альфа-амилаза может представлять собой гибридную альфа-амилазу, т.е. альфа-амилазу, которая содержит комбинацию частичных аминокислотных последовательностей, происходящих по меньшей мере из двух альфа-амилаз.

Исходная гибридная альфа-амилаза может быть альфа-амилазой, которая может быть определена на основе аминокислотной гомологии и/или иммунологической перекрестной реактивности и/или гибридизации ДНК (как определено выше) как принадлежащая к семейству Термамил-подобных альфа-амилаз. В этом случае гибридная альфа-амилаза обычно состоит по меньшей мере из одной части Термамил-подобной альфа-амилазы и части (частей) одной или нескольких других альфа-амилаз, выбранных из Термамил-подобных альфа-амилаз или не-Термамил-подобных альфа-амилаз микробного (бактериального или грибкового) происхождения и/или происходящих из млекопитающих.

Таким образом, исходная гибридная альфа-амилаза может содержать комбинацию частичных последовательностей, происходящих по меньшей мере из двух Термамил-подобных альфа-амилаз или по меньшей мере из одной Термамил-подобной альфа-амилазы и по меньшей мере одной грибковой альфа-амилазы. Термамил-подобная альфа-амилаза, из которой происходит частичная аминокислотная последовательность, может быть, например, любой из указанных здесь Термамил-подобных альфа-амилаз.

Например, исходная альфа-амилаза может содержать С-концевую часть альфа-амилазы, происходящей из штамма В. licheniformis, и N-концевую часть альфа-амилазы, происходящую из штамма В. amyloliquefaciens или из штамма В. stearothermophilus. Например, исходная альфа-амилаза может содержать по меньшей мере 430 аминокислотных остатков С-концевой части альфа-амилазы В. licheniformis и может содержать, например, а) аминокислотный сегмент, соответствующий 37 N-концевым аминокислотным остаткам альфа-амилазы В. amyloliquefaciens, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:6, и аминокислотный сегмент, соответствующий 445 С-концевым остаткам альфа-амилазы В. licheniformis, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4, или b) аминокислотный сегмент, соответствующий 68 N-концевым аминокислотным остаткам альфа-амилазы В. stearothermophilus, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8, и аминокислотный сегмент, соответствующий 415 С-концевым аминокислотным остаткам альфа-амилазы В. licheniformis, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4.

В предпочтительном варианте исходная Термамил-подобная альфа-амилаза является гибридной Термамил-подобной альфа-амилазой, идентичной альфа-амилазе В. licheniformis, показанной в SEQ ID NO:4, за исключением того, что 35 N-концевых аминокислотных остатков (зрелый белок) заменены 33 N-концевыми аминокислотными остатками зрелого белка альфа-амилазы В. amyloliquefaciens (BAN), показанной в SEQ ID NO:6. Указанный гибрид может дополнительно иметь следующие мутации: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (с использованием нумерации в SEQ ID NO:4), и этот гидрид назван LE174.

Другой предпочтительной исходной альфа-амилазой является LE429, показанная в SEQ ID NO:2.

Не-Термамил-подобной альфа-амилазой может быть, например, грибковая альфа-амилаза, альфа-амилаза млекопитающего или растения или бактериальная альфа-амилаза (отличающаяся от Термамил-подобной альфа-амилазы). Конкретные примеры таких альфа-амилаз включают в себя альфа-амилазу ТАКА Aspergillus oryzae, альфа-амилазу A. niger, альфа-амилазу Bacillus subtilis, свиную панкреатическую альфа-амилазу и альфа-амилазу ячменя. Все эти альфа-амилазы имеют выясненные структуры, которые заметно отличаются от структуры типичной Термамил-подобной альфа-амилазы, на которую здесь ссылаются.

Грибковые альфа-амилазы, указанные выше, т.е. происходящие из А. niger и A. oryzae, являются высокогомологичными на аминокислотном уровне и обычно считаются принадлежащими к тому же самому семейству альфа-амилаз. Грибковая альфа-амилаза, происходящая из Aspergillus oryzae, является коммерчески доступной под товарным названием Фунгамил .

Кроме того, при упоминании конкретного варианта Термамил-подобной альфа-амилазы (варианта данного изобретения) - общепринятым образом - ссылкой на модификацию (например, делецию или замену) конкретных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности конкретной Термамил-подобной альфа-амилазы, должно быть понятно, что сюда включены и варианты другой Термамил-подобной альфа-амилазы, модифицированной в эквивалентном положении (положениях) (как определено из сопоставления наиболее возможных аминокислотных последовательностей между соответствующими аминокислотными последовательностями).

Предпочтительный вариант данного изобретения является вариантом, происходящим из альфа-амилазы В. licheniformis (в качестве исходной Термамил-подобной альфа-амилазы), например одним из указанных выше, таким как альфа-амилаза В. licheniformis, имеющая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4.

Конструирование вариантов изобретения

Конструирование представляющего интерес варианта может быть выполнено культивированием микроорганизма, содержащего последовательность ДНК, кодирующую этот вариант, в условиях, которые являются благоприятными для получения данного варианта. Затем этот вариант может быть извлечен из полученной культуральной среды. Это описано подробно дополнительно ниже.

Измененные свойства

Далее обсуждается взаимосвязь между мутациями, которые могут присутствовать в вариантах данного изобретения, и желательными изменениями в свойствах (относительно свойств исходной Термамил-подобной альфа-амилазы), которые могут возникать из них.

В первом аспекте данное изобретение относится к варианту исходной Термамил-подобной альфа-амилазы, содержащему изменение в одном или нескольких положениях, выбранных из группы:

W13, G48, Т49, S50, Q51, А52, D53, V54, G57, G107, G108, A111, S168, M197, где (а) это изменение (эти изменения) представляют собой независимо:

(i) инсерцию аминокислоты справа от аминокислоты, которая занимает это положение;

(ii) делецию аминокислоты, которая занимает это положение, или

(iii) замену аминокислоты, которая занимает это положение, отличающейся аминокислотой,

(b) этот вариант имеет альфа-амилазную активность и (с) каждое положение соответствует положению аминокислотной последовательности исходной Термамил-подобной альфа-амилазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

В предпочтительном воплощении вышеуказанные варианты данного изобретения содержат мутацию в положении, соответствующем по меньшей мере одной из следующих мутаций в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:4:

V54N, A52S, A52S+V54N, T49L, T49+G107A, A52S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R, Q51R+A52S, A52N; или

T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49S+G107A, T49N+G107A, T49I+G107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A; или

T49V, T49I, T49D, T49N, T49S, T49Y, T49F, T49W, Т49М, Т49Е, T49Q, Т49К, T49R, А52Т, A52L, A52I, A52V, А52М, A52F, A52Y, A52W, V54M, G107V, G107I, G107L, G107C.

В предпочтительном воплощении вариант данного изобретения содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем следующим мутациям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:4:

W13F,L,I,V,Y,A;

G48A,V,S,T,I,L;

*48aD или *48aY (т.е. инсерция D или Y);

T49X;

*49aX (т.е. инсерция любого возможного аминокислотного остатка)

S50X, в частности D,Y,L,T,V,I;

Q51R,K;

А52Х, в частности A52S,N,T,F,L,I,V;

D53E, Q,Y,I,N,S,T,V,L;

V54X, в частности V54I,N,W,Y,F,L;

G57S,A,V,L,I,F,Y,T;

G107X, в частности G107A,V,S,T,I,L,C;

G108X, в частности G108A,V,S,T,I,L;

A111V,I,L;

S168Y;

M197X, в частности Y,F,L,I,T,A,G.

В предпочтительном воплощении вариант данного изобретения содержит следующие мутации, соответствующие следующим мутациям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:4: T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A, и может дополнительно включать в себя G108A.

В предпочтительном воплощении вариант данного изобретения содержит по меньшей мере одну мутацию, соответствующую следующим мутациям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:4:

T49L+G107A;

T49I+G107A;

T49L+G107A+V54I;

T49I+G107A+V54I;

A52S+V54N+T49L+G107A;

A52S+V54I+T49L+G107A;

A52S+T49L+G107A;

A52T+T49L+G107A;

A52S+V54N+T49I+G107A;

A52S+V54I+T49I+G107A;

A52S+T49I+G107A;

T49L+G108A;

T49I+G108A;

T49L+G108A+V54I;

T49I+G108A+V54I.

Все из вышеуказанных вариантов данного изобретения имеют измененные свойства (т.е. усиленные или ослабленные свойства), в частности, по меньшей мере одно из следующих свойств, относительно исходной альфа-амилазы; пониженную способность расщеплять субстрат вблизи точки ветвления, повышенную субстратную специфичность и/или повышенную удельную активность, измененный профиль рН-активности, измененный профиль рН-стабильности, измененную устойчивость к окислению, измененную Са²⁺-зависимость.

Стабильность

В контексте данного изобретения мутации (в том числе аминокислотные замены и/или делеции), важные в отношении достижения измененной стабильности, в частности улучшенной стабильности (т.е. более высокой или более низкой), особенно при низком рН (т.е. рН 4-6), включают в себя все мутации, перечисленные в разделе "Измененные свойства" выше, и варианты, указанные непосредственно ниже.

Следующие варианты: Q360A,K; N102A, N326A,L; N190G, N190K; Y262A,K,E (с использованием нумерации BAN, т.е. SEQ ID NO:6) испытывали на их рН-стабильность. Предпочтительной исходной альфа-амилазой может быть ВА2, описанная выше. рН-стабильность определяли, как описано в разделе "Материалы и способы".

Устойчивость к Ca²⁺

Измененная устойчивость к Ca²⁺ обозначает улучшенную стабильность фермента при низком содержании Ca²⁺, т.е. более высокую или более низкую стабильность. В контексте данного изобретения мутации (в том числе аминокислотные замены), важные в отношении достижения измененной устойчивости к Ca²⁺, в частности улучшенной устойчивости к Ca²⁺, т.е. более высокой или более низкой устойчивости, особенно при низком рН (т.е. рН 4-6), включают в себя любые из мутаций, перечисленных в разделе "Измененные свойства" выше.

Удельная активность

В дополнительном аспекте данного изобретения важные мутации в отношении получения вариантов, проявляющих измененную удельную активность, в частности увеличенную или уменьшенную активность, особенно при температурах 60-100 С, предпочтительно 70-95 С, особенно 80-90 С, включают в себя любые из мутаций, перечисленных в разделе "Измененные свойства" выше.

Удельную активность LE174 и LE429 определяли до 16000 NU/мг с использованием анализа Phadebas , описанного в разделе "Материалы и способы".

Измененный характер расщепления

В процессе разжижения крахмала желательным является использование альфа-амилазы, которая способна разрушать молекулы крахмала на длинные, разветвленные олигосахариды, а не альфа-амилазы, которая образует более короткие разветвленные олигосахариды (подобно общепринятым Термамил-подобным альфа-амилазам). Короткие разветвленные олигосахариды (предшественники панозы) не гидролизуются удовлетворительно пуллуланазами, которые используют после обработки альфа-амилазами в процессе разжижения или одновременно с осахаривающей амилоглюкозидазой (глюкоамилазой) или перед добавлением осахаривающей амилоглюкозидазы (глюкоамилазы). Таким образом, в присутствии предшественников панозы смесь продуктов, присутствующая после глюкоамилазной обработки, содержит значительную долю короткого, разветвленного, так называемого предельного (остаточного) декстрина, а именно трисахарида панозы. Присутствие панозы значительно снижает выход осахаривания и, следовательно, является нежелательным.

Ранее сообщалось (патент США 5234823), что при осахаривании глюкоамилазой и пуллуланазой присутствие остаточной альфа-амилазной активности, возникающей из процесса разжижения, может приводить к более низким выходам глюкозы, если альфа-амилаза не инактивируется перед стадией осахаривания. Эту инактивацию можно обычно проводить доведением рН до менее 4,7 при 95 С перед снижением температуры до 60 С для осахаривания.

Причина этого отрицательного действия на выход глюкозы полностью не выяснена, но предполагается, что разжижающая альфа-амилаза (например, Термамил 120 L из В. licheniformis) генерирует "предельные (остаточные) декстрины" (которые являются плохими субстратами для пуллуланазы) гидролизом 1,4-альфа-глюкозидных связей вблизи от точек ветвления или по обе стороны от точек ветвления в амилопектине. Гидролиз этих предельных декстринов глюкоамилазой приводит к накоплению трисахарида панозы, которая лишь слабо гидролиэуется глюкоамилазой.

Получение термостабильной альфа-амилазы, которая не страдает этим недостатком, было бы значительным усовершенствованием, так как не требовалась бы отдельная стадия инактивации.

Таким образом, целью данного изобретения является получение мутантной альфа-амилазы, имеющей подходящим образом модифицированные характеристики деградации крахмала, но сохраняющей термостабильность исходной Термамил-подобной альфа-амилазы.

Таким образом, данное изобретение относится к варианту Термамил-подобной альфа-амилазы, который имеет улучшенную пониженную способность расщеплять субстрат вблизи точки ветвления и дополнительно имеет улучшенную субстратную специфичность и/или улучшенную удельную активность.

Особый интерес представляет вариант, который расщепляет субстрат-амилопектин, от восстанавливающего конца, на расстоянии более одного глюкозного звена от точки ветвления, предпочтительно на расстоянии более двух или трех глюкозных звеньев от точки ветвления, т.е. при большем расстоянии от точки ветвления, чем это расстояние при применении альфа-амилазы В. licheniformis дикого типа.

Здесь можно упомянуть, что согласно WO 96/23874 ожидается, что варианты, содержащие по меньшей мере одну из следующих мутаций, предотвращают расщепление вблизи от точки ветвления:

V54L,I,F,Y,W,R,K,H,E,Q;

D53L,I,F,Y,W;

Y56W;

Q333W;

G57, все возможные аминокислотные остатки;

А52, аминокислотные остатки, большие чем А, например A52W,Y, L,F,I.

Мутации, представляющие особенный интерес в связи с получением вариантов в соответствии с данным изобретением, имеющие улучшенную уменьшенную способность расщеплять субстрат вблизи точки ветвления и, кроме того, имеющие улучшенную субстратную специфичность и/или улучшенную удельную активность, включают в себя мутации в следующих положениях в альфа-амилазе В. licheniformis, SEQ ID NO:4:

Н156, А181, N190, А209, Q264 и 1201.

Следует подчеркнуть, что могут быть использованы не только специально указанные ниже Термамил-подобные альфа-амилазы.

Могут быть также использованы другие коммерческие Термамил-подобные альфа-амилазы. Неограничивающий перечень таких альфа-амилаз включает: альфа-амилазы, продуцируемые штаммом В. licheniformis, описанные в ЕР 0252666 (АТСС 27811), и альфа-амилазы, идентифицированные в WO 91/00353 и WO 94/18314. Другими коммерческими Термамил-подобными альфа-амилазами В. licheniformis являются Optitherm и Takatherm (доступные из Solvay), Maxamyl (доступная из Gist-Brocades/Genencor), Spezym АА и Spezyme Delta AA (доступные из Genencor), и Keistase (доступная из Daiwa).

Все Термамил-подобные альфа-амилазы могут быть выгодным образом использованы в качестве скелета макромолекулы для получения вариантов данного изобретения.

В предпочтительном варианте данного изобретения исходная Термамил-подобная альфа-амилаза является гибридной альфа-амилазой SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6. Конкретно, исходная гибридная Термамил-подобная альфа-амилаза может быть гибридной альфа-амилазой, содержащей 445 С-концевых аминокислотных остатков альфа-амилазы В. licheniformis, показанной в SEQ ID NO: 4, и 37 N-концевых аминокислотных остатков зрелой альфа-амилазы, происходящей из В. amyloliquefaciens, показанной в SEQ ID NO:6, которая может выгодно иметь дополнительно следующие мутации: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (с использованием нумерации SEQ ID NO:4). Этот гибрид называют LE174. Гибрид LE174 может быть объединен с дополнительной мутацией I201F с образованием исходной гибридной Термамил-подобной альфа-амилазы, имеющей следующие мутации H156Y+A181T+N190F+A209V+ Q264S+I201F (с использованием SEQ ID NO:4 для нумерации). Этот гибридный вариант показан в SEQ ID NO:2 и использован в примерах, приведенных ниже, и назван LE429.

Также LE174 или LE429 (SEQ ID NO: 2) или альфа-амилаза В. licheniformis, показанная в SEQ ID NO:4, содержащая одну или несколько следующих мутаций, могут быть использованы в качестве скелета макромолекулы (с использованием SEQ ID NO:4 для нумерации мутаций):

Е119С;

S130C;

D124C;

R127C;

А52 все возможные аминокислотные остатки;

S85 вce возможные аминокислотные остатки;

N96 вce возможные аминокислотные остатки;

V129 вce возможные аминокислотные остатки;

А269 все возможные аминокислотные остатки;

А378 все возможные аминокислотные остатки;

S148 вce возможные аминокислотные остатки, в частности S148N;

Е211 все возможные аминокислотные остатки, в частности E211Q;

N188 вce возможные аминокислотные остатки, в частности N188S, N188P;

М197 все возможные аминокислотные остатки, в частности М197Т, М197А, M197G, M197I, M197L, M197Y, M197F, M197I;

М138 все возможные аминокислотные остатки, в частности W138Y;

D207 вce возможные аминокислотные остатки, в частности D207Y;

Н133 все возможные аминокислотные остатки, в частности H133Y;

Н205 все возможные аминокислотные остатки, в частности Н205Н, Н205С, H205R;

S187 все возможные аминокислотные остатки, в частности S187D;

А210 все возможные аминокислотные остатки, в частности A210S, А210Т;

Н405 все возможные аминокислотные остатки, в частности H405D;

К176 все возможные аминокислотные остатки, в частности K176R;

F279 все возможные аминокислотные остатки, в частности F279Y;

Q298 вce возможные аминокислотные остатки, в частности Q298H;

G299 все возможные аминокислотные остатки, в частности G299R;

L308 все возможные аминокислотные остатки, в частности L308F;

Т412 все возможные аминокислотные остатки, в частности Т412А;

Кроме того, альфа-амилаза В. licheniformis, показанная в SEQ ID NO:4, содержащая по меньшей мере одну из следующих мутаций, может быть использована в качестве скелета макромолекулы:

М15все возможные аминокислотные остатки;

А33все возможные аминокислотные остатки.

При использовании LE429 (показанной в SEQ ID NO: 2) в качестве скелета макромолекулы. (т.е. в качестве исходной Термамил-подобной альфа-амилазы) объединением LE174 с мутацией I201F (нумерация SEQ ID NO:4) могут быть произведены мутации/изменения, в частности замены, делеции и инсерции в соответствии с данным изобретением в одном или нескольких положениях для улучшения уменьшенной способности расщеплять субстрат вблизи точки ветвления и для улучшения субстратной специфичности и/или улучшенной удельной активности: W13, G48, Т49, S50, Q51, А52, D53, V54, G57, G107, G108, A111, S168, М197 (с использованием нумерации SEQ ID NO:4), где (а) это изменение (эти изменения) представляют собой:

(i) инсерцию аминокислоты справа от аминокислоты, которая занимает это положение;

(ii) делецию аминокислоты, которая занимает это положение, или

(iii) замену аминокислоты, которая занимает это положение, отличающейся аминокислотой,

(b) этот вариант имеет альфа-амилазную активность и (с) каждое положение соответствует положению аминокислотной последовательности исходной Термамил-подобной альфа-амилазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

В предпочтительном воплощении вариант данного изобретения содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем следующим мутациям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:4:

V54N, A52S, A52S+V54N, T49L, T49+G107A, A52S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R, Q51R+A52S, A52N; или

T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49S+G107A, T49N+G107A, T49I+G107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A; или

T49V, T49I, T49D, T49N, T49S, T49Y, T49F, T49W, Т49М, Т49Е, T49Q, Т49К, T49R, А52Т, A52L, A52I, A52V, А52М, A52F, A52Y, A52W, V54M, G107V, G107I, G107L, G107C.

В предпочтительном воплощении вариант данного изобретения содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем следующим мутациям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:4:

W13F,L,I,V,Y,A;

G48A,V,S,T,I,L;

*48aD или *48aY (т.е. инсерция D или Y);

T49X;

*49aX (т.е. инсерция любого возможного аминокислотного остатка)

S50X, в частности D,Y,L,T,V,I;

Q51R,K;

А52Х, в частности A52S,N,T,F,L,I,V;

D53E,Q,I,N,S,T,V,L;

V54X, в частности V54I,N,W,Y,F,L;

G57S,A,V,L,I,F,Y,T;

G107X, в частности G107A,V,S,T,I,L,C;

G108X, в частности G108A,V,S,T,I,L;

A111V,I,L;

S168Y;

M197X, в частности Y,F,L,I,T,A,G.

В предпочтительном воплощении вариант данного изобретения содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем следующим мутациям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:4:

T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A, и может дополнительно включать в себя G108A.

В предпочтительном воплощении вариант данного изобретения содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем следующим мутациям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:4:

T49L+G107A;

T49I+G107A;

T49L+G107A+V54I;

T49I+G107A+V54I;

A52S+V54N+T49L+G107A;

A52S+V54I+T49L+G107A;

A52S+T49L+G107A;

A52T+T49L+G107A;

A52S+V54N+T49I+G107A;

A52S+V54I+T49I+G107A;

A52S+T49I+G107A;

T49L+G108A;

T49I+G108A;

T49L+G108A+V54I;

T49I+G108A+V54I.

Общие мутации в вариантах данного изобретения

Может быть предпочтительным, чтобы вариант данного изобретения содержал одну или несколько модификаций, кроме описанных выше. Так, может быть выгодным, чтобы один или несколько остатков пролина, присутствующих в части варианта альфа-амилазы, которая является модифицированной, был/были заменены другим остатком (не остатком пролина), который может быть любым из возможных природных остатков, отличных от пролина, и который предпочтительно является аланином, глицином, серином, треонином, валином или лейцином.

Аналогично, может быть предпочтительным, чтобы один или несколько остатков цистеина среди аминокислотных остатков, которыми модифицирована исходная альфа-амилаза, был/были заменены другим остатком (не остатком цистеина), таким как серин, аланин, треонин, глицин, валин или лейцин.

Кроме того, вариант данного изобретения может быть - либо в виде единственной модификации, либо в комбинации с любой из вышеописанных модификаций - модифицирован таким образом, что один или несколько Asp и/или Glu, присутствующих в аминоки