Новая кристаллическая форма 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил) бензо[b]тиофена гидрохлорида

Новая кристаллическая форма 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил) бензо[b]тиофена гидрохлорида

Реферат

 

Данное изобретение относится к новой кристаллической форме 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофена гидрохлорида. Соединение может быть использовано при ингибировании заболеваний, связанных с недостаточностью эстрогена, включая сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемию и остеопороз; и ингибировании патологических состояний, таких как эндометриоз, фиброз матки, эстроген-зависимый рак (включая рак молочной железы и матки), рак простаты, доброкачественная гиперплазия эндометрия, расстройства ЦНС, включая болезнь Альцгеймера. Соединение получают путем перекристализации арзоксифена из смеси изопропанола и воды. Полученный продукт хорошо кристализуется. 2 c. и 4 з.п. ф-лы, 12 табл., 5 ил.

6-Гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофен гидрохлорид (арзоксифен) в самом общем виде был впервые описан в Патенте США №5510357 и подробно рассмотрен в Патенте США №5723474 (‘474) и в Заявке на Европейский Патент 0729956. Арзоксифен представляет собой нестероидный смешанный антагонист/агонист эстрогена, между прочим, используется для снижения холестерина сыворотки, ингибирования гиперлипедимии, остеопороза, эстроген-зависимых раков, включая рак молочной железы и матки, эндометриоза, расстройств ЦНС, включая болезнь Альцгеймера, пролиферации клеток гладких мышц аорты и рестеноза.

Точнее, арзоксифен является полезным и в настоящее время применяется в клиниках для лечения рецептор-позитивного метастатического рака молочной железы, адъювантного лечения рецептор-позитивных пациентов после соответствующей системной и местной терапии; снижения распространения инвазивного и неинвазивного рака молочной железы и протоковой карциномы in situ (DCIS). Арзоксифен также используется в комбинации с лучевой терапией, ингибиторами ароматазы, аналогами LHRH (лютеинизирующий гормон – релизинг - гормон) и ингибиторами ацетилхолинэстеразы (AchE).

Исследования с помощью методов рентгеновской порошковой дифракции (XRD), термогравиметрического анализа (TGA), метода протонного ядерного магнитного резонанса (¹Н ЯМР) и метода Карла Фишера (Karl Fischer; KF) основной массы арзоксифена, выделенного согласно способам, изложенным в ‘474, указывают, что названный материал является гидратированным, слабо кристаллизующимся и содержит в своей кристаллической решетке различные количества органического летучего компонента (этилацетата).

Обычно для приготовления лекарственных средств слабо кристаллизующиеся вещества менее желательны, чем высоко кристаллизующиеся вещества. Кроме того, вообще нежелательно получение фармацевтических средств, содержащих значительные количества органического растворителя (например, этилацетата), вследствие возможной токсичности растворителя для реципиента и изменения эффективности фармацевтического средства в результате действия растворителя.

Хотя арзоксифен, полученный согласно способам, предложенным в ‘474, можно использовать как фармацевтическое средство, крайне желательны и полезны поиски еще и кристаллической формы арзоксифена, которая не содержала бы органический растворитель в кристаллической решетке и которую можно воспроизводить и эффективно получать в коммерческом масштабе.

Данное изобретение относится к новой нестехиометрической гидратированной форме 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофена гидрохлорида (F-III), имеющей рентгеновскую дифрактограмму, которая содержит следующие пики: 4,6±0,2; 7,8±0,2; 9,3±0,2; 14,0±0,2; 17,6±0,2; 20,8±0,2 и 24,3±0,2° при 2, полученные при 25±2°С и 35±10% относительной влажности (RH) из медного источника излучения.

Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей F-III; один или больше фармацевтических носителей, разбавителей или наполнителей; и необязательно эстроген, необязательно прогестин, необязательно ингибитор ароматазы, необязательно аналог LHRH и необязательно ингибитор ацетилхолинэстеразы (AChE).

К тому же данное изобретение относится к способам применения F-III для ингибирования патологических состояний, таких как фиброз матки, эндометриоз, пролиферация клеток гладких мышц аорты, рестеноз, рак молочной железы, рак матки, рак простаты, доброкачественная гиперплазия простаты, разрежение кости, остеопороз, сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемия, расстройства ЦНС и болезнь Альцгеймера, а также применения F-III в производстве лекарственных средств для ингибирования таких заболеваний.

Данное изобретение также относится к способам применения F-III для активации холин-ацетилтрансферазы (ChAT) и применения F-III для производства лекарственного средства для активации этого фермента.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 является типичным изображением дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC)/TGA S-II.

Фиг.2 является типичным изображением DSC/TGA F-I.

Фиг.3 является типичным изображением DSC/TGA F-III.

Фиг.4 изображает изотермы сорбции влаги для F-I и F-III.

Фиг.5 изображает десольватацию S-II как функцию времени и температуры высушивания.

Детальное описание изобретения

Основная масса арзоксифена, полученного по методу, изложенному в ‘474 (пример 41, кристаллизация из смеси этанола и этилацетата, фильтрование и высушивание фильтровального осадка под вакуумом до постоянного веса при комнатной температуре), была охарактеризована методом XRD и, как было обнаружено, является слабо кристаллизующимся веществом. Методом ¹Н ЯМР показали, что основная масса вещества содержит 6% этилацетата.

Предложенный в ‘474 способ кристаллизации впоследствии модифицировали с тем, чтобы этанол добавлять в суспензию неочищенного арзоксифена в кипящем этилацетате. После охлаждения и фильтрования под вакуумом, твердое вещество, полученное в результате этого модифицированного способа, представляет собой высоко кристаллический смешанный сольват арзоксифена в смеси этилацетат/вода (в дальнейшем упоминаемый как S-II), который, как было обнаружено позднее, является исходным материалом для F-I (другой нестехиометрической гидратированной кристаллической формы арзоксифена).

F-I может быть получен удалением этилацетата из кристаллической решетки S-II с помощью вакуумной сушки/отжигания S-II при повышенных температурах. Время и температура, необходимые для отжига S-II, чтобы получить F-I, изменяются от партии к партии, но обычно составляют порядка 5 дней приблизительно при 100°С. Для осуществления превращения S-II в F-I с помощью этого метода требуются высокие температуры, поскольку при суспендировании S-II в воде при температуре окружающей среды или хранении образца при 98% RH в течение 3 недель не происходит никакого превращения в F-I. Кроме того, высушивание S-II в конвекционной печи при высоких температурах не десольватирует никакой материал, позволяя предположить, что вакуум также необходим для вытягивания этилацетата из решетки S-II. Предпочтительно F-I быстро получают при температуре окружающей среды кристаллизацией арзоксифена (или его любой полиморфной модификации/сольвата) из тетрагидрофурана.

Согласно данному изобретению особенно предпочтительной формой арзоксифена является F-III. F-III легко получают и выделяют при температуре окружающей среды. При получении F-III для удаления низких уровней остаточного кристаллизационного растворителя требуются только умеренные условия сушки. Эти умеренные условия сушки соответственно приводят к получению твердого вещества с высокой степенью чистоты (то есть свободного от органического растворителя) и кристалличности и, таким образом, применение F-III устраняет появление токсичности, связанной с остаточным органическим растворителем и органическим растворителем кристаллической решетки. Кроме того, получение F-III оказывается простым и эффективным, то есть подходит для масштабного производства.

F-III легко получают и выделяют путем кристаллизации арзоксифена (или его любой полиморфной модификации/сольвата) из смеси изопропилового спирта (IPA) и воды при температуре окружающей среды. Обычно арзоксифен может быть суспендирован в смеси IPA и воды и нагрет с тем, чтобы растворить исходный материал арзоксифена. Как только достигается растворение, раствор оставляют для охлаждения до комнатной температуры, а затем далее до температуры между 0 и 5°С (с помощью ледяной бани или замораживания). После того как проходит достаточный для кристаллизации период времени, кристаллы можно собирать посредством вакуумного фильтрования и высушивания под вакуумом до постоянного веса, чтобы получить F-III с выходом более 80%.

Подходящий исходный материал для вышеупомянутой кристаллизации включает в себя S-II, F-I, арзоксифен, полученный способами, изложенными в ‘474, и его любую смесь, не ограничиваясь перечисленным. Неважно, какая форма арзоксифена окажется исходной, поскольку кристаллизация из IPA и воды, согласно описанным в заявке способам, дает в результате кристаллы F-III. Соотношение воды и IPA (объем:объем) обычно составляет приблизительно от 1:1 до 9:1. Более предпочтительно, соотношение оказывается между 2,5 и 5,6:1. Наиболее предпочтительно, когда соотношение оказывается между 3 и 5,6:1. После сбора кристаллов с помощью вакуумного фильтрования, перед высушиванием под вакуумом влажный осадок F-III может быть промыт охлажденной деионизированной водой. Кроме того, предпочтительно небольшое повышение температуры высушивания (около 50°С в течение от 12 до 24 часов). Для синтеза F-III в коммерческом масштабе может оказаться полезным внесение затравки кристаллизации F-III.

В предпочтительном способе F-III получают, выделяют и очищают одновременно с химическим удалением защитной группы 6-изопропилгидрокси из 6-изопропокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофена гидрохлорида (предшественник А). Реакция освобождения от защиты контролируется до полного удаления изопропильной защитной группы, и как только устанавливают, что удаление по существу завершено, продолжение реакции предпочтительно будет включать в себя кристаллизацию при условиях, которые обеспечивают F-III, обсуждаемый выше и ниже.

Способы получения предшественника А и удаления изопропильной группы можно обнаружить в Патенте США №5723474, рекомендации которого приведены в описании.

В другом предпочтительном способе F-III получают, выделяют и очищают одновременно с химическим восстановлением

S-оксида и химическим удалением защитной бензильной группы от 6-гидрокси из 6-бензилокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]-2-(4-метоксифенил)-бенз[b]тиофена-(S-оксида) (предшественник В). Реакции восстановления и удаления защиты контролируются до полного восстановления сульфоксида до сульфида и полного удаления бензилгидроксизащитной группы. Как только устанавливают, что восстановление/удаление в основном завершено, продолжение реакции предпочтительно будет включать в себя кристаллизацию при условиях, которые обеспечивают F-III, описанный в заявке. Способы получения предшественника В, удаления бензильной группы и восстановления 1-сульфоксида до соответствующего сульфида также можно найти в уже цитированном Патенте США №5723474.

Независимо от химии, используемой на стадиях удаления защиты и восстановления, кристаллизация арзоксифена из растворов IPA/вода впоследствии дает кристаллы F-III с высокой степенью чистоты.

Характеристика и дифференциация S-II, F-I и F-III

Для характеристики S-II, F-I и F-III применяются методы DSC/TGA и XRD. TGA часто используется для выявления различий между разными твердыми формами вещества, так как температура(ы), при которой происходят физические изменения в веществе, обычно является характеристикой полиморфа или сольвата. DSC представляет собой способ, который часто используют для скрининга соединений для образования полиморфной модификации и сольвата. Наконец, XKD является способом определения дальнего порядка в кристаллическом веществе.

Арзоксифен, полученный способами, изложенными в ‘474, дает рентгенограмму с низким отношением сигнала к фону и повышенной базовой линией, что указывает на слабо кристаллизующееся вещество. Поэтому сравнивают F-I и F-III с веществом (S-II), полученным с помощью вышеописанного модифицированного способа кристаллизации арзоксифена (добавление этанола в суспензию арзоксифена в кипящем этилацетате).

Типичные изображения DSC/TGA для S-II, F-I и F-III представлены на фиг.1, 2 и 3 соответственно. Изображение DSC для S-II показывает интенсивную эндотермическую реакцию, начинающуюся приблизительно при 62°С, соответствующую потере этилацетата и воды из решетки. Эндотермия, начинающаяся приблизительно при 152°С, представляет собой расплав. TGA-потеря массы приблизительно 2,5% происходит одновременно с первым превращением, тогда как оставшиеся 0,5% потери массы происходят вплоть до начала плавления, позволяя предположить, что некоторое количество молекул растворителя более прочно удерживается в решетке.

Изображение DSC для F-I демонстрирует интенсивную эндотермическую реакцию, начинающуюся приблизительно при 75°С, за которой следует вторая эндотермическая реакция, начинающаяся приблизительно при 155°С, соответствующая расплаву. Изображение TGA F-I показывает постоянную потерю 0,3% массы с последующей резкой потерей 1,5%, что вместе представляет собой дегидратацию решетки. Начало первого DSC превращения и соответствующая TGA потеря массы незначительно смещаются вследствие различий в скоростях нагревания. Первоначальная потеря массы представляет собой слабо удерживаемую воду гидратации, тогда как вторая потеря массы соответствует приблизительно 0,5 моля воды, присутствующей в решетке при очень низкой относительной влажности (ниже 5% - см. данные сорбции влаги).

Изображение DSC F-III представляет собой кривую интенсивной низкотемпературной эндотермической реакции приблизительно при 30°С с последующей второй полной, относительно слабой эндотермической реакцией, начинающейся приблизительно при 70°С, и конечное превращение, начинающееся приблизительно при 146°С, соответствующее расплаву. Резкая 1,5% потеря массы (~0,5 моля) в TGA, совпадающая с первой эндотермической реакцией, соответствует потере слабоудерживаемых молекул воды, тогда как дополнительная ~1,6% потеря массы при температуре выше 60°С представляет собой потерю более прочно удерживаемых молекул воды, то есть молекул, которые присутствуют при очень низкой относительной влажности. Потеря массы, наблюдаемая после 170°, соответствует разложению F-III.

Схемы XRD для F-I и F-III изображают острые пики и плоскую базовую линию, указывающие на высококристаллические вещества. Угловые положения пиков при 2 и соответствующие данные I/I₀ для типичных образцов F-I, F-III и S-II представлены в таблице 1. Хотя многие отражения интенсивности обычно находятся при подобных углах дифракции, каждая из форм дает особую порошковую рентгенограмму, указывая на четкие различия между S-II, F-I и F-III.

В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной полиморфной модификации относительные интенсивности дифракционных пиков могут изменяться вследствие предпочтительной ориентации, обусловленной такими факторами, как морфология кристаллов. Если имеется влияние предпочтительной ориентации, интенсивность пиков изменяется, однако характерные положения пиков полиморфной модификации не изменяются. См., например. The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995. Таким образом, на основании интенсивности пиков, а также положения пиков, F-III может быть идентифицирован по присутствию пиков при 4,6±0,2; 7,8±0,2; 9,3±0,2; 14,0±0,2; 17,6±0,2; 20,8±0,2 и 24,3±0,2° при 2, когда изображения были получены при 25±2°С и 35±10% относительной влажности из медного источника излучения.

Дальнейшая характеристика F-I и F-III

Проведены исследования гигроскопичности F-I и F-III. На фиг.4 представлены изотермы сорбции влаги для F-I и F-III. После исходной экспозиции образцов приблизительно до 5% RH происходит немедленное увеличение массы влаги на 1,5 и 1,7% для F-I и F-III соответственно эквивалентное приблизительно 0,5 моля воды. Обе формы демонстрируют непрерывную сорбцию влаги по всей зоне влажности, что является следствием включения молекул воды в решетку.

Различия в поглощении влаги двумя формами, вероятно, отражает количество воды, которое может быть заключено в двух решетках (то есть, величину доступного пространства решетки, которое может вместить молекулы воды). Отсутствие гистерезиса в изотермах сорбция-десорбция для F-I и F-III указывает, что кристаллические формы быстро уравновешиваются при любой данной влажности.

Профили сорбции влаги для F-I и F-III показывают, что эти формы по существу являются нестехиометрическими гидратами. При относительной влажности окружающей среды (около 50% RH) F-I содержит приблизительно 1,7% воды, соответствующей 0,5 молям воды, тогда как F-III сорбирует около 3,0% воды, что соответствует приблизительно 0,85 молям воды. Основная масса форм F-I и F-III быстро уравновешивается с атмосферой, так что содержание воды, определяемое с помощью аналитических методов, является отражением относительной влажности во время сбора данных. По данным DSC, выявляемые различия от партии к партии, вероятно, обусловлены образцами, гидратированными в различной степени вследствие хранения при разных условиях окружающей среды.

Получены рентгенограммы для образцов F-I и F-III, хранившихся при различной относительной влажности (0; 22; 50 и 80%). Когда увеличивается относительная влажность, происходит постепенное смещение первоначальных (0% RH) пиков F-III приблизительно при 13,8; 17,6; 18,0; 20,5% и 24,0° на 2, так же, как и незначительное смещение менее интенсивных пиков. Эти наблюдаемые изменения в рентгенограммах F-III указывают, что меняются размеры элементарной ячейки, вероятно, чтобы вместить слабоудерживаемые молекулы воды, когда увеличивается относительная влажность. Непрерывное смещение пиков в зависимости от влажности хорошо коррелирует с данными по сорбции влаги, о чем свидетельствует постепенное увеличение массы в пределах этой области RH, доказывая вариабельность образования гидрата.

Аналогичный эксперимент проведен с F-I, чтобы установить, будет ли оказывать изменение относительной влажности подобное действие на его решетку (0; 25; 52; 73 и 95% RH). Наблюдается очень незначительное смещение пиков 0% RH приблизительно при 7,7; 18,3; 18,5; 20,5; 20,8° при 2, когда увеличивается относительная влажность. Также оказалось, что пики приблизительно при 7,7; 20,8 и 24,1 становятся несколько более расширенными и менее разделенными при более высокой относительной влажности, указывая на то, что вода оказывается сорбированной в аморфных компонентах (или пластифицирует твердое вещество), особенно при 73 и 95% RH. Смещение пиков на рентгенограммах F-I менее драматично, чем наблюдаемое смещение пиков в случае экспонирования F-III при различной относительной влажности. Это позволяет предположить, что решетка F-I не подвергается растяжению и/или уплотнению, как решетка F-III.

Обнаружено, что F-I и F-III стабильны в пределах всей области относительной влажности, несмотря на способность F-III сорбировать почти вдвое больше воды. Установлено, что две формы имеют сравнимые размеры кристаллов, морфологию, растворимость в воде и скорости растворения.

Проведено исследование высушивания, чтобы проследить десольватацию S-II как функцию времени и температуры высушивания (см. фиг.5). Во время эксперимента по десольватации получены рентгенограммы для различных временных точек. Большинство пиков дифракции, полученных при исследовании десольватации S-II, оказываются с углами, подобными F-I, подтверждая, что решетки S-II и F-I очень схожи. Исчезновение пиков дифракции приблизительно при 6,8; 7,2 и 14,0° при 2 после только минимального высушивания позволяет предположить, что эти отражения могут быть отнесены к кристаллографическим плоскостям, вмещающим частичную плотность электронов молекул этилацетата.

Продолжительный отжиг под вакуумом сольватированного вещества при высоких температурах дает F-I. Полученный таким способом F-I показывает на рентгенограммах высокую степень кристалличности. Поэтому вещество, полученное кристаллизацией из раствора этанола и этилацетата с последующим высушиванием под вакуумом в течение только нескольких часов, как предложено в ‘474, проявляет очень низкую кристалличность, так как такой способ дает в результате частично десольватированный S-II.

F-I и F-III имеют некоторые преимущества перед вышеописанной формой арзоксифена предыдущего уровня техники. По сравнению с арзоксифеном, полученным с помощью способов, предложенных в ‘474, F-I и F-III являются более стабильными при температуре окружающей среды и поэтому оказываются более поддающимися фармацевтической обработке, то есть созданию дозированных композиций. Кроме того, F-I и F-III являются значительно более кристалличными, чем форма, описанная в ‘474. Кристаллические вещества обычно менее гигроскопичны и более стабильны (то есть менее склонны к химическому разрушению, сохраняют консистентные свойства), чем аморфные вещества, и поэтому являются более желательными для производства композиций. Кроме того, в отличие от формы арзоксифена, полученной способами, предложенными в ‘474, которая содержит в своей решетке этилацетат и воду, F-I и F-III содержат только воду.

Методы исследования

Измерения DSC проводили на приборах 2920 ТА, модулируемых DSC, присоединенных к тепловому анализатору 3100 и снабженных охлаждающей системой. Образцы (3-5 мг) нагревали в извитых алюминиевых резервуарах от 10 от 240°C при скорости нагревания 2°С/минуту.

Исследования TGA проводили на оборудовании 2050 ТА, термогравиметрическом анализаторе, присоединенном к тепловому анализатору 3100. Образцы (5-10 мг) нагревали в открытых резервуарах от 25 до 250°С при скорости нагревания 5°С/минуту.

Рентгенограммы получали на рентгеновском порошковом дифрактометре Siemens D5000, снабженном источником CuK, ( = 1,54056 ), и Kervex-детектором твердого состояния, работающим при 50 кВ и 40 мА. Каждый образец сканировали между 4о и 35о при 2. Образцы оставляли для уравновешивания по крайней мере в течение 30 минут при требуемой температуре и/или относительной влажности до сбора данных.

Измерения гигроскопичности производили для F-I и F-III, используя метод VTI следующим образом. Каждый образец высушивали под вакуумом при 60°С до тех пор, пока не прекратилось выявление дальнейшей потери массы, за это время опытная камера была доведена до 0% относительной влажности. Изотермы сорбции влаги получены при 25°С с использованием вакуумных рычажных весов VTI со шкалой, проградуированной в процентах влажности, при следующих условиях: величина пробы 10-15 мг, область адсорбции/десорбции 0-95% относительной влажности, шаг интервала 5%, промежуток времени между отборами проб 10 минут.

Следующие примеры иллюстрируют способы получения гидрата согласно изобретению. Эти примеры никоим образом не являются ограничивающими объем защиты этих способов и не должны быть так истолкованы.

Примеры

Пример 1

F-III из 6-изопропокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофена гидрохлорида

К раствору 6-изопропокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофена гидрохлорида (10 г, 18 ммоль) в хлористом метилене (100 мл) в атмосфере азота при от -10 до -20°С добавлен ВСl₃ (г) (4,23 г, 34 ммоль) со скоростью, которая поддерживает температуру реакции ниже -10°С. После окончания добавления реакционную смесь оставляли для перемешивания в течение дополнительных 2 часов. К реакционной смеси медленно был добавлен изопропиловый спирт (IPA, 12,35 мл, 167 ммоль) при температуре ниже -10°С, а перемешивание продолжали в течение 30 минут. Отдельную колбу заполняли 100 мл воды и охлаждали на ледяной бане приблизительно до 0°С. Раствор продукта переносили в воду с помощью канюли при энергичном перемешивании. Полученный белый шлам был оставлен для перемешивания при 0°С в течение 1 часа. Продукт извлекали фильтрованием и промывали 25 мл 40% СН₂Сl₂ /вода, затем 25 мл холодной воды. Продукт суспендировали в 60 мл IPA и 60 мл воды и нагревали до 60°С. Раствор был получен при 48°С. Добавлена дополнительная вода (120 мл). Раствор оставляли для охлаждения до 35°С, и суспензию далее медленно охлаждали до 0-5°С и перемешивали в течение нескольких часов. Продукт изолировали фильтрованием и промывали холодной деионизованной водой (25 мл). Влажный осадок F-III высушивали до постоянного веса под вакуумом при 50°С в течение от 12 до 24 часов, чтобы получить F-III.

Пример 2

F-III из 6-бензилокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофена-(S-оксида)

В 250 миллилитровую колбу Парра (Parr) вливали деионизованную воду (5,25 мл), 1М НСl (7,74 мл, 7,75 ммоль), 10% Pd/C (тип А32110, 1,37 г, 1,29 ммоль Pd), 6-бензилокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)-бенз[b]тиофен-(S-оксид) (3 г, 5,16 ммоль) и изопропиловый спирт (32 мл) при температуре окружающей среды. Колбу присоединяли к вибратору Парра, дважды последовательно откачивали газ и заполняли азотом и затем откачали газ и заполняли газообразным водородом до давления 30 фунтов на квадратный дюйм (1 фунт на кв.дюйм = 6,89476 кПа). Запускали вибратор, и реакционная смесь нагревалась до 60°С. Окончание реакции определяли с помощью ВЭЖХ-анализа приблизительно через 4 часа. Реакционную смесь отфильтровали через мягкую прокладку диатомной земли, и прокладку промывали 0,1 М НСl (2×10 мл). Растворитель удаляли под вакуумом приблизительно при 50°С. Полученный осадок был растворен в смеси 50% изопропиловый спирт/деионизованная вода (30 мл) и осторожно нагревался на паровой бане до тех пор, пока не был получен раствор. К раствору была добавлена деионизованная вода (22 мл), и раствор оставлен для охлаждения до температуры окружающей среды. Суспензия продукта далее охлаждалась до 0°С. Продукт был изолирован фильтрованием, промыт охлажденной деионизованной водой (2×15 мл) и высушен под вакуумом при 50°С до постоянного веса, чтобы получить F-III.

Пример 3

F-III из [6-изопропокси-3-[4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенокси]-2-(4-метоксифенил)]бенз[b]тиофена-(S-оксида)

Хлористый метилен (105 л) и [6-изопропокси-3-[4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенокси]-2-(4-метоксифенил)]-бенз[b]тиофен-(S-оксид) (10,5 кг) были смещены и охлаждены до от -15 до -20°С. Трихлорид бора (4,6 кг) добавлен для поддержания температуры реакции между -10° и -20°С. Перемешивание продолжали до тех пор, пока % площади пика исходного материала на ВЭЖХ не составил менее 1%. Система ВЭЖХ (4,6 мм внутренний диаметр × 25 см Zorbax SB-Phenyl колонка, 30°С, 70:30 метанол: 0,01 N серная кислота, скорость течения 1,5 мл/минуту; детектор 300 нм). Для поддержания температуры реакции между -10°С и -20°С был добавлен изопропанол (10,28 кг). Реакционная смесь перемешивалась в течение 30-45 минут. Неочищенный продукт реакции был выделен добавлением реакционной смеси к дополнительным 105 л воды, предварительно охлажденной до от 2 до 7°С для поддержания температуры реакции при 2 до 7°С. За добавлением следовала промывка хлористым метиленом (20 л), предварительно охлажденным до от 7 до 2°С. Кристаллический шлам перемешивали в течение от 2 до 3 часов и отфильтровывали и последовательно промывали хлористым метиленом (26 кг) и водой (53 л), предварительно охлажденными до от 7 до 2°С. Неочищенный влажный осадок смешивали с водой (42 л) и изопропанолом (40 л) и нагревали до от 65 до 70°С для достижения растворения. Горячий раствор фильтровали. Фильтрование проводили с промывкой, состоящей из смеси изопропанола (20 л) и воды (21 л), нагретых до 65-70°С, и промывкой, состоящей из воды (126 л), предварительно нагретой до 65-70°С. Раствор охлаждали до 40-45°С, вносили затравку кристаллизации и перемешивали при этой температуре в течение 2-3 часов, чтобы образовались кристаллы. Шлам осаждали до 0-5°С, перемешивали в течение 3-4 часов и фильтровали. Осадок на фильтре промывали водой (122,6 л), предварительно охлажденной до 2-7°С. Продукт высушивали под вакуумом при максимальной температуре 50°С до тех пор, пока изменение в весе осадка не составило менее 0,05 кг в течение 2-4 часов. Выход: 8,468 кг (87,3%). Эффективность ВЭЖХ: 98,5%. Вода по методу Карла Фишера: 3,0%. Всего вещества, связанного ВЭЖХ: 1,79%.

Пример 4

F-III из [6-бензилокси-3-[4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенокси]-2-(4-метоксифенил)]бенз[b]тиофена-(S-оксида)

Тетрагидрофуран (261 мл), воду (45 мл), концентрированную серную кислоту (6,14 г) и [6-бензилокси-3-[4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенокси]-2-(4-метоксифенил)]бенз[b]тиофена-(S-оксид) (емкость ВЭЖХ 99%, общий уровень вещества, связанного ВЭЖХ 0,35%), объединяли и перемешивали; до гомогенности. Добавляли 10% Pd/C (5,6 г суспендировали в 22 мл воды) с 5 мл водной промывки. Полученную суспензию отсасывали и оставляли под водородом при 60 фунтах на кв.дюйм (1 фунт на кв.дюйм = 6,89476 кПа). Температура реакции приведена к 30°С. Через 2 часа 10% Pd/C (5,6 г) дополнялся водой (30 мл). Гидрогенизация при 60 фунтах на кв. дюйм и 30°С продолжалась в течение дополнительных 22 часов. Добавляли дополнительные 4,40 г 10% Pd/C в 30 мл воды, а гидрогенизацию продолжали при 60 фунтах на кв.дюйм и 30°С в течение дополнительных 2,5 часов. Катализатор удаляли фильтрованием и рН фильтрата доводили до 7,24 50% гидроксидом натрия. Хлорид натрия (8,66 г), растворенный в воде (18 мл), был добавлен, и двухфазный раствор перемешивали в течение 30 минут. Фазы разделяли, и водную фазу снова экстрагировали 50 мл тетрагидрофурана. Органические фазы объединяли и концентрировали до объема 50 мл с помощью перегонки при атмосферном давлении. К концентрату при 24°С добавляли 180 мл метанола в течение 1-часового периода. Полученный кристаллический шлам перемешивали в течение 30 минут при 24°С, охлаждали до 0°С и перемешивали в течение 1 часа. Твердые вещества изолировали фильтрованием и промывали последовательно 39 мл воды и 39 мл метанола с последующей вакуумной сушкой в течение ночи при 50°С. Выход 15,52 г (67,8%).

Смешивали изопропанол (33 мл), воду (66 мл) и 10 г вышеописанного твердого вещества. К перемешиваемой смеси при 25°С добавили 1,8 М НСl (21 мл). Твердые вещества быстро растворяли с последующим переосаждением соли хлористоводородной кислоты. После перемешивания в течение 30 минут шлам нагревали до 70°С для растворения всех из твердых веществ. Раствор охлаждали до 60°С и добавляли 33 мл воды. Полученный раствор охлаждали до 25°С в течение 3-часового периода, во время которого осаждалась соль хлористоводородной кислоты. Шлам перемешивали приблизительно в течение 3 часов при 25°С, фильтровали, промывали водой (30 мл) и высушивали под вакуумом в течение ночи при 50°С, с выходом F-III 8,9 г (82,7%). Эффективность ВЭЖХ: 96,5%. Вода по методу Карла Фишера: 2,44%. Связанные ВЭЖХ вещества: 1,09%.

Использованная терминология

Используемый термин "эффективное количество" означает количество F-III, которое способно ингибировать заболевания или их пагубные воздействия, описанные в заявке. Когда F-III вводят одновременно с эстрогеном, прогестином, ингибитором ароматазы или ингибитором AChE, термин "эффективное количество" также означает количество такого агента, способное осуществить желаемое действие.

Термины "ингибирующий" и "ингибирует" подразумевают их общепринятые значения, то есть предупреждающий, препятствующий, ограничивающий, купирующий, уменьшающий интенсивность симптомов, замедляющий, останавливающий или реверсирующий прогрессирование или тяжесть патологического состояния или его осложнения, описанные в заявке.

Используемые термины "предупреждающий", "предупреждение", "профилактика", "профилактический" и "предотвращать" являются взаимозаменяемыми и подразумевают снижение вероятности, что у реципиента F-III останутся неизлечимыми или будут проявляться любые патологические состояния или их осложнения, описанные в заявке.

Термины "эстроген-дефицитный" и "недостаточность эстрогена" относятся к состоянию, или возникающему естественно или клинически индуцированному, когда женщина не может продуцировать достаточное количество эндогенных эстрогенных гормонов для поддержания эстроген-зависимых функций, например, менструальной функции, гомеостаза костной массы, нейронной функции, состояния сердечно-сосудистой системы и тому подобного. Такие эстроген-дефицитные состояния возникают во время менопаузы и в результате хирургической или химической овариэктомии, включая ее функциональный эквивалент, например, в результате лекарственной терапии ингибитором ароматазы, агонистами или антагонистами GnRH, ICI 182780 и тому подобным. Заболевания, связанные с недостаточностью эстрогена, включают в себя разрежение кости, остеопороз, сердечно-сосудистое заболевание и гиперлипидемию.

Используемый термин "эстроген" включает в себя стероидные соединения, характеризующиеся эстрогенной активностью, такие как 17-эстрадиол, эстрон, конъюгированный эстроген (премарин; Premarin®), конский эстроген 17-этинилэстрадиол и тому подобное. Предпочтительными соединениями на основе эстрогена являются премарин® и норэтилнодрел.

Используемый термин "прогестин" включает в себя соединения, проявляющие прогестероноподобную активность, такие, например, как прогестерон, норэтилнодрел, нонэстрел, мегестрол ацетат, норэтиндрон и тому подобные. Норэтиндрон является предпочтительным агентом на основе прогестерона.

Используемый термин "ингибитор ароматазы" включает в себя соединения, которые способны ингибировать ароматазу, например, такие коммерчески доступные ингибиторы, как аминоглутемид (цитандрен®; CYTANDREN®), анастразол (аримидекс®, ARIMIDEX®), летрозол (фемара®, FEMARA®)), форместан (ленатрон®, LENATRON®), эксеместан (аромасин®, AROMAS IN®), и тому подобное.

Используемый в описании термин "аналоги LHRH" относится к аналогам лютеинизирующего гормона рилизинг гормона, которые ингибируют продукцию эстрогена у женщин, находящихся в предклимактерическом периоде, и включают в себя, например, госерлин (золадекс®, ZOLADEX®), леупролид (лупрон®, LUPRON®) и тому подобное.

Используемый термин "ингибитор AChE" включает в себя соединения, которые ингибируют ацетилхолинэстеразу, например, физостигмина салицилат, такрина гидрохлорид, донепезила гидрохлорид и тому подобные.

Термин "активирует ChAT" подразумевает увеличение энзиматической активности ChAT, то есть ускорение превращения холина до ацетилхолина. Эта активация должна включать в себя увеличение эффективности и/или скорости реакции ChAT и холина и/или увеличение количества ChAT, присутствующего в районе действия. Это увеличение количества присутствующего фермента может быть обусловлено генной регуляцией или другой стадией синтеза при образовании фермента и/или уменьшением инактивации и метаболизма фермента.

Отдельные методы тестирования

Основной способ подготовки крыс: Самок крыс Sprague Dawley (диапазон от 200 до 255 г) в возрасте семидесяти пяти дней (если не указано особо) получали из лабораторий Charles River (Portage, MI). Животным проводили двустороннюю овариэктомию (OVX), или подвергали хирургической операции по Шаму (Sham) в лаборатории Charles River, а затем через одну неделю перевозили. По прибытии их размещали в металлические переносные клетки по группам из 3 или 4 животных на клетку и предоставляли свободный доступ к пище (содержание кальция приблизительно 0,5%) и воде в течение одной недели. Температура помещения поддерживалась при 22,2°С±1,7°С при минимальной относительной влажности 40%. Световой режим в помещении соста