Новая кристаллическая форма 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил) бензо[b]тиофена гидрохлорида

Новая кристаллическая форма 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил) бензо[b]тиофена гидрохлорида

Реферат

 

Данное изобретение относится к новой кристаллической форме 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофена гидрохлорида. Соединение может быть использовано при ингибировании заболеваний, связанных с недостаточностью эстрогена, включая сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемию и остеопороз; и ингибировании патологических состояний, таких как эндометриоз, фиброз матки, эстроген-зависимый рак (включая рак молочной железы и матки), рак простаты, доброкачественная гиперплазия эндометрия, расстройства ЦНС, включающие в себя болезнь Альцгеймера. Соединение получают путем перекристаллизации арзоксифена из тетрагидрофурана. Полученный продукт хорошо кристаллизуется. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил.

6-Гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)-бенз[b]тиофен гидрохлорид (арзоксифен) в самом общем виде был впервые описан в Патенте США №5510357 и подробно рассмотрен в Патенте США №5723474 (‘474) и в Заявке на Европейский Патент 0729956. Арзоксифен представляет собой нестероидный смешанный антагонист/агонист эстрогена, между прочим, используется для снижения холестерина сыворотки, ингибирования гиперлипидемии, остеопороза, эстроген-зависимых раков, включая рак молочной железы и матки, эндометриоза, расстройств ЦНС, включая болезнь Альцгеймера, пролиферации клеток гладких мышц аорты и рестеноза.

Точнее, арзоксифен является полезным и в настоящее время применяется в клиниках для лечения рецептор-позитивного метастатического рака молочной железы; адъювантного лечения рецептор-позитивных пациентов после соответствующей системной и местной терапии; снижения распространения инвазивного и неинвазивного рака молочной железы и протоковой карциномы in situ (DCIS). Арзоксифен также используется в комбинации с лучевой терапией, ингибиторами ароматазы, аналогами LHRH (лютеинизирующий гормон-рилизинг гормон) и ингибиторами ацетилхолинэстеразы (AchE).

Исследования с помощью методов рентгеновской порошковой дифракции (XRD), термогравиметрического анализа (TGA), метода протонного ядерного магнитного резонанса (¹H ЯМР) и метода Карла Фишера (Karl Fischer; KF) основной массы арзоксифена, выделенного согласно способам, изложенным в ‘474, указывают, что названный материал является гидратированным, слабо кристаллизующимся и содержит в своей кристаллической решетке различные количества органического летучего компонента (этил-ацетата).

Обычно для приготовления лекарственных средств слабо кристаллизующиеся вещества менее желательны, чем высоко кристаллизующиеся вещества. Кроме того, вообще нежелательно получение фармацевтических средств, содержащих значительные количества органического растворителя (например, этилацетата), вследствие возможной токсичности растворителя для реципиента и изменения эффективности фармацевтического средства в результате действия растворителя.

Хотя арзоксифен, полученный согласно способам, предложенным в ‘474, можно использовать как фармацевтическое средство, крайне желательны и полезны поиски еще и кристаллической формы арзоксифена, которая не содержала бы органический растворитель в кристаллической решетке и которую можно воспроизводить и эффективно получать в коммерческом масштабе.

Данное изобретение относится к новой нестехиометрической гидратированной кристаллической форме 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]-фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]-тиофена гидрохлорида (F-I), имеющей рентгеновскую дифрактограмму, которая включает в себя следующие пики: 7,9±0,2; 10,7±0,2; 14,9±0,2; 15,9±0,2; 18,3±0,2 и 20,6±0,2° при 2; получаемые из медного источника излучения.

Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей F-I; один или больше фармацевтических носителей, разбавителей или наполнителей; и необязательно эстроген, необязательно прогестин, необязательно ингибитор ароматазы, необязательно аналог LHRH и необязательно ингибитор ацетилхолинэстеразы (AChE).

К тому же данное изобретение относится к способам применения F-I для ингибирования патологических состояний, таких как фиброз матки, эндометриоз, пролиферация клеток гладких мышц аорты, рестеноз, рак молочной железы, рак матки, рак простаты, доброкачественная гиперплазия простаты, разрежение кости, остеопороз, сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемия, расстройства ЦНС и болезнь Альцгеймера, а также применения F-I для производства лекарственных средств для ингибирования таких заболеваний.

Данное изобретение также относится к способам применения F-I для активации холин-ацетилтрансферазы (ChAT) и применения F-I для производства лекарственного средства для активации этого фермента.

Краткое описание фигур

Фигура 1 является типичным изображением дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC)/TGA S-II.

Фигура 2 является типичным изображением DSC/TGA F-I.

Фигура 3 является типичным изображением DSC/TGA F-III.

Фигура 4 изображает изотермы сорбции влаги для F-I и F-III.

Фигура 5 изображает десольватацию S-II как функцию времени и температуры высушивания.

Основная масса арзоксифена, полученного по методу, изложенному в ‘474 (пример 41, кристаллизация из смеси этанола и этилацетата, фильтрование и высушивание фильтровального осадка под вакуумом до постоянного веса при комнатной температуре), была охарактеризована методом XRD и, как было обнаружено, является слабо кристаллизующимся веществом. Методом ¹H ЯМР подтвердили, что основная масса вещества содержит 6% этилацетата.

Предложенный в ‘474 способ кристаллизации впоследствии модифицировали с тем, чтобы добавлять этанол в суспензию неочищенного арзоксифена в кипящем этилацетате. После охлаждения и фильтрования под вакуумом твердое вещество, полученное с помощью этого модифицированного способа, представляет собой высоко кристаллизующийся смешанный сольват арзоксифена в этилацетате/воде (в дальнейшем упоминаемый как S-II), который, как было обнаружено позднее, является исходным материалом для F-I.

F-I может быть получен удалением этилацетата из кристаллической решетки S-II с помощью вакуумной сушки, отжигания S-II при повышенных температурах. Время и температура, необходимые для отжига S-II, чтобы получить F-I, меняются от партии к партии, но обычно составляют порядка 5 дней приблизительно при 100°С. Для осуществления превращения S-II в F-I с помощью этого метода требуются высокие температуры, поскольку при суспендировании S-II в воде при температуре окружающей среды или хранении образца при 98% RH в течение 3 недель не происходит никакого превращения в F-I. Кроме того, высушивание S-II в конвекционной печи при высоких температурах не десольватирует никакой материал, что позволяет предположить, что вакуум также необходим для вытягивания этилацетата из решетки S-II.

Предпочтительно, F-I быстро получают и выделяют путем кристаллизации арзоксифена (или его любой полиморфной модификации/сольвата) из тетрагидрофурана при температуре окружающей среды. Эта кристаллизация предпочтительно проводится с помощью первоначального растворения арзоксифена во влажном тетрагидрофуране (1-10% воды по объему, предпочтительно 2,5-7,5% и наиболее предпочтительно от 4,5 до 5,5%) с последующим удалением упомянутой воды посредством перегонки при атмосферном давлении. Пример этой кристаллизации подробно описан ниже в примере 2. При получении F-I с помощью этого улучшенного способа кристаллизации можно ожидать, что общий относительный уровень вещества (TRS) составит <0,5%.

Подходящий исходный материал арзоксифена для этой кристаллизации включает в себя S-II, F-III, арзоксифен, полученный посредством способов, предложенных в ‘474, или любую их смесь, но не ограничивается перечисленным. Неважно, какая форма арзоксифена окажется исходным материалом, так как кристаллизация из тетрагидрофурана в соответствии со способами, описанными в заявке, приводит к образованию кристаллов F-I. Для синтеза F-I в коммерческом масштабе может быть полезным добавление затравки кристаллизации F-I.

F-III, другой нестехиометрический гидрат арзоксифена, легко получают и выделяют кристаллизацией арзоксифена (или любой его полиморфной модификации/сольвата) из смеси изопропилового спирта (IPA) и воды при температуре окружающей среды. Соотношение воды и IPA (объем:объем) обычно составляет от 1:1 до 9:1. Более предпочтительно, соотношение составляет от 2,5 до 5,6:1. Наиболее предпочтительно, соотношение оказывается между 3 и 5,6:1. Соотношение IPA не является существенным для осуществления кристаллизации F-III, но влияет на выход. Для синтеза F-III в коммерческом масштабе может быть полезным добавление затравки кристаллизации F-III. Подходящий исходный материал арзоксифена для вышеупомянутой кристаллизации включает в себя S-II, F-I, арзоксифен, полученный по способам, описанным в ‘474, или любые их смеси, но не ограничивается перечисленным.

Характеристика и дифференциация S-II, F-I и F-III

Для характеристики S-II, F-I и F-III были использованы методы DSC/TGA и XRD. TGA часто используется для выявления различий между разными твердыми формами вещества, так как температура(ы), при которой происходят физические изменения в веществе, обычно является характеристикой полиморфа или сольвата. DSC представляет собой способ, который часто используют для скрининга соединений для образования полиморфной модификации и сольвата. Наконец, XRD является способом определения дальнего порядка в кристаллическом веществе.

Арзоксифен, полученный по способам, изложенным в ‘474, дает рентгенограмму с низким отношением сигнала к фону и повышенной базовой линией, что указывает на слабо кристаллизующееся вещество. Поэтому проводятся сравнения F-I и F-III с веществом (S-II), полученным с помощью вышеописанного модифицированного способа кристаллизации арзоксифена (добавление этанола в суспензию арзоксифена в кипящем этилацетате).

Типичные изображения DSC/TGA для S-II, F-I и F-III представлены на фигурах 1, 2 и 3 соответственно. Изображение DSC для S-II показывает интенсивную эндотермическую реакцию, начинающуюся приблизительно при 62°С, соответствующую потере этилацетата и воды из решетки. Эндотермия, начинающаяся приблизительно при 152°С, представляет собой расплав. Потеря массы, по данным TGA, приблизительно 2,5% происходит одновременно с первым превращением, тогда как оставшиеся 0,5% потери массы происходят вплоть до начала плавления, это позволяет предположить, что некоторое количество молекул растворителя более прочно удерживается в решетке.

Изображение DSC для F-I демонстрирует интенсивную эндотермическую реакцию, начинающуюся приблизительно при 75°С, за которой следует вторая эндотермическая реакция, начинающаяся при приблизительно 155°С, соответствующая расплаву. Изображение TGA F-I показывает постепенную потерю 0,3% массы с последующей резкой потерей 1,5%, что вместе представляет собой дегидратацию решетки. Начало первого DSC превращения и соответствующая TGA потеря массы незначительно смещаются вследствие различий в скоростях нагревания. Первоначальная потеря массы представляет собой слабо удерживаемую воду гидратации, тогда как вторая потеря массы соответствует приблизительно 0,5 моля воды, присутствующей в решетке при очень низкой относительной влажности (ниже 5% - см. данные сорбции влаги).

Изображение DSC F-III представляет собой интенсивную низкотемпературную эндотермическую реакцию приблизительно при 30°С с последующей второй полной, относительно слабой эндотермической реакцией, начинающейся приблизительно при 70°С, и конечное превращение, начинающееся приблизительно при 146°С, соответствующее расплаву. Резкая 1,5% потеря массы (~0,5 моля) в TGA, совпадающая с первой эндотермической реакцией, соответствует потере слабо удерживаемых молекул воды, тогда как дополнительная ~1,6% потеря массы при температуре выше 60°С представляет собой потерю более прочно удерживаемых молекул воды, то есть молекул, которые присутствуют при очень низкой относительной влажности. Потеря массы, наблюдаемая после 170°, соответствует разложению F-III.

Схемы XRD для F-I и F-III изображают острые пики и плоскую базовую линию, указывающие на высоко кристаллизующиеся вещества. Угловые положения пиков при 2 и соответствующие данные I/I₀ для типичных образцов F-I, F-III и S-II представлены в таблице 1. Хотя многие отражения интенсивности обычно находятся при одинаковых углах дифракции, каждая из форм дает особую порошковую рентгенограмму, указывая на четкие различия между S-II, F-I и F-III.

В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной полиморфной модификации относительные интенсивности дифракционных пиков могут изменяться вследствие предпочтительной ориентации, обусловленной такими факторами, как морфология кристаллов. Если имеется влияние предпочтительной ориентации, интенсивность пиков меняется, однако характерные положения пиков полиморфной модификации не меняются. См., например, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995. Таким образом, на основании интенсивности пиков, а также положения пиков, F-I может быть идентифицирован по присутствию пиков при 7,9±0,2; 10,7±0,2; 14,9±0,2; 15,9±0,2; 18,3±0,2; и 20,6±0,2° при 2; когда изображения были получены из медного источника излучения.

Дальнейшая характеристика F-I и F-III

Проведены исследования гигроскопичности F-I и F-III. На фигуре 4 представлены изотермы сорбции влаги для F-I и F-III. После исходной экспозиции образцов приблизительно до 5% RH происходит немедленное увеличение массы влаги на 1,5% и 1,7% для F-I и F-III соответственно, эквивалентное приблизительно 0,5 моля воды. Обе формы демонстрируют непрерывную сорбцию влаги по всей зоне влажности, что является следствием включения молекул воды в решетки.

Различия в поглощении влаги двумя формами, вероятно, отражает количество воды, которое может быть включено в две решетки (то есть величину доступного пространства решетки, которое может вместить молекулы воды). Отсутствие гистерезиса в изотермах сорбция-десорбция для F-I и F-III указывает, что кристаллические формы быстро уравновешиваются при любой данной влажности.

Профили сорбции влаги для F-I и F-III показывают, что эти формы по существу являются нестехиометрическими гидратами. При относительной влажности окружающей среды (около 50% RH) F-I содержит приблизительно 1,7% воды, соответствующей 0,5 моля воды, тогда как F-III сорбирует около 3,0% воды, что соответствует приблизительно 0,85 моля воды. Основная масса форм F-I и F-III быстро уравновешивается с атмосферой так, что содержание воды, определяемое с помощью аналитических методов, является отражением относительной влажности во время сбора данных. По данным DSC, выявляемые различия от партии к партии, вероятно, обусловлены образцами, гидратированными в различной степени вследствие хранения при разных условиях окружающей среды.

Получены рентгенограммы для образцов F-I и F-III, хранившихся при различной относительной влажности (0; 22; 50 и 80%). Когда увеличивается относительная влажность, происходит постепенное смещение первоначальных (0% RH) пиков F-III приблизительно при 13,8; 17,6; 18,0; 20,5 и 24,0° при 2, также как и незначительное смещение менее интенсивных пиков. Эти наблюдаемые изменения в рентгенограммах F-III указывают, что меняются размеры элементарной ячейки, чтобы, вероятно, вместить слабо удерживаемые молекулы воды, когда увеличивается относительная влажность. Непрерывное смещение пиков в зависимости от влажности хорошо коррелирует с данными по сорбции влаги, о чем свидетельствует постепенное увеличение массы в пределах этой области RH, доказывающее вариабельность образования гидрата.

Аналогичный эксперимент проведен с F-I, чтобы установить, будет ли оказывать изменение относительной влажности подобное действие на его решетку (0, 25; 52; 73 и 95% RH). Наблюдается очень незначительное смещение пиков 0% RH приблизительно при 7,7; 18,3; 18,5; 20,5; 20,8° при 2, когда увеличивается относительная влажность. Также оказалось, что пики приблизительно при 7,7; 20,8 и 24,1 становятся несколько более расширенными и менее разделенными при более высокой относительной влажности, указывая на то, что вода оказывается сорбированной в аморфных компонентах (или пластифицирует твердое вещество), особенно при 73 и 95% RH. Смещение пиков на рентгенограммах F-I менее драматично, чем наблюдаемое смещение пиков в случае экспонирования F-III при различной относительной влажности. Это позволяет предположить, что решетка F-I не подвергается растяжению и/или уплотнению как решетка F-III.

Обнаружено, что F-I и F-III стабильны в пределах всей области относительной влажности, несмотря на способность F-III сорбировать почти вдвое больше воды. Установлено, что две формы имеют сравнимые размеры кристаллов, морфологию, растворимость в воде и скорости растворения.

Проведено исследование высушивания, чтобы проследить десольватацию S-II как функцию времени и температуры высушивания (см. фигуру 5). Во время эксперимента десольватации получены рентгенограммы для различных временных точек. Большинство пиков дифракции, полученных при исследовании десольватации S-II, оказываются с углами, подобными F-I, что подтверждает, что решетки S-II и F-I очень схожи. Исчезновение пиков дифракции приблизительно при 6,8; 7,2 и 14,0° при 2 после только минимального высушивания позволяет предположить, что эти отражения могут быть отнесены к кристаллографическим плоскостям, вмещающим частичную плотность электронов молекул этилацетата.

Продолжительный отжиг под вакуумом сольватированного вещества при высоких температурах дает F-I. Полученный таким способом F-I показывает на рентгенограммах высокую степень кристалличности. Поэтому вещество, полученное путем кристаллизации из раствора этанола и этилацетата с последующим высушиванием под вакуумом в течение только нескольких часов, как предложено в ‘474, проявляет очень низкую кристалличность, так как такой способ дает в результате частично десольватированный S-II.

F-I и F-III имеют некоторые преимущества перед вышеописанной формой арзоксифена предыдущего уровня техники. По сравнению с арзоксифеном, полученным способами, предложенными в ‘474, F-I и F-III более стабильны при температуре окружающей среды и поэтому оказываются более поддающимися фармацевтической обработке, то есть созданию дозированных композиций. Кроме того, F-I и F-III являются значительно более кристаллическими, чем форма, описанная в ‘474. Кристаллические вещества обычно менее гигроскопичны и более стабильны (то есть менее склонны к химическому разрушению, сохраняют консистентные свойства), чем аморфные вещества, и поэтому являются более желательными для производства композиций. Кроме того, в отличие от формы арзоксифена, полученной способами, предложенными в ‘474, которая содержит в своей решетке этилацетат и воду, F-I и F-III содержат только воду.

Методы исследования

Измерения DSC проводили на ТА Instruments 2920 Modulated DSC, присоединенном к Thermal Analyst 3100 и снабженном охлаждающей системой. Образцы (3-5 мг) нагревали в извитых алюминиевых резервуарах от 10 до 240°С при скорости нагревания 2°С/минуту.

TGA исследования проводили на ТА Instruments 2050 термогравиметрическом анализаторе, присоединенном к Thermal Analyst 3100. Образцы (5-10 мг) нагревали в открытых резервуарах от 25°С до 250°С при скорости нагревания 5°С/минуту.

Рентгенограммы получали на Siemens D5000 рентгеновском порошковом дифрактометре, снабженном CuK источником ( + 1,54056 ) и Kevex детектором твердого состояния, работающем при 50 кВ и 40 мА. Каждый образец сканировали между 4° и 35° в 2. Образцы оставляли для уравновешивания по крайней мере в течение 30 минут при требуемой температуре и/или относительной влажности до сбора данных.

Измерения гигроскопичности производили для F-I и F-III, используя метод VTI, следующим образом. Каждый образец высушивали под вакуумом при 60°С до тех пор, пока не прекращалось выявление дальнейшей потери массы, за это время опытная камера была доведена до 0% относительной влажности. Изотермы сорбции влаги получены при 25°С, используя VTI вакуумные рычажные весы со шкалой, проградуированной в процентах влажности, при следующих условиях: величина пробы 10-15 мг, область адсорбции/десорбции 0-95% относительной влажности, ступень интервала 5%, промежуток времени между отборами проб 10 минут.

Следующие примеры иллюстрируют способы получения гидрата данного изобретения. Примеры в любом случае не предназначены для ограничения ими объема защиты этих способов и не должны быть так истолкованы.

Получение

Получение 1

S-II

Неочищенный арзоксифен (1,58 г вещества, полученного с помощью способа примера 41 из Патента США №5723474, рекомендации которого приведены в описании цитированием) суспендирован в 28 мл этилацетата и нагрет в колбе с обратным холодильником. Для осуществления растворения добавлен этанол (18 мл). Раствор кипятили в течение 20 минут, а затем оставляли для охлаждения до комнатной температуры. Осадок изолировали фильтрованием под вакуумом и промывали 30 мл этилацетата, чтобы получить 1,05 г порошкообразного белого твердого вещества.

Примеры

Пример 1

F-I из S-II

S-II высушивался в вакуумном сушильном шкафу (-25 in. Hg) при 100°С в течение 118 часов, чтобы получить F-I.

Пример 2

Улучшенный способ получения F-I из арзоксифена

1-литровая 3-горлая круглодонная колба, снабженная дефлегматором и верхней мешалкой, загружалась 25,0 г арзоксифена, 475 мл тетрагидрофурана и 25 мл воды. Реакционный сосуд затем приспосабливался для простой перегонки. Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником и 250 мл дистиллята удаляли. Нагрев быстро убирали и 250 мл свежего безводного тетрагидрофурана добавляли в сосуд. Атмосферная перегонка продолжалась с удалением дополнительных 250 мл дистиллята. Нагрев быстро удаляли, добавляли 250 мл свежего тетрагидрофурана и удаляли дополнительные 250 мл дистиллята. Добавляли дополнительные 250 мл тетрагидрофурана, а реакционную смесь выдерживали при кипячении. При этом добавлении тетрагидрофурана образовывался белый осадок. Перемешиваемую реакционную смесь оставляли для медленного охлаждения в течение 3 часов, во время которых дополнительные твердые вещества выпадали в осадок и шлам достигал температуры окружающей среды. Кристаллический шлам фильтровался и высушивался под вакуумом при 50°С в течение сорока восьми часов с незначительным продуванием N ₂. Выход 22,50 г (90,0%). XRD анализ показал, что спектры влажного осадка и сухого твердого вещества по существу идентичны и по существу идентичны с спектром ранее полученного F-I. При DSC анализе установлена точка плавления 157°С, тогда как TGA анализ показал 1,5% потери масс в диапазоне между температурой окружающей среды и 100°С. Чистота ВЭЖХ, рассчитанная как свободное основание, составила 88,1% против теоретической эффективности 92,9%. ВЭЖХ анализ показал уровень общего связанного вещества 0,44%,

Пример 3

F-I из [6-бензилокси-3-[4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси)-фенокси]-2-(4-метоксифенил)]бенз[b]тиофен-(3-оксид)

Тетрагидрофуран (261 мл), воду (45 мл), концентрированную серную кислоту (6,14 г) и [6-бензилокси-3-[4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенокси]-2-(4-метоксифенил)]бенз[b]тиофен-(3-оксид) (емкость ВЭЖХ 99%, общий уровень вещества, связанного ВЭЖХ 0/35%) объединяли и перемешивали до гомогенности. Добавляли 10% Pd/C (5,6 г суспендировали в 22 мл воды) с 5 мл водной промывки. Полученную суспензию отсасывали, и оставляли под водородом при 60 фунтах на кв. дюйм (1 фунт на кв.дюйм = 6, 89476 кПа). Температуру реакции приводили к 30°С. Через 2 часа добавляли 10% PD/C (5,6 г) с водой (30 мл). Гидрогенизацию при 60 фунтах на кв.дюйм и 30°С продолжали в течение дополнительных 22 часов. Добавили дополнительные 4,40 г 10% PD/C в 30 мл воды, а гидрогенизацию продолжали при 60 фунтов на кв.дюйм (1 на кв.дюйм = 6,89476 кПа) и 30°С в течение дополнительных 2,5 часов. Катализатор удаляли фильтрованием, и рН фильтрата приводили к 7,24 50% гидроксидом натрия. Добавили хлорид натрия (8,66 г), растворенный в воде (18 мл), и двухфазный раствор перемешивали в течение 30 минут. Фазы разделяли и водную фазу снова экстрагировали 50 мл теграгидрофурана. Органические фазы объединяли и концентрировали до объема 50 мл с помощью перегонки при атмосферном давлении. К концентрату при 24°С было добавлено 180 мл метанола в течение 1 часового периода. Полученный кристаллический шлам перемешивали в течение 30 минут при 24°С, охлаждали до 0°С и перемешивали в течение 1 часа. Твердые вещества изолировали фильтрованием и промывали последовательно 39 мл воды и 39 мл метанола с последующей вакуумной сушкой в течение ночи при 50°С. Выход 15,52 г (67,8%).

Порцию продукта (10 г), из полученного выше вещества, перекристаллизовывали из тетрагидрофурана и воды, как описано в примере 2.

Использованная терминология

Используемый термин “эффективное количество” означает количество F-I, которое способно ингибировать заболевания или их пагубные воздействия, описанные в заявке. Когда F-I вводят одновременно с эстрогеном, прогестином, ингибитором ароматазы или ингибитором AchE, термин “эффективное количество” также означает количество такого агента, способное осуществить желаемое действие.

Термины “ингибирующий” и “ингибирует” подразумевают их общепринятые значения, то есть предупреждающий, препятствующий, ограничивающий, купирующий, уменьшающий интенсивность симптомов, замедляющий, останавливающий или реверсирующий прогрессирование или тяжесть патологического состояния или его осложнения, описанные в заявке.

Используемые термины “предупреждающий”, “предупреждение”, “профилактика”, “профилактический” и “предотвращать” являются взаимозаменяемыми и подразумевают уменьшение вероятности, что у реципиента F-I останутся неизлечимыми или будут проявляться любые патологические состояния или их осложнения, описанные в заявке.

Термины “эстроген-дефицитный” и “недостаточность эстрогена” относятся к состоянию, или возникающему естественно, или клинически индуцированному, когда женщина не может продуцировать достаточное количество эндогенных эстрогенных гормонов для поддержания эстроген-зависимых функций, например менструальной функции, гомеостаза костной массы, нейронной функции, состояния сердечно-сосудистой системы и тому подобного. Такие эстроген-дефицитные состояния возникают во время менопаузы и в результате хирургической или химической овариэктомии, включая ее функциональный эквивалент, например, в результате лекарственной терапии ингибитором ароматазы, агонистами или антагонистами GnRH, ICI 182780 и тому подобным. Заболевания, связанные с недостаточностью эстрогена, включают в себя разрежение кости, остеопороз, сердечно-сосудистое заболевание и гиперлипидемию, но не ограничиваются перечисленными.

Используемый термин “эстроген” включает в себя стероидные соединения, характеризующиеся эстрогенной активностью, такие как 17-эстрадиол, эстрон, конъюгированный эстроген (премарин; Premarin⁰ ), конский эстроген 17-этинилэстрадиол и тому подобное. Предпочтительными соединениями на основе эстрогена являются премарин⁰ и норэтилнодрел.

Используемый термин “прогестин” включает соединения, проявляющие прогестеронолодобную активность, такие, например, как прогестерон, норэтилнодрел нонгестрел, мегестрол ацетат, норэтиндрон и тому подобные. Норэтиндрон является предпочтительным агентом на основе прогестерона.

Используемый термин “ингибитор ароматазы” включает в себя соединения, которые способны ингибировать ароматазу, например, такие коммерчески доступные ингибиторы, как аминоглутемид (цитандрен⁰ ; Cytandren⁰), анастразол (аримидекс⁰; Arimidex⁰), летрозол (фемара⁰; Femara ⁰), форместан (ленатрон⁰; Lenatron⁰ ), эксеместан (аромасин⁰; Aromasin⁰) и тому подобное.

Используемый в описании термин "аналоги LHRH" относится к аналогам лютеинизирующего гормона - рилизинг гормона, которые ингибируют продукцию эстрогена у женщин, находящихся в предклимактерическом периоде, и включают в себя, например, госерлин (золодекс⁰; Zolodex⁰), леупролид (лупрон⁰; Lupron⁰) и тому подобное.

Используемый термин "ингибитор АСhЕ" включает в себя соединения, которые ингибируют ацетилхолинэстеразу, например, физостигмин салицилаг, такрин гидрохлорид, донерезил гидрохлорид и тому подобные.

Термин "активирует ChAT’ подразумевает увеличение энзиматической активности ChAT, то есть ускорение превращения холина до ацетилхолина. Эта активация должна включать увеличение эффективности и/или скорости реакции ChAT и холина и/или увеличение количества ChAT, присутствующего в районе действия.

Это увеличение количества присутствующего фермента может быть обусловлено генной регуляцией или другой стадией синтеза при образовании фермента и/или уменьшением инактивации и метаболизма фермента.

Отдельные методы тестирования

Основной способ подготовки крыс: самок крыс Sprague Dawley (диапазон от 200 до 225 г) в возрасте семидесяти пяти дней (если не указано особо) получали из лабораторий Charles River (Portage, MI). Животным делали двустороннюю овариэктомию (OVX), или подвергали хирургической операции по Шаму (Sham) в лаборатории Charley River, а затем через одну неделю перевозили. По прибытии их размещали в металлические переносные клетки по группам из 3 или 4 животных на клетку и предоставляли свободный доступ к пище (содержание кальция приблизительно 0,5%) и воде в течение одной недели. Температура помещения поддерживалась при 22,2°С±1,7°С при минимальной относительной влажности 40%. Световой режим в помещении составлял 12-часовое освещение и 12-часовую темноту.

Схема дозирования и сбор ткани: после одной недели акклиматизации (поэтому две недели после OVX) начали ежедневное введение F-I. 17-этинилэстрадиол или F-I давали перорально, если не указано особо, в виде суспензии в 1% карбоксиметилцеллюлозе или растворенными в 20% циклодекстрине. Животные получали дозы препарата ежедневно в течение 4 дней. После курса введения лекарственного средства животных взвешивали и анестезировали смесью кетамин:ксилазин (2:1, объем/объем) и в виде пунктата из сердца брали образцы крови. Животных затем умерщвляли асфиксией CO₂, матку удаляли через срединный разрез и определяли влажный вес матки. 17-этинил-эстрадиол получали от Sigma Chemical CO., St., Louis, МО.

Сердечно-сосудистое заболевание/гиперлипидемия

Образцы крови, взятой у вышеупомянутых животных, оставляли для свертывания при комнатной температуре в течение 2 часов и сыворотку получали после центрифугирования в течение 10 минут при 3000 оборотов в минуту. Холестерин сыворотки определяли, используя высокоэффективный анализ холестерина Boehringer Mannheim Diagnostics). Вкратце, холестерин окисляли до холест-4-ен-3-она и перекиси водорода. Затем перекись водорода взаимодействовала с фенолом и 4-аминофеназоном в присутствии пероксидазы с образованием п-хинониминового красителя, который определяли спектрофотометрически при 500 нм. Концентрацию холестерина затем рассчитывали по стандартной кривой. Все исследования автоматизировали, используя Biomek Automated Workstation.

Исследование пероксидазы эозинофилов матки

Матки от вышеупомянутых животных хранили при 4°С до момента исследования фермента. Матки гомогенизировали в 50 мМ трис-буфере (рН 8,0), содержащем 0,005% тритон Х-100. После добавления в трис-буфер 0,01% перекиси водорода и 10 мМ O-фенилендиамина (конечные концентрации) в течение одной минуты следили за увеличением поглощения при 450 нм. Присутствие эозинофилов в матке является показателем эстрогенной активности соединения. Определяли максимальную скорость 15-секундных интервалов в пределах начального, линейного отрезка реакционной кривой.

Способ исследования ингибирования разрежения кости (остеопороза)

После проведения вышеописанной основной подготовки крыс обрабатывали ежедневно в течение тридцати пяти дней (6 крыс на группу) и на 36-ой день умерщвляли асфиксией двуокисью углерода. Тридцатипятидневный период времени достаточен для достижения максимального снижения плотности кости, определяемого, как описано в заявке. Во время умерщвления крыс матки удаляли, отслаивали инородные ткани и жидкое содержимое выбрасывали перед определением влажного веса для того, чтобы подтвердить эстрогенную недостаточность, связанную с полной овариэктомией. Обычно в ответ на овариэктомию вес матки уменьшается приблизительно на 75%. Затем для проведения последующего гистологического анализа матки помещали в 10% нейтральный забуференный формалин.

Правые бедренные кости иссекали и на периферическом метафизе получали дигитилизированную рентгенограмму и анализировали с помощью программы анализа изображения (NIH). Проксимальные части большеберцовых костей этих животных также сканировали с помощью количественной компьютерной томографии. В соответствии с вышеописанными способами, опытным животным перорально вводили F-I или этинилэстрадиол (ЕЕ ₂) в 20% гидроксипропил -циклодекстрине. F-I также используется в комбинации с эстрогеном или прогестином.

Исследование пролиферации MCF-7

Клетки MCF-7 аденокарциномы молочной железы (АТСС НТВ 22) содержали в среде MEM (минимальная поддерживающая среда, без фенольного красного, Sigma, St. Louis, МО), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (объем,объем), L-глутамином (2 мМ), пируватом натрия (1 мМ), HEPES {(N-[2-гидроксиэтил]-пиперазин-N’-[2-этансульфркислота] 10 мМ}, не-незаменимые аминокислоты и бычий инсулин (1 мкг/мл) (поддерживающая среда). За десять дней до исследования клетки MCF-7 переводили в поддерживающую среду, дополненную 10% покрытым декстраном древесным углем, захватывающим фетальную бычью сыворотку ((DCC-FBS) среда исследования) вместо 10% FBS, чтобы истощить внутренние накопления стероидов. Клетки МСР-7 удаляли из чашек с поддерживающей средой, используя клеточную диссоциирующую среду (Са⁺⁺/Мg⁺⁺ без HBSS (без фенолового красного), дополненную 10 мМ HEPES и 2 мМ EDTA). Клетки дважды промывали аналитической средой и доводили до 80000 клеток/мл. Приблизительно 100 мл (8000 клеток) вносили в плоскодонные лунки микрокультуры (Costar 3596) и инкубировали при 37°С в 5% СО₂ увлаженном инкубаторе в течение 48 часов, чтобы обеспечить клеточное сцепление и уравновешивание после переноса. Готовили серии разведений лекарственных средств и DMSO, в качестве контроля, в аналитической среде, и 50 мл переносили в утроенные микрокультуры, с последующим добавлением 50 мл среды исследования до конечного объема 200 мл. После дополнительных 48 часов при 37°С в 5% СO₂ -инкубаторе микрокультуры обрабатывали импульсной меткой тритированного тимидина (1 мкКи/лунку) в течение 4 часов. Культивирование завершали замораживанием при -70°С в течение 24 часов с последующим оттаиванием и сбором микрокультур, используя полуавтоматический коллектор клеток Skatron. Пробы считали в жидком сцинтилляторе, используя -счетчик Wallac BetaPlace.

Ингибирование DMBA-индуцированной опухоли молочной железы

Эстроген-зависимые опухоли молочной железы получали у самок крыс Sprague-Dawley, которых покупали в Harlan Industries, Indianapolis, Indiana. Крысы в возрасте около 55 дней получали с однократным пероральным кормлением 20 мг 7,12-диметилбенз[а]антрацена (DMBA). Приблизительно через 6 недель после введения DMBA молочные железы пальпировали с недельными интервалами с целью обнаружения опухолей. Как только появлялась одна или бол