Способы лечения опухолей и метастазов с использованием комбинации антиангиогенной терапии и иммунотерапии

Способы лечения опухолей и метастазов с использованием комбинации антиангиогенной терапии и иммунотерапии

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается способов лечения опухолей и метастазов с использованием комбинации антиангиогенной терапии и иммунотерапии. Изобретение включает способ лечения нейроэктодермальной и эпителиальной опухоли у пациента, терапевтическую композицию и набор для лечения опухолевой клетки с применением агента, ингибирующего англогенез и являющегося антагнистом _{v 3}, и противоопухолевого иммунотерапевтического агента, содержащего цитокиновый компонент клетки-эффектора и компонент иммуноглобулинового Ig полипептида, направленный на ассоциированный с опухолью антиген и содержащий вариабельную область, которая связывается с ассоциированным с опухолью антигеном-мишенью. Преимущество изобретения заключается в применении для лечения опухолей антиангиогенной терапии. 3 с. и 23 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В данной заявке заявлен приоритет Предварительной заявки США на патент с регистрационным номером 60/119721, поданной 12 февраля 1999 года.

Заявление прав государства на патент

Некоторая часть описанного здесь исследования поддерживалась частично гарантами от Национального Института здоровья (NIH), действующего от имени Соединенных Штатов Америки. Правительство Соединенных Штатов Америки может иметь определенные права в данном изобретении.

Область техники

Данное изобретение относится к способам ингибирования первичных опухолей и метастазов с использованием терапии, основанной на объединенном применении антиангиогенной и направленной противоопухолевой иммунотерапии.

Предпосылки изобретения

Генерирование новых кровеносных сосудов, или ангиогенез, играет ключевую роль в росте злокачественного заболевания, и разработка агентов, которые ингибируют ангиогенез, вызывает большой интерес (см., например, Holmgren, L., O'Reilly, M.S. & Folkman, J. (1995) "Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression". Nature Medicine, 1, 149-153; Folkman, J. (1995) "Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease". Nature Medicine, 1, 27-31; O'Reilly, M.S., et al., (1994) "Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by Lewis lung carcinoma", Cell, 79, 315-328; Kerbel, R.S. (1997) "A cancer therapy resistant to resistance", Nature, 390, 335-336; Boehm, Т., et al., (1997) "Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance". Nature, 390, 404-7; и Volpert, O.V., et al., (1998) "A human fibro-sarcoma inhibits systemic angiogenesis and the growth of experimental metastases via thrombospondin-1", Proc.Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 95, 6343-6348).

Известно применение антагонистов интегрина _{v 3} для ингибирования ангиогенеза в способах ингибирования роста твердых опухолей путем уменьшения кровоснабжения твердой опухоли. См., например, патент США №5753230 (Brooks & Cheresh) и патент США №5766591 (Brooks & Cheresh), которые описывают применение _{v 3}-антагонистов, таких как синтетические полипептиды, моноклональные антитела и миметики _{v 3}, которые связываются с рецептором _{v 3} и ингибируют ангиогенез.

Кроме того, были описаны терапии с использованием слитого белка антитело-цитокин, которые стимулировали опосредованное иммунной реакцией ингибирование установленных опухолей, таких как метастазы карциномы. Например, цитокин интерлейкин 2 (IL-2) был слит с тяжелой цепью моноклонального антитела, иммунореактивного, в двух отдельных слитых белках, с ассоциированными с опухолью антигенами, адгезивной молекулой эпителиальных клеток (Ер-САМ, KSA, KSl/4-антигеном) или дисиалоганглиозидом GD₂, с использованием антител KS1/4 и ch14.18, соответственно, с образованием слитых белков chl4.18-IL-2 и KS1/4-IL-2, соответственно. См., например, патент США №5650150 (Gillies).

Идентификация специфических для сосудистой сети ингибиторов ангиогенеза, которые являются синергическими с терапиями, специфически направленными на компартмент опухоли, позволит разработать оптимально эффективное лечение рака.

Ангиогенез характеризуется инвазией, миграцией и пролиферацией эндотелиальных клеток - процессом, который зависит от клеточных взаимодействий с компонентами внеклеточного матрикса. В этом контексте было показано, что эндотелиальный адгезивный рецептор интегрина _{v 3} играет ключевую роль, обеспечивая специфическую для сосудистой сети мишень для стратегий антиангиогенного лечения (Brooks, P.С., Clark, R.A. & Cheresh, D.A. (1994) "Requirement of vascular integrine alpha v beta 3 for angiogenesis". Science, 264, 569-571; Friedlander, M., et al., (1995) "Definition of two angiogenic pathways by distinct alpha v integrins". Science, 270, 1500-1502). Необходимость в васкулярном интегрине _{v 3} в ангиогенезе была продемонстрирована на нескольких моделях in vivo, где генерирование новых кровеносных сосудов трансплантированными опухолями человека полностью ингибировалось системным введением либо пептидных антагонистов интегрина _{v 3}, либо анти- _{v 3}-антитела LM609 (Brooks, P.С., et al., (1994) Science, supra; Brooks, P.C., et al., (1994) "Integrin alpha v beta 3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels". Cell, 79, 1157-1164). Мышиная гибридома LM609 была депонирована в Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС, Rockville, MD, USA) как Международном хранилище, согласно Будапештскому договору, и ей было присвоено название АТСС НВ 9537 15 сентября 1987 года. Такие антагонисты блокируют лигирование интегрина _{v 3}, что стимулирует апоптоз пролиферативных ангиогенных васкулярных клеток и тем самым нарушает созревание вновь образующихся кровеносных сосудов - событие, существенное для пролиферации опухолей.

Васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF) был идентифицирован в качестве селективного ангиогенного фактора роста, который может стимулировать митогенез эндотелиальных клеток. Биопсии опухолей человека проявляют повышенную экспрессию мРНК VEGF злокачественными клетками и мРНК рецептора VEGF в соседних эндотелиальных клетках. Экспрессия VEGF, по-видимому, является наивысшей в участках опухолей, смежных с неваскулярными зонами некроза (см. обзор Thomas et al., (1996) "Vascular Endothelial Growth Factor, a Potent and Selective Angiogenic Agent", J.Biol.Chem., 271(2): 603-606). Эффективная противоопухолевая терапия может использовать направленные на рецептор VEGF моноклональные антитела для ингибирования ангиогенеза. (Witte L. et al., (1998) "Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor-2 (Flk1/KDR) as an antiangiogenic therapeutic strategy", Cancer Metastasis Rev., 17(2): 155-161.

Основное препятствие для эффективного лечения диссеминированных злокачественных поражений включает в себя минимальное остаточное заболевание, характеризующееся микрометастазами, которые не имеют хорошо развившегося кровоснабжения для доставки терапевтических веществ. В этой связи новая иммунотерапевтическая стратегия с использованием специфических в отношении опухолевого компартмента моноклональных антител оказалась эффективной для направления цитокинов в микроокружение опухоли. Это достигалось использованием рекомбинантных слитых белков антитело-цитокин, генерируемых для сохранения уникальной способности опухолеспецифического нацеливания моноклональных антител и иммуномодуляторных функций цитокинов. Применение слитого белка антитело-IL-2 для направления IL-2 в опухолевый компартмент индуцировало активацию эффекторных клеток, проникающих в микроокружение опухоли, и приводило к эффективному уничтожению зарегистрированных микрометастазов в трех различных моделях опухолей сингенных мышей (Becker, J.C., et al., (1996) "Т cell-mediated eradication of murine metastatic melanoma induced by targeted interleukin 2 therapy", J.Exp.Med., 183, 2361-2366; Xiang, R., et al., (1997) "Elimination of established murine colon carcinoma metastases by antibody-interleukin 2 fusion protein therapy", Cancer Res., 57, 4948-4955; Lode, H.N., et al., (1998) "Natural killer cell-mediated eradication of neuroblastoma metastases to bone marrow by targeted interleukin-2 therapy", Blood, 91, 1706-1715). Будучи вполне эффективным на ранних стадиях метастазирования опухоли, этот направленный на опухолевый компартмент подход мог задерживать рост метастазов только на более поздних стадиях роста опухоли, характеризующихся полностью развитым васкулярным компартментом. Здесь авторы задались вопросом, есть ли комплементарное преимущество в специфической васкулярной и направленной на компартмент опухоли стратегий лечения и являются ли они синергичными при использовании в последовательной или одновременной комбинациях.

Это было исследовано на трех моделях опухолей сингенных мышей рака ободочной кишки, меланомы и нейробластомы, причем последняя характеризовалась спонтанными метастазами в печени. Все три модели проявляют близкое сходство с этими заболеваниями у человека. Модели метаномы и нейробластомы экспрессируют дисиалоганглиозид GD2, который, как установлено, является ассоциированным с опухолью антигеном при таких нейроэктодермальных злокачественных поражениях (Irie, R.F., Matsuki, Т. & Morton, D.L. (1989) "Human monoclonal antibody to ganglioside GM2 for melanoma treatment". Lancet, 1, 786-787; Handgretinger, R., et al., (1995) "A phase I study of human/mouse chimeric antiganglioside GD2 antibody chl4.18 in patients with neuroblastoma", Eur.J.Cancer, 31A, 261-267), а модель рака ободочной кишки характеризуется экспрессией адгезивной молекулы эпителиальных клеток (Ер-САМ, KSA, KSl/4-антигена), молекулы-мишени, успешно используемой для пассивной иммунотерапии у людей (Riethmuller G., et al., (1994) "Randomised trial of monoclonal antidody for adjuvant therapy of resected Duke's С colorectal carcinoma". Lancet, 343, 1177-1183). Эти антигены специфически очерчивают компартмент опухоли на данных моделях при нацеливании на них слитых белков антитело-интерлейкин-2 с химерным человек/мышь анти-GD2-антителом (ch14.18-IL-2) (Gillies, S.D., et al., (1992) "Antibody-targeted interleukin 2 stimulates T-cell killing of autologous tumor cells", Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.), 892, 1428-1432) и гуманизированным анти-Ер-САМ (анти-KSA, анти-KS1/4-антиген) антителом KS1/4-I1-2 (Xiang, R., et al., (1997) supra; Gillies, S., et al., (1998) "Antibody-IL-12 fusion proteins are effective in SCID mouse models of prostate and colon carcinoma metastases", J.Immunol., 160, 6195-6203). Васкулярный компартмент этих моделей опухолей, как описано для нескольких моделей животных, определяется экспрессией интегрина _{v 3} на вновь образуемых кровеносных сосудах (Brooks, P.С., et al., (1994) supra). Данные, представленные здесь, демонстрируют синергическую эффективность одновременного и последовательного лечений, специфически направленных на опухолевый и васкулярный компартменты первичных опухолей и отдаленных метастазов. Механизм этого синергизма обеспечивается уменьшением образования кровеносных сосудов и увеличением воспаления только у животных, подвергнутых этой комбинированной терапии. Эти наблюдения придают особое значение полезному эффекту комбинирования антиангиогенного подхода с опухолеспецифическим противоопухолевым иммунотерапевтическим подходом.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к способу обработки опухолевой клетки у пациента, нуждающегося в таком лечении, предусматривающему введение указанному пациенту ингибирующего пролиферацию опухолевых клеток количества ингибирующего ангиогенез агента и противоопухолевого иммунотерапевтического агента. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток может включать в себя ингибирование роста опухолевых клеток в существующей опухоли или метастазах опухоли, ингибирование образования дополнительных опухолевых метастазов и даже смерть опухолевых клеток. Ингибирующий ангиогенез агент и противоопухолевый иммунотерапевтический агент могут вводиться по существу одновременно или также последовательно.

В одном варианте данное изобретение описывает способ лечения опухоли или опухолевых метастазов у пациента введением пациенту комбинации по меньшей мере одного ингибирующего ангиогенез агента и по меньшей мере одного противоопухолевого иммунотерапевтического агента. Эффективное ингибирование пролиферации опухолевых клеток у указанного пациента может быть достигнуто таким образом.

Пациент может получать вышеуказанные терапевтические композиции до, во время или после хирургического вмешательства по удалению всей опухоли или части опухоли. Введение может выполняться посредством прямой иммерсии; системной или локализованной внутривенной (i.v.), внутрибрюшинной (i.p.), подкожной (s.с.), внутримышечной (i.m.) инъекции или прямой инъекции в массу опухоли; и/или пероральным введением подходящих композиций.

Ингибирующий ангиогенез агент, пригодный для применения в способах данного изобретения, является агентом, который может ингибировать образование новых кровеносных сосудов (реваскуляризацию) или увеличение существующих капиллярных сетей в ткани вблизи опухолевой клетки. Подходящими ингибирующими ангиогенез агентами могут быть пептиды с ингибирующей ангиогенез активностью, такие как ассоциированный с опухолью антиген PSA. Другими подходящими ингибирующими ангиогенез агентами могут быть антагонисты VEGF-ассоциированного ангиогенеза, например, антагонисты рецептора VEGF на поверхности клеток. Предпочтительным ингибирующим ангиогенез агентом является антагонист связывания интегрина _{v 3} с клетками. Антагонистом _{v 3} для применения в способах данного изобретения является антагонист, который может ингибировать ангиогенез в ассоциированной с опухолью или с опухолевыми метастазами ткани при введении в ткани или клетки-мишени. Такие антагонисты могут быть уникальными линейными или циклическими полипептидами, линейными или цикло-RGD-содержащими полипептидами, антителами или меметиками _{v 3} которые связываются с рецептором _{v 3} и ингибируют ангиогенез.

Если антагонист _{v 3} представляет собой антитело, предполагается, что это антитело может быть поликлональным, моноклональным антителом или их антигенсвязывающим фрагментом, имеющим антигенсвязывающую специфичность в отношении _{v 3} или рецептора _{v 3}. Предпочтительным моноклональным антителом, которое связывается с интегрином _{v 3}, является моноклональное антитело, идентифицированное как LM609 (АТСС НВ 9537).

Предпочтительным ингибирующим ангиогенез агентом является полипептид, который является антагонистом рецептора _{v 3}, который может ингибировать рецептор интегрина на клетках-мишенях. Наиболее предпочтительным вариантом антагониста _{v 3} является синтетический RGD-содержащий пептид цикло(RGDfN-MeV) (SEQ ID NO:11) и т.п. Циклические пептиды этого общего типа описаны в патенте США №5262520 (Plow et al.). He содержащие RGD пептиды описаны в патенте США №5780426 (Palladino et al.).

Противоопухолевый иммунотерапевтический агент, пригодный для применения в способах данного изобретения, представляет собой иммунотерапевтический агент, который содержит клеточный эффекторный компонент, соединенный с компонентом, направленным на ассоциированный с опухолью антиген. Подходящие клеточные эффекторные компоненты могут включать в себя цитотоксичные химикалии, цитотоксические радиоактивные изотопы и агенты передачи клеточных сигналов, такие как цитокины.

Подходящими нацеленными на опухоль компонентами являются полипептидные цепи, которые связываются с ассоциированными с опухолью антигенами, присутствующими на опухолевой клетке или в окружающем ее тканевом матриксе, такие как цепи белков-рецепторов или цепи иммуноглобулинов.

Ассоциированные с опухолью антигены, которые могут быть использованы в качестве мишеней иммунотерапевтических агентов, включают в себя ассоциированный с опухолью антиген, выбранный из группы, состоящей из AFP, СА 125, СЕА, CD19, CD20, CD44, CD45, EGF-рецептора, GD₂, GD₃, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), IL-2-рецептора, Lewis-Y, Lewis-X (CD 15), ассоциированного с меланомой протеогликана MCSP, PSA и рецептора трансферрина.

Предпочтительный иммунотерапевтический агент имеет эффекторный компонент, который представляет собой полипептид цитокина, соединенный с направляющим компонентом, который представляет собой полипептидную цепь иммуноглобулина (Ig). Полипептидная цепь Ig содержит вариабельную область, которая связывается с ассоциированным с опухолью антигеном. Предпочтительно, чтобы указанная цепь иммуноглобулина при объединении с подходящей комплементарной цепью (т.е. тяжелая цепь комплементарна легкой цепи) определяла активный сайт антитела, специфичный в отношении ассоциированного с опухолью антигена.

Направленная на опухоль часть Ig иммунотерапевтического агента может содержать всю аминокислотную последовательность цепи иммуноглобулина или по меньшей для мере ее фрагмент, содержащий часть данного белка, специфичную в отношении связывания антигена. Таким образом, подходящая цепь полипептида Ig будет иметь по меньшей мере вариабельную область Ig, специфичную в отношении ассоциированного с опухолью антигена.

Антитело и полипептидные цепи из него, пригодные для применения в способах данного изобретения, будут иметь аминокислотную последовательность, которая может происходить от любого млекопитающего. В случае, когда такой белок антитела происходит от млекопитающего, иного, чем предполагаемый пациент, могут быть использованы белковые фрагменты данного антитела, такие как F(ab')₂, Fab, Fv или сконструированный, содержащий единственную цепь Fv, белок антитела. Чтобы дополнительно уменьшить антигенность данного белка антитела, можно модифицировать аминокислотную последовательность данного антитела, чтобы сделать данный белок более сходным с нормальными компонентами антител пациента. Например, аминокислотные последовательности моноклонального мышиного антитела могут быть модифицированы различными способами для гуманизирования данного антитела, чтобы сделать его более сходным с антителами человека для введения пациентам.

Альтернативно, антитело может быть человеческого происхождения (генетически кодируемое генами Ig человека), но продуцироваться в трансгенном животном, трансформированном для экспрессии генов Ig человека вместо его собственных нативных генов Ig. Например, могут быть получены генной инженерией (сконструированы) трансгенные мыши, которые экспрессируют ДНК человеческого происхождения, кодирующую белки Ig человека. Получение моноклонального антитела из таких трансгенных мышей приведет к мышиным В-клеточным гибридомам, экспрессирующим ДНК человека, кодирующую антитела, имеющие аминокислотные последовательности человеческого происхождения. Это значительно уменьшит иммуногенность таких антител для использования в лечении человека.

Для лечения человека предпочтительными антителами для использования в способе заявленного изобретения являются гуманизированное моноклональное антитело chl4.18 против ассоциированного с опухолью антигена GD2 и моноклональное антитело KS1/4 против ассоциированного с опухолью антигена KS1/4 (также известного как Ер-СДМ и KSA).

Компонент клетки-эффектора иммунотерапевтического агента, пригодный для применения в способах, композициях и наборах данного изобретения, является цитокином, выбранным из группы, состоящей из BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, gamma-IP-10, IFN alpha, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1 - МСР-3, M-CSF, MIF, MIP-lalpha, MIP-1beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alpha, TGF beta, TNF alpha, Тро и VEGF. Подходящий цитокин, который является хемокином, может быть выбран из группы, состоящей из С10, EMF-1, ENA-78, эотаксина, GCP-2, НСС-1, 1-309, IL-8, IP-10, лимфотактина, MCP-1, МСР-2, МСР-3, MGSA, MIG, MIP-lalpha, MIP-lbeta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 и SDF-1. Цитокиновая часть вышеуказанного иммунотерапевтического агента может быть полной аминокислотной последовательностью цитокинового белка или фрагментом такого слитого белка, достаточным для индукции цитокин-специфичесого биологического ответа.

В предпочтительном варианте цитокиновая часть иммунотерапевтического агента имеет биологическую активность IL-2.

В иммунотерапевтическом агенте, содержащем цитокиновый полипептид, соединенный с полипептидом Ig, подходящее сочленение между полипептидной цепью цитокина и полипептидной цепью Ig включает в себя прямую полипептидную связь, сочленение, имеющее полипептидный линкер между указанными двумя цепями, или другую химическую связь между цепями, включающую в себя использование биотинилирования и комплекса авидин-биотин. Предпочтительным сочленением является либо прямая, либо отделенная полипептидным линкером полипептидная связь. Прямая связь делает возможной экспрессию иммунотерапевтического агента в виде единого слитого белка из клетки-хозяина, трансформированной подходящим экспрессирующим вектором, кодирующим иммунотерапевтический агент в виде слитого белка.

Таким образом, предпочтительным иммунотерапевтическим агентом для применения в способах данного изобретения является бифункциональный слитый белок, имеющий цитокиновый компонент и направляющий на ассоциированный с опухолью антиген компонент, где направляющим компонентом является полипептидная цепь Ig, которая имеет специфичность в отношении ассоциированного с опухолью антигена. Примеры таких предпочтительных иммунотерапевтических агентов включают в себя направленный на GD2 слитый белок chl4.18-IL2 и направленный на ассоциированный с опухолью антиген KS1/4 (также известный как Ер-САМ и KSA) слитый белок KS1/4-IL2.

Альтернативно, другие иммунотерапевтические агенты, пригодные для применения в способах, композициях и наборах данного изобретения, могут иметь клеточный эффекторный компонент, который является цитотоксическим агентом. Подходящим цитотоксическим агентом является агент, который оказывает прямое цитотоксическое действие на опухолевую клетку, т.е. иммунотоксины, радиоактивные изотопы, цитотоксичные лекарственные средства и т.п. Подобно цитокиновым иммунотерапевтическим агентам, описанным выше, цитотоксические пептиды могут быть соединены с направляющим на ассоциированный с опухолью антиген полипептидом Ig для образования слитого белка либо непосредственно, либо через линкерный пептид или цепь. Может быть использована химическая связь химических цитотоксинов с направляющими цепями Ig. Могут быть также сконструированы несущие радиоактивный изотоп цепи антител.

Другой аспект данного изобретения относится к терапевтической композиции, содержащей ингибирующий ангиогенез агент и противоопухолевый иммунотерапевтический агент. Предпочтительно, противоопухолевый иммунотерапевтический агент направлен на опухолевые клетки или клетки опухолевых метастазов, благодаря наличию компонента, специфичного в отношении ассоциированного с опухолью антигена, сочлененного с клеточным эффекторным компонентом. В предпочтительной терапевтической композиции данного изобретения противоопухолевый иммунотерапевтический агент является бифункциональным белком, имеющим эффекторный компонент, который является полипептидом цитокина, соединенным с направленным на опухоль компонентом, который является полипептидной цепью иммуноглобулина (Ig), где указанная Ig-цепь содержит вариабельную область, которая связывается с ассоциированным с опухолью антигеном.

Еще одним аспектом данного изобретения является набор для лечения опухоли или опухолевых метастазов. Данный набор включает в себя упаковку, содержащую ингибирующий ангиогенез агент, такой как антагонист _{v 3}, способный ингибировать ангиогенез в указанной опухоли или в указанных опухолевых метастазах; бифункциональный белковый компонент, имеющий цитокиновую активность и специфичность в отношении опухолевого антигена; и инструкции для лечения опухолевых клеток в опухолях и опухолевых метастазах. Данный набор может также включать в себя специальную этикетку, указывающую на применение компонентов данного набора для лечения опухолей или опухолевых метастазов.

Краткое описание чертежей

Предпочтительные варианты данного изобретения описаны ниже со ссылкой на следующие сопутствующие чертежеи.

На фигуре 1 представлено графическое изображение действия объединенной терапии антиангиогенным антагонистом интегрина _v и специфически направленной против опухолевого компартмента иммунотерапии со слитыми белками антитело-IL-2 на первичных опухолях. На фигуре 1А изображены результаты, полученные на первичных опухолях, индуцированных подкожной инъекцией (2 10⁶) нейробластомы NXS2. На фигуре 1В изображены результаты, полученные на первичных опухолях, индуцированных подкожной инъекцией (2 10⁶) карциномы ободочной кишки СТ26-KSA. На фигуре 1С изображены результаты, полученные на первичных опухолях, индуцированных подкожной инъекцией (2 10⁶) клеток меланомы B78-D 14.

На фигуре 2 изображено в виде диаграмм действие объединенной антиваскулярной и противоопухолевой терапий на васкуляризацию и противоопухолевую иммунную реакцию. На фигуре 2А изображена плотность кровеносных сосудов первичных опухолей после обработки васкулярного и опухолевого компартмента либо антагонистом интегрина _v, либо слитым белком chl4.18-IL-2, либо их комбинацией (*Р<0,001, Т-критерий Стьюдента). На фигуре 2В показана степень инфильтрации лейкоцитами первичных опухолей после обработки васкулярного и опухолевого компартментов, соответственно (*Р<0,001, Т-критерий Стьюдента).

На фигуре 3 изображено в виде диаграмм действие последовательной комбинации антиангиогенного антагониста интегрина _v и специфичной в отношении опухолевого компартмента иммунотерапии со слитым белоком антитело-IL-2 на спонтанных метастазах нейробластомы в печени. Число спонтанных метастазов в печени определяли макроскопическим подсчетом очагов в печени (n=8) (**Р<0,01, критерий суммы рангов Уилкоксона).

На фигуре 4 изображено в виде диаграмм действие по существу одновременной комбинации антиангиогенного антагониста интегрина _v и специфичной в отношении опухолевого компартмента иммунотерапии со слитым белком антитело-IL-2 на спонтанных метастазах нейробластомы в печени. Показаны результаты обработки интегрином или антагонистом (17,5 мкг/ч) и опухолеспецифичным слитым белком chl4.18-IL-2 (5 мкг 5), инициированной до (фигура 4А) или после (фигура 4В) удаления первичной опухоли. Спонтанные метастазы в печени определяли макроскопическим подсчетом очагов в печени (n=8) (**Р<0,01, критерий суммы рангов Уилкоксона).

Подробное описание изобретения

Супрессия и ликвидация первичных опухолей и отдаленных метастазов является основной задачей альтернативных стратегий лечения рака, таких как ингибирование ангиогенеза и направленная иммунотерапия.

В настоящее время было обнаружено, что существует неожиданный синергизм в эффективности при обработке опухолевых клеток в опухоли и опухолевых метастазах комбинированным применением двух терапевтических способов воздействия, называемых здесь (1) (антиангиогенной) терапией ингибирования ангиогенеза и (2) противоопухолевой иммунотерапией. В частности, описана объединенная терапия антагонистом _v и противоопухолевая терапия слитым белком антитело против опухолевого антигена/цитокин.

Было обнаружено, что имеет место синергизм между двумя уникальными монотерапиями, направленными против васкулярного и опухолевого компартментов; соответственно, специфического против опухолевой сосудистой сети антиангиогенного антагониста _v и слитых белков опухолеспецифическое антитело-интерлейкин-2.

Одновременная и последовательная комбинация этих монотерапий эффективно ликвидировала спонтанные метастазы в печени в слабоиммуногенной сингенной модели нейробластомы. В противоположность этому, контроли, подвергнутые монотерапии либо антиангиогенным антагонистом интегрина _v, либо слитыми белками антитело-IL-2, были только частично эффективными при применяемых уровнях доз.

Кроме того, одновременная обработка антагонистом интегрина _v и слитыми белками опухолеспецифическое антитело-IL-2 индуцировали драматический регресс (обратное развитие) в трех моделях опухолей сингенных мышей, т.е. меланоме, карциноме ободочной кишки и нейробластоме. Однако каждый агент, используемый отдельно в качестве монотерапии, индуцировал лишь задержку роста опухолей.

Противоопухолевая реакция сопровождалась одновременным 50%-ным уменьшением плотности опухолевых кровеносных сосудов и пятикратным увеличением воспалительных клеток в микроокружении опухолей. Впоследствии некроз опухолей был продемонстрирован только у животных, получающих комбинированную терапию, но не в том случае, когда каждый агент применяли в виде монотерапии. Эти результаты показывают, что эти синергические способы лечения обеспечивают новый и эффективный инструмент для будущей терапии метастазирующего рака.

В данном изобретении описаны способы лечения опухолей и опухолевых метастазов, терапевтические композиции и терапевтические наборы (упакованные системы), применимые на практике для описанных здесь синергических терапевтических воздействий.

1. Терапевтические композиции

Описаны разнообразные терапевтические композиции для применения на практике способов данного изобретения. Данные композиции включают в себя (антиангиогенные) ингибирующие ангиогенез реагенты, такие как антагонисты _{v 3}, и противоопухолевые агенты, такие как слитые белки антитело против опухолевого антигена/цитокин, отдельно или в различных комбинациях.

А. Ингибитор ангиогенеза

Ингибиторы ангиогенеза, которые ингибируют ангиогенез в обработанных ими тканях, могут быть использованы в композициях и способах данного изобретения. Предпочтительным ингибитором ангиогенеза является антагонист _v и, в частности, антагонист _{v 3}. Ингибирующий ангиогенез (антиангиогенный) антагонист _{v 3} может быть пептидом, RGD-содержащим пептидом, анти- _{v 3}-антителом, анти- _{v 3}-рецептор-антителом или _{v 3}-миметиком. Примеры антагонистов _{v 3} описаны в патенте США №5753230 (Brooks & Cheresh) и патенте США №5766591 (Brooks & Cheresh), описания которых, касающиеся получения и применения антагониста _{v 3}, специально включены здесь в качестве ссылки.

Предпочтительными антагонистами являются RGD-содержащие пептиды, такие как циклический пептид цикло(RGDfN-MeV) (SEQ ID NO:11). Дополнительные антагонисты были описаны в литературе, в том числе органические миметики и не содержащие RGD циклические пептиды, которые функционируют как антагонисты _{v 3}. См., например. Brooks et al. International Publication No. WO 97/45137, (PCT/US97/09158).

Тесты для идентификации антагониста _{v 3}, пригодного для применения в качестве антагониста, описаны в цитированных патентах США, и, следовательно, предполагается, что альтернативные антагонисты могут быть легко идентифицированы для применения на практике данного изобретения.

Подходящее моноклональное анти- _{v 3}-антитело может быть модифицировано для включения его антигенсвязывающих фрагментов, в том числе F(ab')₂, Fab и сконструированных Fv или одноцепочечного антитела (SCA). Способы получения таких фрагментов известны в данной области (см., например, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques/ Academic Press, 1996). Способы данного изобретения, описывающие применение антител, также включают в себя подходящую модификацию целого антитела до его антигенсвязывающих фрагментов. Одно подходящее моноклональное антитело идентифицировано как LM609 (АТСС НВ 9537).

Было показано, что другие антагонисты _{v 3} являются эффективными в ингибировании ангиогенеза и могут быть пригодными для применения в способах данного изобретения. Например, химические антагонисты рецептора, такие как (S)-10,11-дигидро-3-[3-(пиридин-2-иламино)-1-пропилокси]-5Н-дибензо[а,d]циклогептен-10-уксусная кислота (известная как SB-265123), испытывали в различных модельных системах млекопитающих (см., например, Keenan RM et al., (1998) Bioorg.Med.Chem.Lett., 8(22): 3171-3176; Ward KW et al., (1999) Drug Metab.Dispos., 27(11): 1232-1241).

Васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF) был идентифицирован в качестве селективного ангиогенного фактора роста. Таким образом, альтернативный или дополнительный ингибирующий ангиогенез агент может быть ингибитором активности VEGF, достаточным для ингибирования ангиогенного роста. Такой ингибитор мог бы быть конкурентным ингибитором или VEGF-связывающей/инактивирующей молекулой, или антагонистом рецептора VEGF. Например, возможными ингибиторами могли бы быть неангиогенный химический миметик VEGF для конкуренции за связывание с комплексом VEGF-мишень/рецептор, модифицированное неангиогенное производное VEGF, антитело, которое специфически связывает VEGF достаточно для ингибирования ангиогенной активности, или, возможно, другой специфический белок, который связывает VEGF (такой как выделенный рецепторный белок VEGF), или антитело, которое связывает рецептор VEGF и блокирует взаимодействие с VEGF.

Другие соединения были идентифицированы на основе способности соединения ингибировать ангиогенез, например, выделенный ассоциированный с опухолью антиген PSA.

В. Противоопухолевый иммунотерапевтический агент

Способы и композиции для применения в таких способах данного изобретения предполагают объединенное введение по меньшей мере одного (антиангиогенного) ингибирующего ангиогенез терапевтического агента по меньшей мере с одним противоопухолевым иммунотерапевтическим агентом. Предпочтительный противоопухолевый иммунотерапевтический агент объединяет направленный на опухоль компонент с компонентом клетки-эффектора, таким как цитокин, иммунотоксин, радиоактивный агент или т.п. Направленный на опухоль компонент предпочтительно содержит по меньшей мере антигенсвязывающую часть антитела, направленного против ассоциированного с опухолью антигена. В одном предпочтительном варианте эффекторный компонент представляет собой цитокин.

а) Ассоциированные с опухолью антигены

Ассоциированный с опухолью антиген является мишенью, при помощи которой иммунотерапевтический агент, применяемый в способах, композициях и наборе данного изобретения, в конечном счете направляется на опухолевую клетку. Ассоциированные с опухолью антигены считаются в данной области коррелирующими с определенными типами рака. В подавляющем большинстве случаев ассоции