Способ и набор для выявления гена, кодирующего мембраносвязанный белок, вектор (варианты)

Способ и набор для выявления гена, кодирующего мембраносвязанный белок, вектор (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому способу клонирования генов для селективного и эффективного выделения генов, кодирующих мембраносвязанные белки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Синтезируемые в клетках белки могут быть классифицированы по их индивидуальным характеристикам следующим образом: белки, локализованные во внутриклеточных органеллах, таких как ядро, митохондрия, цитоплазма и т.д.; белки, которые функционируют, будучи связанными с клеточной мембраной, такие как рецепторы и каналообразующие молекулы; и белки, которые функционируют, будучи секретированными во внеклеточную среду, такие как факторы роста и цитокины, и т.д. В частности, белковые молекулы, связанные с клеточной мембраной, отвечают за биологически важные функции, такие как реакции клеток на факторы роста и факторы дифференциации, воспалительные реакции, межклеточные взаимодействия, реакции на гормоны и т.д., и, следовательно, могут являться молекулами-мишенями для диагностических и терапевтических средств, предназначенных для лечения различных типов заболеваний.

В последние годы, как показывает проект по типированию генома, проводится массовое клонирование генов с применением случайных подходов, и собрано огромное количество информации по последовательностям генов, например большое количество ESTs (экспрессируемых маркеров последовательностей) (Matsubara, К Artificial Organs (1996) 20, 823-827). Однако идентификация белка, обладающего целевой функцией, исходя из этих ESTs, никаким образом не является легкой задачей, и для того, чтобы предсказать и анализировать функцию кодируемого белка, исходя из информации о генной последовательности, требуется много времени и усилий. Следовательно, давно существует потребность в способе отбора, по меньшей мере, до некоторой степени, гена, кодирующего белок, который предположительно обладает целевой функцией, на стадии случайного клонирования кДНК.

В качестве решения этой проблемы были разработаны способы клонирования с применением белковой локализации. Например, белки, секретируемые во внеклеточную среду, имеют аминокислотную последовательность, включающую от 15 до 30, или около того, аминокислотных остатков, необходимых для секреции, которые обычно называются секреторной сигнальной последовательностью или лидерной последовательностью.

Tashiro et al. сосредоточили свое внимание на особенностях синтеза этих секреторных белков и разработали способ клонирования, который позволяет специфично отобрать ген, кодирующий секреторный белок (Tashiro et al., Science (1993) 261, 300-603). Если сигнальная последовательность белков, которые обычно секретируются из клетки наружу, например рецептора интерлейкина-2 (IL-2), удалена, они становятся неспособными экспрессироваться на клеточной мембране. Если кДНК, кодирующая секреторную сигнальную последовательность, является гибридной, то рецептор IL-2 может реэкспрессироваться на клеточной мембране в виде гибридного белка. Поскольку клетки, экспрессирующие гибридный белок рецептор IL-2, могут быть отобраны путем распознавания антителами рецептора IL-2, может быть выделена кДНК, кодирующая белок, сигнальная последовательность которого, введенная в клетки, является функционирующей. Этот способ обычно называют SST (улавливание сигнальной последовательности) способ, так как он позволяет селективно клонировать ген, кодирующий сигнальную последовательность. Был также разработан способ клонирования для дрожжей на основе того же принципа (патент США №5536637).

Однако даже если генный фрагмент, кодирующий белок, включающий сигнальную последовательность, получают по этому способу, неизвестно, является ли он секреторным белком или мембраносвязанным белком. Кроме того, этот способ требует применения библиотеки кДНК, включающей 5’ конец, но методики эффективного составления библиотеки кДНК, которая избирательно содержит 5’ конец, не являются в необходимой степени простыми, универсальными методиками.

Недавно Ishihara et al. and Nakauchi et al. опубликовали способ ТМТ (трансмембранного улавливания), который позволяет более селективно клонировать ген, кодирующий мембраносвязанный белок (Yoshikazu Ichihara and Yoshikazu Kurozawa, Abstracts from the Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (1998), №3-509-P-533, Nakauchi et al. WO98/03645). Способ Ishihara et al. основан на принципе, противоположном вышеупомянутому способу SST. А именно гибридизуют внеклеточную область рецептора IL-2 и белок, содержащий область, связанную с клеточной мембраной, кодируемую кДНК, проводят экспрессию рецептора IL-2 на поверхности клеточной мембраны и клетки отбирают, используя антитела против рецептора IL-2. Модельный эксперимент с использованием этого способа подтверждает экспрессию гибридных молекул между типом I или типом II мембраносвязанных белков, или мембраносвязанным белком, заякоренным гликозилфосфатидилинозитолом (GPI), и рецептора IL-2 на клеточной мембране с использованием антител против рецептора IL-2.

Однако при введении библиотеки кДНК в пределах отобранных кДНК также получают белки, не включающие трансмембранную область и мембраносвязанную область. Другими словами, селективность клонирования гена, кодирующего мембраносвязанный белок, в способе ТМТ не является достаточно высокой. Это показывает, например, что, хотя в принципе должны секретироваться все гибридные белки, не имеющие трансмембранной области и GPI якоря, на клеточной мембране могут также происходить в зависимости от структур и аминокислотных составов гибридных белков неспецифическая агглютинация, не обусловленная наличием трансмембранной области и GPI якоря.

Кроме того, в случае применения способа ТМТ в гибридном белке экспрессируется эпитоп, распознаваемый антителами. Поэтому даже если гибридные белки экспрессируются вышеописанным способом и неспецифически абсорбируются на клеточной мембране, антитела будут распознавать и связывать этот эпитоп, если он является доступным. Кроме того, те молекулы на поверхности мембраны, которые находятся на их пути к секреции во внеклеточную среду, также распознаются антителами. Следовательно, желательно, чтобы селективность клеток, экспрессирующих мембраносвязанный белок, полученная при использовании способа ТМТ, была дополнительно улучшена.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение решает проблемы способа ТМТ и предоставляет способ клонирования генов, обладающий превосходной селективностью.

Характерной особенностью настоящего изобретения является выделение гена, кодирующего мембраносвязанный белок, путем присоединения функционального белка к самому гибридному белку, в отличие от традиционного способа ТМТ, несущего эпитоп, распознающий антитела. Настоящий способ таким образом создает возможность селективного выделения генов, кодирующих мембраносвязанные белки.

А именно настоящее изобретение предоставляет:

(1) способ выделения гена, кодирующего мембраносвязанный белок, причем этот способ включает стадии

(i) введение в клетки вектора, включающего ДНК, кодирующую секретируемый функциональный белок, обладающий сродством связывания с антигеном, и кДНК, лигированную ниже 3’ области ДНК, кодирующей функциональный белок,

(ii) экспрессия в клетках гибридного белка, состоящего из секретируемого функционального белка, обладающего сродством связывания с антигеном, и белка, кодируемого кДНК,

(iii) отбор клеток, связывающихся с антигеном путем взаимодействия клеток, экспрессирующих гибридный белок на клеточной мембране, с антигеном, и

(iv) выделение кДНК, встроенной в вектор, из отобранных клеток,

(2) способ по пункту (1), где вектор, вводимый в клетки на стадии (i), получают путем введения кДНК в вектор в сайте ферментативной рестрикции ниже 3’ области ДНК, кодирующей функциональный белок,

(3) способ по пункту (1), где вектор, вводимый в клетки на стадии (i), получают путем введения в вектор ДНК, включающей ДНК, кодирующую функциональный белок, и кДНК, лигированной ниже 3' области ДНК, кодирующей функциональный белок,

(4) способ по любому из пунктов (1)-(3), где ДНК, кодирующую функциональный белок, и кДНК ниже ее 3’ области лигируют с помощью ДНК, кодирующей пептидный линкер,

(5) способ по любому из пунктов (1)-(4), где кДНК, полученную из библиотеки кДНК, получают из клеток млекопитающих,

(6) способ по любому из пунктов (1)-(5), где вектор, вводимый в клетки на стадии (i), включает ДНК, кодирующую секреторную сигнальную последовательность выше 5’ области ДНК, кодирующей функциональный белок,

(7) способ по любому из пунктов (1)-(6), где функциональным белком является антитело,

(8) способ по любому из пунктов (1)-(7), где функциональным белком, обладающим сродством связывания с антигеном, является одноцепочечное антитело, которое предпочтительно является моновалентным или бивалентным,

(9) способ по любому из пунктов (1)-(8), где вектор содержит ДНК, в которой ДНК, кодирующая константный участок антитела, лигирована ниже 3’ области ДНК, кодирующей одноцепочечное антитело,

(10) способ по любому из пунктов (1)-(9), где антиген связан с подложкой,

(11) способ по пункту (10), где подложка предназначена для культивирования клеток,

(12) способ по любому из пунктов (1)-(11), включающий определение, действительно ли ген, полученный из клеток, включает новую последовательность,

(13) способ по пункту (12), включающий скрининг библиотеки кДНК для получения полноразмерного гена из гена, полученного из клеток, гена, включающего новую последовательность,

(14) способ по пункту (13), включающий выделение полноразмерного гена из гена, полученного из клеток, гена, включающего новую последовательность,

(15) набор для выделения гена, кодирующего мембраносвязанный белок, этот набор включает вектор, имеющий сайт распознавания рестрикционного фермента для вставки кДНК ниже 3’ области ДНК, кодирующей секретируемый функциональный белок, обладающий сродством связывания с антигеном, и

(16) набор по пункту (15), дополнительно включающий подложку, с которой связан антиген, и/или клетки, в которые введен вектор.

В качестве мембраносвязанных белков, которые могут быть выделены с помощью способа данного изобретения, могут быть приведены, например, мембраносвязанные белки типа I или типа II, GPI-якорного типа мембраносвязанные белки и подобные им. Мембраносвязанные белки типа I или типа II представляют собой белки, включающие трансмембранные области, которые связываются с мембраной после выхода из клетки N-концевой области или С-концевой области экспрессируемых полипептидов. Трансмембранные области представляют собой области, которые пронизывают насквозь внутреннюю и внешнюю части клеточной мембраны, и так как эта трансмембранная область остается в клеточной мембране, белки фиксируются на клеточной мембране. Трансмембранная область обычно состоит из участков аминокислотной последовательности белка, обогащенных гидрофобными остатками аминокислот. С помощью коммерчески доступной компьютерной программы, например, пакет программного обеспечения для GCG анализа последовательностей (GCG Sequence Analysis Software Package) (Genetic Computer Group, Oxford Molecular Group, Inc.), можно легко предсказать, обладает белок трансмембранной областью или нет. Мембраносвязанные белки GPI-якорного типа представляют собой белки, которые подвергаются модификациям с помощью GPI и внедряются в липидный слой клеточной мембраны посредством GPI (GPI-якорный тип мембраносвязанных белков).

В первой стадии ((i)) способа выделения данного изобретения в клетки вводят вектор, включающий ДНК, кодирующую секретируемый функциональный белок, обладающий сродством связывания с антигеном, и ДНК, в которой кДНК лигирована ниже ее 3’ области.

Термин "функциональный белок, обладающий сродством связывания с антигеном" обозначает белок, который может функционально связываться с определенным антигеном. В качестве функциональных белков предпочтительны те белки, у которых константа связывания составляет 10⁷ М или выше. Более предпочтительно 10⁸ М или выше, и еще более предпочтительно 10⁹ М или выше. Функциональными белками являются, например, антитела, фрагменты антител, одноцепочечные антитела и т.д. Антитела включают две тяжелые цепи (Н цепи) и две легкие цепи (L цепи), эти Н цепи и L цепи связаны посредством дисульфидных связей с образованием единой молекулы антитела. Н цепи и L цепи состоят из вариабельного участка (v участок, Fv) и константного участка (с участок, Fc). Фрагменты антител являются белковыми участками антител, обладающими сродством связывания к антигенам, в качестве примера могут быть приведены Fab, F(ab’)2, Fv и другие. Одноцепочечное антитело (далее здесь упоминается как одноцепочечный Fv (scFv)) представляет собой белок, обладающий сродством связывания с антигеном, белок, в котором Н цепь Fv и L цепь Fv сшиты посредством линкера, и в качестве примера могут быть приведены моновалентное одноцепочечное антитело и бивалентное одноцепочечное антитело. Моновалентные одноцепочечные антитела имеют антигенсвязывающий сайт, включающий одну Н цепь Fv и L цепь Fv, а бивалентные одноцепочечные антитела имеют структуру, в которой две молекулы моновалентных одноцепочечных антител сшиты посредством линкера и имеют два антигенсвязывающих сайта.

К антителам, фрагментам антител или одноцепочечным антителам могут относиться такие, в которых один или несколько аминокислотных остатков могут быть удалены, встроены и/или заменены другими аминокислотными остатками с различными целями, такими как улучшение константы связывания, или такие, которые гибридизованы с другими пептидами или полипептидами, причем все они охватываются термином функциональный белок настоящего изобретения. Кроме того, в качестве антитела, фрагмента антитела или одноцепочечного антитела могут использоваться модифицированные антитела. Примерами модифицированных антител являются химерные антитела и гуманизированные (приближенные к человеческим) антитела. Химерные антитела представляют собой антитела, включающие V область и С область антител, полученных из разных животных. Гуманизированные антитела представляют собой антитела, включающие участок, определяющий комплементарность (CDR), из антитела, полученного из животного, отличающегося от человека, и каркасный участок (FR) и С область из антитела, полученного из человека.

Антигеном, обладающим сродством связывания к функциональному белку данного изобретения, может быть любое вещество, обладающее антигенными свойствами. Примерами являются белки, пептиды, сахара и подобные вещества, предпочтительно белки. Белки, использующиеся в качестве антигенов, представляют собой, например, белки, экспрессирующиеся в клетках или микроорганизмах, сывороточные белки, цитокины, внутриклеточные белки, мембранные белки и т.д.

ДНК, кодирующие антитела, могут быть получены с помощью хорошо известных средств. Например, они могут быть выделены из клеток, продуцирующих антитела, например из гибридом, иммортализированных лимфоцитов, сенсибилизированных антигеном, и клеток, продуцирующих рекомбинантные антитела после введения гена антитела. Кроме того, может быть также использована ДНК, уже которая была выделена и встроена в вектор. Происхождение и тип ДНК, кодирующей антитело, не имеют значения, если она может быть использована в настоящем изобретении.

ДНК, кодирующая фрагмент антитела или одноцепочечное антитело, может быть сконструирована из ДНК, кодирующей антитело с помощью обычно использующихся следующих способов. ДНК, кодирующую моновалентное одноцепочечное анититело, получают путем лигирования ДНК, кодирующей Н цепь V области (Н цепь Fv) антитела, ДНК, кодирующей линкер, и ДНК, кодирующей L цепь V области (L цепь Fv). Линкер не расщепляется, пока он может стерически воспроизводить Н цепь Fv и L цепь Fv так, чтобы они имели антигенное сродство. Предпочтительно он является пептидным линкером и включает, например, от 12 до 19 аминокислотных остатков (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). В качестве примера может быть приведен пептидный линкер, имеющий следующую аминокислотную последовательность: GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer ((Gly₄Sеr)₃) (SEQ ID NO: 1). ДНК, кодирующую бивалентное одноцепочечное антитело, конструируют путем сшивки 5’ конца и 3’ конца двух молекул ДНК, кодирующих моновалентные одноцепочечные антитела, с помощью ДНК, кодирующей пептидный линкер. Пептидный линкер, лигирующий два одноцепочечных антитела, включает, например, аминокислотную последовательность GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer ((Gly₄Sеr)₃) (SEQ ID NO: 1).

Для того, чтобы увеличить эффективность клонирования в данном изобретении, например, при использовании одноцепочечного Fv в качестве функционального белка, является предпочтительным, чтобы С конец содержал небольшое количество гидрофобных аминокислот, конкретно, может использоваться одноцепочечный Fv, в котором удален шарнирный участок, как описано в примерах, приведенных ниже. Кроме того, предпочтительным является то, что в данном изобретении стабильность и эффективность экспрессии могут быть увеличены путем лигирования дополнительно домена начала репликации секреторного белка, например ДНК, кодирующей аминокислоты константного участка антитела, как описано ниже в примерах, с С-концом одноцепочечного Fv.

Для функционального белка, который должен секретироваться, может быть использована секреторная сигнальная последовательность. А именно достаточно лигировать ДНК, кодирующую секреторную сигнальную последовательность выше 5’ области ДНК, кодирующей функциональный белок, обладающий сродством связывания с антигеном. В качестве секреторной сигнальной последовательности применяется последовательность, подходящая для клеток, использующихся для экспрессии библиотеки кДНК и секреции белков. Секреторной сигнальной последовательностью может быть сигнальная последовательность любого секреторного белка, если она может способствовать секреции функционального белка. Предпочтительно полученными из животных секреторными сигнальными последовательностями являются последовательности, полученные из млекопитающих, например сигнальная последовательность человеческого иммуноглобулина (Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991)), цитокинов и рецепторов цитокинов.

кДНК, лигированную ниже 3’ области ДНК, кодирующей функциональный белок, предпочтительно получают из библиотеки кДНК. В качестве библиотеки кДНК может использоваться библиотека, полученная с использованием хорошо известных методов, или коммерчески доступная библиотека. Библиотека кДНК может быть получена путем выделения мРНК из целевых образцов и синтеза кДНК на выделенной мРНК.

Источниками, из которых может быть выделена мРНК, являются, например, млекопитающие, животные, отличные от млекопитающих, растения, дрожжи, бактерии или сине-зеленые водоросли, но предпочтительно используются млекопитающие. В качестве примеров млекопитающих могут быть приведены люди, обезьяны, кролики, крысы, мыши и им подобные, особенно предпочтительными являются люди. Животными, отличными от млекопитающих, являются, например, насекомые, такие как плодовые мушки (Drosophila) и т.д.

Источниками, из которых может быть выделена мРНК, могут быть любые источники, например клетки, полученные из живого организма, устоявшихся клеточных линий, эмбрионов, тканей, крови или органов. Типичными примерами являются остеобласты, кроветворные стволовые клетки, клетки гладкой мускулатуры, нейроны, клетки стромы, ES клетки, клетки печени, кишечника, легких, почек, лимфатических узлов и т.д.

Выделение мРНК может быть произведено путем суспендирования образцов для выделения в присутствии традиционно используемого буфера в соответствии с традиционными методиками. Для получения общей мРНК в качестве первой стадии выделения мРНК может применяться метод ультрацентрифугирования с гуанозином (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) или метод AGPC (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) и им подобные. Далее, для выделения мРНК из общей мРНК, например, может быть использован набор для очистки мРНК (Pharmacia) и т.п. Например, может быть также использован набор для очистки мРНК QuickPrep (Pharmacia) в качестве коммерчески доступного набора для концентрирования мРНК посредством аффинной очистки с использованием олиго dТ.

кДНК синтезируют на полученной мРНК с использованием обратной транскриптазы. Можно использовать коммерчески доступную обратную транскриптазу. Одноцепочечная кДНК, комплементарная мРНК, может быть синтезирована с использованием олиго dT праймера, комплементарного поли А мРНК, или с использованием олигонуклеотида случайной последовательности в качестве праймера. Например, для синтеза кДНК может быть использован набор для синтеза первой цепи кДНК с обратной транскриптазой AMV (Seikagaku Corporation) и подобные ему. Двухцепочечную кДНК получают из полученной одноцепочечной кДНК с помощью ДНК-полимеразы.

Кроме того, библиотека кДНК может быть выборочно сокращена для конкретной цели в соответствии с традиционными методиками. Для конкретной цели, например, для получения кДНК гена, в котором продуктивность экспрессии варьирует, может быть применен метод дифференциального клонирования (Lau, L.F. et al., and Nathans, D. EMBO J. (1985) 4, 3145-3151), дифференциальный дисплейный метод (Liang, P. and Pardee, А.В. Science (1992) 257, 967-971), метод вычитающего клонирования (Nucleic Acids Research (1988) 16, 10937), метод серийного анализа экспрессии генов (метод SAGE) (Velculescu, V.E. et al. Science (1995) 270, 484-487). Для сокращения (библиотеки) кДНК, кодирующей секреторный белок, может также применяться метод SST (Tashiro, К. et al., Science (1993) 261, 300-603) и метод, описанный в патенте США №5536637.

Векторами могут быть любые векторы, которые могут трансформировать клетки и способствуют экспрессии содержащихся в них ДНК. Предпочтительно в качестве экспрессирующего вектора выбрать вектор, который может работать в клетке, которая должна быть трансформирована. Примерами экспрессирующих векторов являются плазмидные векторы и вирусные векторы.

Полученную кДНК встраивают в вектор. Например, кДНК может быть введена в вектор ниже 3’ области ДНК, кодирующей функциональный белок, которая уже содержится в векторе. С этой целью подходящий сайт ферментативной рестрикции, например сайт мультиклонирования, конструируют ниже 3’ области ДНК, кодирующей функциональный белок, и кДНК вводят в этот сайт. А также вначале кДНК может быть вначале лигирована ниже ДНК, кодирующей функциональный белок, и затем полученная ДНК может быть введена в вектор. Конструкция ДНК может быть введена в подходящий сайт ферментативной рестрикции, включенный в векторную ДНК. При получении вектора ДНК, кодирующая функциональный белок, и кДНК, расположенная ниже 3’ области, могут быть лигированы непосредственно, или могут быть лигированы через ДНК, кодирующую пептидный линкер, для облегчения связывания функционального белка с антигеном.

Экспрессирующий вектор предпочтительно содержит участок, регулирующий экспрессию, необходимый для экспрессии целевой ДНК в клетках. В качестве участков, регулирующих экспрессию, могут быть приведены промоторы/энхансеры, а именно человеческий EF1α промотор, HCMV промотор или SV40 промотор и им подобные. Полученные таким образом экспрессирующие векторы могут быть введены в клетки с помощью традиционных методов. Примерами таких методов являются метод электрофореза (EMBO J. (1982) 1, 841-845), кальций фосфатный метод (Virology (1973) 52, 456-467), липосомальный метод, DEAE декстрановый метод и др.

Клеткой, которая подвергается трансформации, может являться любая клетка, если секреторная сигнальная последовательность и участок, регулирующий последовательность, содержащиеся в векторе, функционируют в этих клетках и предпочтительно представляют собой животные клетки, например COS, CHO, BAF3 и др.

На второй стадии ((ii)) способа данного изобретения гибридный белок, состоящий из секретируемого функционального белка, обладающего сродством связывания с антигеном, и белка, кодируемого кДНК, экспрессируется в клетках. Конкретно клетки трансформируют с помощью вектора, содержащего ДНК, кодирующую вышеупомянутый гибридный белок, и культивируют в условиях, подходящих для роста клеток. Культуру ведут в соответствии с традиционными методами. Например, в качестве культуральной среды можно использовать DMEM, MEM, RPMI1640 и IMDM, их можно использовать вместе с растворами с добавлением сыворотки, такими как фетальная телячья сыворотка.

Для того, чтобы экспрессировать ДНК в клетках, можно использовать систему, индуцирующую экспрессию ДНК. Например, если используются системы, регулирующие экспрессию с использованием тетрациклина или промоторов/энхансеров, которые экспрессируются в ответ на стимулы, такие как цитокины, липополисахариды (LPS), стероидные гормоны и др., возможно индуцировать экспрессию ДНК в клетках путем стимуляции клеток. При экспрессии ДНК продуцируется гибридный белок, содержащий генные продукты гена, кодирующего функциональный белок, и кДНК. Если кДНК кодирует мембраносвязанный белок, секреторная сигнальная последовательность изымается в процессе синтеза гибридного белка на гранулярном эндоплазматическом ретикулюме (ER), и гибридный белок экспрессируется на клеточной мембране. Если ДНК, кодирующая пептидный линкер, лигирована между ДНК, кодирующей функциональный белок, и кДНК, экспрессируется гибридный белок, включающий пептидный линкер между функциональным белком и генным продуктом кДНК.

Третья стадия ((iii)) способа данного изобретения включает выбор клеток, связывающихся с антигеном, путем взаимодействия клеток, экспрессирующих гибридный белок на клеточной мембране, с антигеном. Предпочтительно антиген является связанным с подложкой. Примерами подложек являются подложки для культивирования клеток, предпочтительно планшеты, такие как пластиковые планшеты, многолуночные планшеты, культуральные чашки или шарики. В качестве шариков могут использоваться магнитные шарики. Антиген может быть присоединен к подложке с помощью традиционных методов. Например, антиген может быть присоединен к подложке путем добавления антигена к планшету в присутствии подходящего буфера, оставления на ночь и промывания. Антиген может быть присоединен к подложке через антитело, которое специфично связывается с антигеном. Например, после того, как антитело, специфично связывающееся с антигеном, добавляют и фиксируют на планшете, может быть добавлен антиген для присоединения его к подложке. Альтернативно, антиген, который не связан с подложкой и клеткой, может быть присоединен первым, и затем клетка может связываться с подложкой с помощью антитела, которое специфично связывается с антигеном, иммобилизованном на подложке. После связывания антигена, не связанного с подложкой и клеткой, антиген и клетка могут быть поперечно сшиты с помощью агентов для поперечной сшивки, таких как DMS (диметилсульберимидат), BS³ (бис(сульфосукцинимидил)суберат) и DSS (дисукцинимидил суберат).

Несвязанные с антигеном клетки удаляют, а клетки, связанные с антигеном, могут быть отобраны путем инкубирования планшета в условиях, при которых клетки могут связываться с антигеном на планшете, и после того, как клетки свяжутся с антигеном, планшет промывают в подходящих условиях. Для выбора клеток, связанных с антигеном, можно также использовать проточную цитометрию (FACS (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции)). Клетки, отобранные с помощью таких методов, собирают. В результате повторения этих методов от двух до нескольких раз целевые клетки могут быть получены с большей избирательностью.

Четвертая стадия ((iv)) способа данного изобретения включает выделение кДНК, встроенной в вектор, из отобранных клеток. Вначале вектор экстрагируют из клеток, связанных с планшетом, в которые был введен этот вектор, затем выделяют кДНК, содержащуюся в векторе. Если используют плазмидный вектор, то его экстрагируют, вводят в Е.coli, амплифицируют там и готовят препараты для выделения кДНК. Далее определяют нуклеотидную последовательность выделенного гена. Альтернативно, конструируют праймер на основе нуклеотидной последовательности данного вектора, с его помощью амплифицируют кДНК и определяют нуклеотидную последовательность. Если используют ретровирусный вектор, кДНК амплифицируют методом PCR подобным образом и определяют нуклеотидную последовательность.

Способ настоящего изобретения может включать стадию анализа для определения, действительно ли выделенный ранее ген включает новую последовательность. Новизну последовательности выделенной ДНК можно анализировать путем анализа гомологии последовательности (эквивалентность аминокислотных остатков) с использованием базы данных ДНК, например GENBANK, EMBL и др. После определения гомологии может следовать алгоритм, описанный в "Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730".

Способ настоящего изобретения может также включать стадию скрининга библиотеки кДНК для получения полноразмерного гена из ранее выделенного гена. Следуя традиционным методам, скрининг библиотеки кДНК может быть проведен следующим образом. Вначале выделенный ген метят, используют в качестве зонда и подвергают гибридизации с библиотекой кДНК. Затем, используя метку, определяют клон ДНК, связанный с фрагментом выделенного гена.

Способ настоящего изобретения может также включать стадию выделения полноразмерного гена из выделенного ранее гена. Это может быть проведено путем скрининга библиотеки кДНК, как описано выше, выделения клонов кДНК, детектированных с помощью традиционных методов, и определения их нуклеотидной последовательности.

Кроме того, настоящее изобретение включает набор, использующийся для выделения гена, кодирующего вышеупомянутый мембраносвязанный белок. Набор данного изобретения включает вектор, имеющий сайт распознавания рестрикционного фермента для вставки кДНК ниже 3’ области ДНК, кодирующей секретируемый, функциональный белок, обладающий сродством связывания с антигеном. Предпочтительно набор данного изобретения дополнительно включает подложку, с которой связан антиген, и/или клетки, в которые должен быть введен вектор. Дополнительно могут содержаться промывочные растворы для пэннинга (метод анализа путем "просеивания" анализируемого содержимого через сорбент или подложку с иммобилизованным лигандом), агенты для поперечной сшивки для образования мостиковых связей клеток с антигеном, библиотека кДНК, растворы для сбора ДНК путем растворения отобранных клеток и др.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 схематично показана структура экспрессирующего вектора для клонирования pTMT-SR345. "SR345" на фигуре определяет внеклеточную область человеческого рецептора IL-6, "NEO^r" - ген устойчивости к неомицину, "EF1α" - область промотора/энхансера фактора элонгации пептидной цепи 1α, "SV40E" - ранний промотор/энхансер SV40 и "Аmр^r" - ген устойчивости к ампициллину.

На фиг.2 схематично показана структура экспрессирующего вектора pTMT-scFv. "scFv" на фигуре определяет одноцепочечное антитело, а "Ig’s" - секреторный сигнальный пептид антитела. Другие символы имеют такое же значение, как на фиг.1.

На фиг.3 показано число колоний, выделенных с помощью пэннинга с использованием клеток COS-7, в которые была введена плазмидная ДНК.

На фиг.4 схематично показана структура экспрессирующего вектора pTMT-BvGS3. "hPM1-BvGS3" на фигуре определяет бивалентное одноцепочечное антитело. Другие символы имеют такое же значение, как на фиг.1 и фиг.2.

На фиг.5 показана гистограмма, полученная при анализе клеток COS-7, в которые были введены различные типы плазмидной ДНК, с помощью проточного цитометра с использованием крысиных поликлональных антител против гуманизированных РМ-1 антител.

На фиг.6 показана гистограмма, полученная при анализе клеток COS-7, в которые были введены различные типы плазмидной ДНК, с помощью проточного цитометра с использованием мышиных антител МТ-18 против рецептора IL-6.

На фиг.7 схематично показана структура экспрессирующего вектора pTMT-shPM1F-K. "shPM1F-Kappa" на фигуре определяет одноцепочечное антитело. Другие символы имеют такое же значение, как на фиг.1 и фиг.2.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ клонирования данного изобретения может быть, например, осуществлен, как описано ниже, но настоящее изобретение никоим образом этим не ограничивается.

Пример 1: Конструирование экспрессирующего вектора для клонирования pTMT-SR345

Конструируют экспрессирующий клонирующий вектор pTMT-SR345. SR345, кодируемый ДНК, содержащейся в экспрессирующем клонирующем векторе pTMT-SR345, представляет собой часть внеклеточного участка человеческого рецептора IL-6, и состоит из 345 аминокислотных остатков из N-конца. В экспрессирующем клонирующем векторе pTMT-SR345 белок, кодируемый кДНК, встроенной ниже ДНК, кодирующей SR345, экспрессируется в виде гибридного белка с SR345. Нуклеотидная последовательность, кодирующая SR345, показана в SEQ ID NO: 2 вместе с аминокислотной последовательностью.

Вначале, для того чтобы амплифицировать фрагмент величиной прибл. 1,1 т.п.н. (тысяч оснований) из кДНК рецептора IL-6, содержащий кДНК, кодирующую SR345 (Yamasaki, К. et al, Science (1988) 241, 825-828), конструируют PCR праймеры IL6R1 (SEQ ID NO: 3) и IL6R2 (SEQ ID NO: 4). Реакционную смесь для PCR (100 мкл), содержащую 10 мМ Tris-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCl, 0,1 мM dNTP, 1,5 мM MgCl₂, 100 пмоль каждого из вышеупомянутых праймеров, 100 нг матрицы ДНК (кДНК, кодирующей рецептор IL-6) и 5 единиц фермента Ampli-Taq Gold подвергают денатурации при 94°С, 30 циклам инкубации, состоящим из 1 мин при 94°С, 1 мин при 55°С и 1 мин при 72°С, и, наконец, инкубируют 10 мин при 72°С. Амплифицированный фрагмент ДНК собирают, очищают методом гель-электрофореза в 1% низкоплавкой агарозе, расщепляют с помощью EcoRI и вставляют в EcoRI сайт экспрессирующего вектора pCOS1. Полученным продуктом трансфицируют Е.coli и готовят препараты плазмид для получения тех из них, в которых фрагмент ДНК встроен в правильном направлении. Экспрессирующий вектор pCOS1 конструируют из плазмиды HEF-PMh-g γ 1 (см. WО92/19759) путем делеции содержащихся генов с помощью расщепления под действием EcoRI и Smal и лигирования с помощью EcoRI-NotI-BamHI Adaptor (TaKaRa).

Далее EcoRI сайт выше SR345 удаляют с помощью следующего метода. Вначале плазмиду частично расщепляют с помощью EcoRI и собирают линейные молекулы, полученные путем расщепления по одному сайту. Затупляют концы с помощью ДНК-полимеразы I (фрагмент Klenow), проводят рециркуляризацию и трансфицируют Е.coli для получения экспрессирующего вектора для клонирования pTMT-SR345. Структура экспрессирующего вектора для клонирования pTMT-SR345 приведена на фиг.1.

Пример 2: Конструирование экспрессирующего вектора рТМТ-scFv

Конструируют экспрессирующий вектор pTMT-scFv. Одноцепочечное антитело (scFv), кодируемое ДНК, содержащейся в экспрессирующем векторе pTMT-scFv, конструируют, используя вариабельный участок гуманизированного моноклонального антитела РМ-1, который распознает человеческий рецептор IL-6, и линкерный участок. В экспрессирующем векторе pTMT-scFv белок, кодируемый кДНК, встроенной ниже ДНК, кодирующей scFv, экспрессируется в виде гибридного белка с scFv. Нуклеотидная последовательность гена scFv приведена в SEQ ID NO: 5 вместе с аминокислотной последовательностью.

1) Амплификация фрагмента ДНК, кодирующего V-участок антитела

Гены Н-цепи и L-цепи V-участка гуманизированного антитела РМ1 (Sato, К et al. Cancer Res. (1993) 53, 851-856) амплифицируют методом PCR. Обратный праймер ТМТ1 (SEQ ID NO: 6) для Н-цепи V-участка конструируют таким образом, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец Н-цепи V-участка, и включал сайт распознавания рестрикционного фермента SalI. Прямой праймер LINK1 (SEQ ID NO: 7) для Н-цепи V-участка конструируют таким образом, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец Н-цепи V-участка, и включал 5’ конец последовательности линкерного участка. Кроме того, обратный праймер LINK3 (SEQ ID NO: 8) для L-цепи V-участка конструируют таким образом, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец L-цепи V-участка, и включал 3’ конец последовательности линкерного участка. Прямой праймер SCP-C (SEQ ID NO: 9) для L-цепи V-участка конструируют таким образом, чтобы он гибридизовался с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, образующую L-цепь константного участка шарнирного сайта, а также включал сайт распознавания рестрикционного фермента HindIII, нуклеотидную последовательность, кодирующую FLAG пептид (SEQ ID NO: 10) и два повторяющихся трансляционных стоп-кодона.

Ре