Лечение -галактозидазной а недостаточности

Лечение -галактозидазной а недостаточности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения α -галактозидазной А недостаточности.

Предшествующий уровень техники

Болезнь Фабри представляет собой Х-сцепленную наследственную болезнь, связанную с накоплением лизосом, характеризующуюся тяжелым поражением почек, ангиокератомами и сердечно-сосудистыми нарушениями, включая увеличение желудочка и недостаточность митрального клапана. Болезнь Фабри также воздействует на периферическую нервную систему, вызывая приступы мучительных жгучих болей в конечностях. Причиной развития болезни Фабри является дефицит фермента α -галактозидазы A (α -Gal A). α -Gal А представляет собой лизосомную гликогидролазу, которая отщепляет концевые α -галактозильные группы различных гликоконъюгатов. Болезнь Фабри приводит к блокированию катаболизма нейтрального гликосфинголипида, керамид-тригексозида (СТН) и к аккумуляции субстрата фермента в клетках и в кровотоке.

Вследствие того что данное заболевание имеет X-сцепленный тип наследования, то большинство пациентов с болезнью Фабри составляют мужчины. Хотя у гетерозиготных женщин наблюдаются серьезные поражения, однако, в большинстве случаев, эти гетерозиготные женщины не обнаруживают каких-либо симптомов поражения или обнаруживают относительно слабые симптомы (такие как характерное помутнение роговицы). Атипический вариант болезни Фабри, проявляющийся в низкой остаточной активности α -Gal А и либо обнаруживающий очень слабые симптомы, либо не обнаруживающий никаких других явных симптомов, характерных для болезни Фабри, коррелирует с гипертрофией левого желудочка и заболеванием сердца. Nakano et al. New Engl. J.Med. 333:288-293 (1995). Причиной таких патологий сердца может быть снижение активности α -Gal A.

Были выделены и секвенированы кДНК и ген, кодирующие α -Gal А человека. α -Gal А человека экспрессируется в виде полипептида из 429 аминокислот, где N-концевые 31 аминокислота представляют собой сигнальный пептид. Этот человеческий фермент был экспрессирован в клетках яичника китайского хомячка (СНО) (Desnick et al., патент США №5356804; loannou et al., J.Cell.Biol. 119: 1137 (1992)) и в клетках насекомых (Calhoun et al., WO 90/11353).

Однако современные препараты α -Gal А имеют ограниченную эффективность. Методы получения α -Gal А с относительно высокой чистотой зависят от использования аффинной хроматографии с применением комбинации аффинной хроматографии на лектине (конкавалине A (Con А)-Сефарозе®) и аффинной хроматографии, основанной на связывании α -Gal А с аналогом субстрата N-6-аминогексаноил-α -В-галактозиламином, связанным с сефарозной матрицей (Sepharose®). См., например, Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1307-1316 (1981). Использование смол, обладающих аффинностью к белку лектину, и смол, являющихся аналогом субстрата, обычно ассоциировано с непрерывным выщелачиванием аффинного агента из твердого носителя (Marikar et al., Anal. Biochem. 201:306-310 (1992)), что приводит к загрязнению очищенного продукта аффинным агентом либо в свободной форме в растворе, либо в форме, связанной с проэлюированным белком. Такие загрязнения делают этот продукт неприемлемым для использования в фармацевтических препаратах. Связанные аналоги субстратов и лектины могут также оказывать значительные негативные эффекты на ферментативные, функциональные и структурные свойства белков. Более того, α -Gal А, получаемая известными методами, быстро выводится печенью.

Таким образом, разработка схемы очистки с использованием стандартных хроматографических смол, являющихся коммерчески доступными и обладающих качеством, подходящим для их широкомасштабного коммерческого использования, которые позволят получить препарат α -Gal А, не содержащий аффинного агента, остается актуальной. Кроме того, также остается актуальной необходимость в получении препаратов α -Gal А с более продолжительным временем полужизни в кровотоке и с повышенным уровнем их поглощения в конкретных тканях, не относящихся к печени.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к высокоочищенным препаратам α -Gal А и к различным способам очистки гликоформ α -Gal

А. Настоящее изобретение также относится к препаратам α -Gal A с измененным зарядом и к способам получения таких препаратов. Изменение заряда достигается увеличением содержания сиаловой кислоты в α -Gal А и/или увеличением уровня фосфорилирования α -Gal А. Кроме того, настоящее изобретение относится к препаратам α -Gal А, имеющим более продолжительное время полужизни в кровотоке млекопитающего-хозяина и к способам их получения. И наконец, настоящее изобретение относится к способам и к дозам введения препарата α -Gal А индивидууму. Препараты α -Gal А настоящего изобретения могут быть использованы для лечения индивидуумов с болезнью Фабри или с атипическим вариантом болезни Фабри, например, конкретных групп пациентов, страдающих болезнью Фабри с преобладающими сердечно-сосудистыми патологиями, такими как увеличение желудочков, например гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ) и/или недостаточность митрального клапана, или групп пациентов, страдающих болезнью Фабри с преобладающими почечными нарушениями.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлен 210 п.н. - зонд, который был использован для выделения кДНК α -Gal А из библиотеки кДНК фибробластов человека (SEQ ID NО:1). Эта последовательность происходит от экзона 7 гена α -Gal А. Зонд был выделен из геномной ДНК человека с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Подчеркнутые на фиг.1 области соответствуют последовательностям праймеров для амплификации.

На фиг.2 представлена последовательность ДНК-фрагмента, которую завершает 5'-конец кДНК-клона α -Gal A (SEQ ID NО:2). Этот фрагмент был амплифицирован из геномной ДНК человека с помощью ПЦР. Подчеркнутые области соответствуют последовательностям праймеров. Также показаны положения NcoI- и SacII-сайтов рестриктирующих эндонуклеаз, которые были использованы для субклонирования, как описано в Примере 1.

На фиг.3 представлена последовательность кДНК α -Gal A, включающая последовательность, которая кодирует сигнальный пептид (SEQ ID NO:3).

На фиг.4 схематически представлена карта pXAG-16, α -Gal А-экспрессирующей конструкции, которая включает промотор CMV (цитомегаловируса), экзон 1 и первый интрон, последовательность, кодирующую сигнальный пептид чГР и первый интрон, кДНК, кодирующую α -Gal А (в которой отсутствует последовательность сигнального пептида α -Gal А) и 3'UTS чГР. pcDNeo указывает на положение гена nео, происходящего от плазмиды pcDNeo.

На фиг.5 схематически представлена карта pXAG-28 конструкции, экспрессирующей α -Gal А, которая включает промотор коллагена Iα 2 и первый экзон 1, интрон β -актина, последовательность, кодирующую сигнальный пептид чГР и первый интрон, кДНК, кодирующую α -Gal А (в которой отсутствует последовательность сигнального пептида α -Gal А) и 3'UTS чГР. pcDNeo указывает на положение гена nео, происходящего от плазмиды pcDNeo.

На фиг.6 представлена аминокислотная последовательность α -Gal А человека (SEQ ID NO:4).

На фиг.7 представлена кДНК-последовательность, кодирующая α -Gal А человека (без сигнального пептида) (SEQ ID NO:5).

На фиг.8 представлена ахроматограмма стадии очистки α -Gal А с использованием бутилсефарозной смолы (Butyl Sepharose®). Показано поглощение при 280 нм (сплошная линия) и активность α -Gal А (пунктирная линия) выбранной фракции.

На фиг.9 схематически представлена карта pGA213C.

На фиг.10, в виде диаграммы, представлена конструкция для целевой доставки, pGA213C, и гомологичная рекомбинация с эндогенным локусом α -галактозидазы А. pGA213C изображена в виде последовательностей для доставки, расположенных выше соответствующих последовательностей в локусе α -галактозидазы А на хромосоме X. Положения по отношению к инициирующему кодону метионина ATG показаны номерами, обозначенным выше линейных карт. Активационный компонент, содержащий последовательности мышиного гена dhfr, бактериального гена nео и промотора CMV/интрона альдолазы, показан выше положения (-221), в которые они были встроены путем клонирования ДНК. Последовательности, кодирующие α -галактозидазу А, показаны затемненными рамками. Некодирующие геномные последовательности α -галактозидазы показаны слегка заштрихованными рамками. Крупные стрелки указывают на направление транскрипции комет экспрессии dhfr и nео. Сплайсинг мРНК GA-GAL после успешной доставки и активации гена показан сегментированной линией, расположенной ниже карты локуса активированной α -галактозидазы А (GA-GAL).

Подробное описание изобретения

Введение

Описанное здесь изобретение относится к некоторым новым препаратам α -Gal А и к способам их получения, а также к способам лечения пациентов с болезнью Фабри или с атипическими вариантами болезни Фабри с использованием данных препаратов. Некоторые рассматриваемые репрезентативные варианты осуществления изобретения систематизированы и подробно описаны ниже.

В настоящем изобретении рассматривается использование α -Gal А, продуцируемой в любой клетке (в клетке, продуцирующей α -Gal A), для лечения болезни Фабри. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используется человеческая α -Gal А, продуцируемая стандартными методами генной инженерии (на основе введения клонированного гена или кДНК α -Gal А в клетку-хозяина) или путем активации гена.

Настоящее изобретение относится к препаратам и к способам получения препаратов, которые содержат α -Gal А, имеющую более высокую степень чистоты по сравнению с α -Gal А, полученной ранее. С использованием методов очистки настоящего изобретения композиции препаратов α -Gal А человека предпочтительно очищают, по крайней мере, до 98%-ной гомогенности, более предпочтительно, по крайней мере, до 99%-ной гомогенности, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, до 99,5%-ной гомогенности, как было определено с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН или с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Удельная активность препаратов α -Gal А настоящего изобретения предпочтительно составляет, по крайней мере, 2,0× 10⁶ единиц/мг белка, более предпочтительно, по крайней мере, 3,0× 10⁶ единиц/мг белка и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 3,5× 10⁶ единиц/мг белка.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения препарат α -Gal А очищают путем отделения различных гликоформ α -Gal А от других компонентов на смоле для гидрофобного взаимодействия, но не проводят стадию хроматографии на лектине. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, функциональная группа смолы для гидрофобного взаимодействия включает бутильную группу.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения, препарат α -Gal А очищают сначала путем связывания различных гликоформ α -Gal А с катионнообменной смолой на колонке при кислотном рН в уравновешивающем буфере. Затем эту колонку промывают уравновешивающим буфером для элюирования несвязанного материала и указанные различные гликоформы α -Gal A элюируют с использованием в качестве элюирующего раствора солевого раствора при 10-100 мМ, буферного раствора с рН 4-5 или их комбинации. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения буфер для уравновешивания имеет рН около 4,4.

В другом альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения, препарат α -Gal А очищают путем отделения различных гликоформ α -Gal А в образце от других компонентов данного образца с использованием процедуры очистки, включающей стадию проведения, по крайней мере, одной из хроматографий, таких как хроматофокусирующая хроматография, аффинная хроматография на хелате металла или иммунноаффинная хроматография.

Кроме того, настоящее изобретение относится к препаратам α -Gal А и к способам получения препаратов α -Gal А, которые содержат α -Gal А с измененным зарядом. Данные препараты могут включать различные гликоформы α -Gal А. Изменение заряда достигаются путем увеличения содержания сиаловой кислоты в препаратах α -Gal А и/или путем повышения уровня фосфорилирования препаратов α -Gal A.

Содержание сиаловой кислоты в препаратах α -Gal А увеличивают (i) путем выделения высоко заряженных и/или более высокомолекулярных гликоформ α -Gal А в процессе очистки или после очистки; (ii) путем присоединения остатков сиаловой кислоты с использованием клеток, генетически модифицированных (либо стандартными методами генной инженерии, либо активацией гена) для экспрессии гена или кДНК сиалилтрансферазы, или (iii) путем ферментации или культивирования клеток, экспрессирующих данный фермент в среде с низким содержанием аммония.

Уровень фосфорилирования препаратов α -Gal А увеличивают (i) путем присоединения фосфатных остатков с использованием клеток, генетически модифицированных (либо стандартными методами генной инженерии, либо путем активации гена) для экспрессии гена или кДНК фосфорилтрансферазы, или (ii) путем добавления ингибиторов фосфатазы к культивированным клеткам.

С использованием способов настоящего изобретения получают препараты гликозилированной α -Gal А человека, где заряженными являются от 35 до 85% олигосахаридов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения заряженными являются, по крайней мере, 35% олигосахаридов. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения заряженными являются, по крайней мере, 50% олигосахаридов.

Альтернативные предпочтительные препараты человеческой гликозилированной α -Gal А имеют множество гликоформ α -Gal А, содержащих предпочтительно, по крайней мере, 20%, более предпочтительно, по крайней мере, 50%, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, 70% сложных гликанов с 2-4 остатками сиаловой кислоты. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения препараты человеческой гликозилированной α -Gal А с множеством гликоформ имеют олигосахаридный заряд, измеряемый числом Z, которое превышает 100, предпочтительно превышает 150, а более предпочтительно превышает 170. В другом альтернативном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения препараты человеческой гликозилированной α -Gal А с множеством гликоформ имеют, в среднем, по крайней мере, 16-50%, предпочтительно 25-50%, а более предпочтительно, по крайней мере, 30% фосфорилированных гликоформ. В другом альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения в указанных препаратах с множеством гликоформ, 50-75%, а предпочтительно 60% гликанов от общего числа гликанов являются сиалилированными.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения препарат гликозилированной α -Gal А, имеющий повышенный олигосахаридный заряд, получают сначала путем введения полинуклеотида, кодирующего трансферазу GlcNAc III (GnT-III), в клетку, продуцирующую α -Gal А, или путем введения, посредством гомологичной рекомбинации, регуляторной последовательности, контролирующей экспрессию эндогенного гена GnT-III. Затем клетку, продуцирующую α -Gal А, культивируют в условиях культивирования, способствующих экспрессии α -Gal А и GnT-III. Конечная стадия предусматривает выделение препарата α -Gal А с увеличенным олигосахаридным зарядом.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения препарат гликозилированной α -Gal А, имеющий повышенный олигосахаридный заряд, продуцируют сначала путем введения полинуклеотида, кодирующего сиалилтрансферазу, в клетку, продуцирующую α -Gal А, или путем введения, посредством гомологичной рекомбинации, регуляторной последовательности, контролирующей экспрессию эндогенного гена сиалилтрансферазы. Затем клетку, продуцирующую α -Gal А, культивируют в условиях культивирования, способствующих экспрессии α -Gal А и сиалилтрансферазы. Конечная стадия предусматривает выделение препарата α -Gal А с повышенным олигосахаридным зарядом. Предпочтительными сиалилтрансферазами являются α 2,3-сиалилтрансфераза и α 2,6-сиалилтрансфераза. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает дополнительную стадию отбора гликоформ α -Gal А с увеличенным размером или увеличенным зарядом путем фракционирования или очистки данного препарата.

В другом варианте осуществления изобретения препарат гликозилированной α -Gal А с повышенным уровнем сиалилирования получают путем контактирования клетки, продуцирующей α -Gal А, с культуральной средой, содержащей концентрацию аммония ниже 10 мМ, а более предпочтительно ниже 2 мМ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения среду с низким содержанием аммония получают путем добавления глутаминсинтетазы к указанной культуральной среде. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения среду с низким содержанием аммония получают путем непрерывной или периодической перфузии α -Gal А-продуцирующей клетки свежей культуральной средой для поддержания концентрации аммония ниже 10 мМ, а более предпочтительно ниже 2 мМ.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения препарат гликозилированной α -Gal А с повышенным уровнем фосфорилирования получают сначала путем введения в α -Gal А-продуцирующую клетку полинуклеотида, кодирующего фосфорилтрансферазу, или путем введения регуляторной последовательности посредством гомологичной рекомбинации, регулирующей экспрессию эндогенного гена фосфорилтрансферазы. Затем клетку, продуцирующую α -Gal А, культивируют в условиях культивирования, способствующих экспрессии α -Gal А и фосфорилтрансферазы. Затем выделяют препарат α -Gal А, который имеет повышенный уровень фосфорилирования по сравнению с препаратами α -Gal А, продуцированной в данной клетке без полинуклеотида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения препараты α -Gal А, продуцируемые способами настоящего изобретения, имеют множество гликоформ, из которых 16-50%, предпочтительно 25-50%, а более предпочтительно, по крайней мере, 30% являются фосфорилированными. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает дополнительную стадию отбора гликоформ α -Gal А с увеличенным размером или увеличенным зарядом путем фракционирования или очистки данного препарата.

В еще одном варианте осуществления изобретения препарат гликозилированной α -Gal А с повышенным уровнем фосфорилирования получают путем добавления к культивированным клеткам ингибитора фосфатазы, например бромтетрамизола. Низкие уровни щелочной фосфатазы бычьей плазмы могут присутствовать в фетальной сыворотке теленка, используемой в качестве ростовой добавки для культивированных клеток. Это приводит к вероятности того, что экспонированные эпитопы Man-6-P на секретированной α -Gal А могут быть субстратом для щелочной фосфатазы сыворотки. Было также показано, что бромтетрамизол является сильным ингибитором щелочной фосфатазы, Ki=2,8 мМ (Metaye et al., Biochem. Pharmacol. 15:4263-4268 (1988)), и полное ингибирование достигается при концентрации 0,1 мМ (Borgers & Thone, Histochemistry 44:277-280 (1975)). Следовательно, в одном из вариантов осуществления изобретения ингибитор фосфатазы, например бромтетрамизол, может быть добавлен к культивированным клеткам для максимизации содержания форм α -Gal А с высоким поглощением, присутствующих в культуральной среде, благодаря предупреждению гидролиза сложноэфирных групп Man-6-P.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к препаратам α -Gal А и к способам получения таких препаратов, которые имеют увеличенное время полужизни в кровотоке млекопитающего-хозяина. Время полужизни в кровотоке и клеточное поглощение увеличивают путем (i) повышения содержания сиаловой кислоты в α -Gal А (достигаемого, как описано выше); (ii) повышения уровня фосфорилирования α -Gal А (достигаемого, как описано выше); (iii) ПЭГилирования α -Gal А или (iv) последующего удаления сиаловой кислоты и концевых остатков галактозы, или удаления концевых остатков галактозы на олигосахаридных цепях α -Gal А.

Повышение уровня сиалилирования препаратов α -Gal А приводит к увеличению времени полужизни экзогенной α -Gal А в кровотоке. Кроме того, по сравнению с поглощением в гепатоцитах, повышенный уровень сиалилирования α -Gal А приводит к повышению уровня его поглощения в не-гепатоцитах, таких как эндотелиальные клетки печени, синусоидальные клетки печени, клетки легких, клетки почек, нервные клетки, эндотелиальные клетки или клетки сердца. Препарат человеческой гликозилированной α -Gal A с повышенным содержанием сиаловой кислоты предпочтительно включает множество гликоформ, где, по крайней мере, 20% сложных гликанов имеют 2-4 остатка сиаловой кислоты. Альтернативный предпочтительный препарат человеческой гликозилированной α -Gal А имеет множество гликоформ, где 50-75%, а предпочтительно, по крайней мере, 60% от всех гликанов являются сиалилированными.

Фосфорилирование препаратов α -Gal А также увеличивает уровень вхождения α -Gal А в клетки. Фосфорилирование происходит в клетках, экспрессирующих данную α -Gal А. Один предпочтительный препарат человеческой гликозилированной α -Gal А настоящего изобретения предпочтительно включает множество гликоформ, где, в среднем, по крайней мере, 16-50%, предпочтительно 25-50%, а более предпочтительно, по крайней мере, 30% данных гликоформ являются фосфорилированными.

В альтернативном варианте осуществления изобретения время полужизни в кровотоке препарата человеческой α -Gal А увеличивают путем образования комплекса α -Gal А с полиэтиленгликолем. В предпочтительном варианте осуществления изобретения данный препарат α -Gal А подвергают реакции образования комплекса с использованием трезилмонометокси-ПЭГ (TMPEG) с получением ПЭГилированной α -Gal А. Затем комплекс ПЭГ-α -Gal А очищают и выделяют препарат ПЭГ-α -Gal А. ПЭГилирование α -Gal A увеличивает время полужизни в кровотоке и повышает in vivo-эффективность данного белка.

Сиалилирование влияет на время полужизни в кровотоке и биологическое распределение белков. Белки с минимальным количеством сиаловой кислоты или без сиаловой кислоты легко интернализуются посредством рецептора асиалогликопротеина (рецептора Эшвелла) на гепатоцитах благодаря экспонированным галактозным остаткам на белке. Время полужизни в кровотоке α -Gal А с галактозным концом может быть увеличено путем проведения последовательных стадий (1) удаления сиаловой кислоты посредством контактирования α -Gal А с нейраминидазой (сиалидазой), в результате чего концевые галактозные группы становятся экпонируемыми, и (2) удаления концевых галактозидных остатков посредством контактирования десиалилированной α -Gal А с β -галактозидазой. Полученный препарат α -Gal А имеет меньшее число концевых остатков сиаловой кислоты и/или концевых галактозидных остатков на олигосахаридных цепях по сравнению с препаратами α -Gal А, которые не были последовательно подвергнуты контактированию с нейраминидазой и β -галактозидазой. Альтернативно, время полужизни в кровотоке β -Gal А с галактозным концом может быть увеличено лишь путем удаления концевых галактозидных остатков посредством контактирования десиалилированной α -Gal А с β -галактозидазой. Полученный α -Gal А-препарат имеет меньшее число концевых галактозидных остатков на олигосахаридных цепях по сравнению с α -Gal А-препаратами, которые не были подвергнуты контактированию с β -галактозидазой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, после контактирования нейраминидазы и β -галактозидазы, полученные α -Gal А - препараты затем подвергают контактированию с β -гексозаминидазой, что приводит к отщеплению олигосахарида с получением триманнозной сердцевины.

Кроме того, уровни сиалилирования могут зависеть от типа используемой клетки. Поэтому, в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, уровень сиалилирования α -Gal A может быть увеличен благодаря скринингу на клетки млекопитающих, например клетки человека, которые имеют относительно высокий уровень сиалилтрансферазной активности, и благодаря использованию таких клеток в качестве α -Gal А-продуцирующих клеток.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям α -Gal А-препаратов, которые, в основном, не содержат белков α -Gal А, таких как альбумин; белков, не относящихся к α -Gal А и продуцируемых клетками-хозяевами, или белков, выделенных из тканей или физиологических жидкостей животного. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения данная композиция, кроме того, содержит наполнитель. Предпочтительными наполнителями являются маннит, сорбит, глицерин, аминокислоты, липиды, EDTA, EGTA, хлорид натрия, полиэтиленгликоль, поливинилпироллидон, декстран или комбинации любых из указанных наполнителей. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, кроме того, содержит неионный детергент. Предпочтительными неионогенными детергентами являются полисорбат 20, полисорбат 80, тритон Х-100, тритон Х-114, нонидет Р-40, октил-а-глюкозид, октил-b-глюкозид, Brij 35, плюроник и твин 20. В предпочтительном варианте осуществления изобретения неионогенный детергент включает полисорбат 20 или полисорбат 80. Предпочтительная композиция, кроме того, содержит забуференный фосфатом физиологический раствор, предпочтительно, при рН 6.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам введения препарата α -Gal А индивидууму. В предпочтительном варианте осуществления изобретения препаратом α -Gal А является препарат α -Gal А с измененным зарядом, например с повышенным зарядом олигосахарида и/или с более продолжительным временем полужизни, как описано в настоящей заявке. Доза введения предпочтительно составляет 0,05-5,0 мг, а более предпочтительно 0,1-0,3 мг препарата α -Gal А на килограмм массы тела, и вводится один раз в неделю или один раз в две недели. В предпочтительном варианте осуществления изобретения доза введения составляет приблизительно 0,2 мг на килограмм массы тела и вводится раз в две недели. В указанных способах эта доза может быть введена внутримышечно, перорально, ректально, подкожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, интрацеребрально, интраназально, внутрикожно, внутриоболочечно, через слизистую, чрескожно или путем ингаляции. В одном из вариантов осуществления изобретения способ доставки препарата α -Gal А индивидууму предусматривает подкожное введение дозы, составляющей от 0,01 до 10,0 мг, а предпочтительно 0,1-5,0 мг препарата α -Gal А на килограмм массы тела, один раз в неделю или один раз в две недели. Данный препарат α -Gal А может быть также введен внутривенно, например путем внутривенной инъекции болюса, внутривенной инъекции посредством медленной интубации или путем непрерывной внутривенной инфузии. В любом из вышеуказанных способов доставка препарата α -Gal А может быть осуществлена с использованием такой системы доставки, как насос, инкапсулированная клетка, липосомы, инъекции с использованием игл, безыгольное впрыскивание, ингалятор, аэрозольный распылитель, электропорация и пластырь для чрескожной доставки. Указанными способами может быть введен любой из вышеописанных препаратов α -Gal А.

Индивидуум с подозрением на болезнь Фабри или с уже установленным диагнозом болезни Фабри может быть подвергнут лечению путем введения вышеописанного препарата α -Gal А с использованием вышеописанных способов введения и доз. В настоящем изобретении рассматривается лечение индивидуумов, в основном, с болезнью Фабри, а также с атипическими вариантами болезни Фабри, например конкретных групп пациентов, страдающих болезнью Фабри с преобладающими сердечно-сосудистыми нарушениями, такими как увеличение желудочков, например гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ), и/или недостаточность митрального клапана, или групп пациентов, страдающих болезнью Фабри с преобладающими почечными нарушениями.

α -Gal A

α -Gal А представляет собой гомодимерный гликопротеин, который отщепляет концевые α -галактозильные группы от гликолипидов и гликопротеинов.

Термины зрелая "α -Gal A", "GA-GAL" и "SEQ ID NO:5" (см.фиг.7) относятся к α -Gal А без сигнального пептида (для α -Gal А с сигнальным пептидом см. фиг.3 и SEQ ID NO:3). Определенный здесь термин "препарат α -Gal А" и термин "препарат гликозилированной α -Gal А" являются взаимозаменяемыми и включают различные гликоформы гликолизированной α -Gal А.

Термин "сигнальный пептид" означает пептидную последовательность, которая направляет новосинтезированный полипептид, к которому присоединен данный сигнальный пептид, в эндоплазматический ретикулум (ЭР) для последующего посттрансляционного процессинга и распределения.

Термин "гетерологичный сигнальный пептид", используемый здесь в связи с α -Gal А, означает сигнальный пептид, который не является сигнальным пептидом α -Gal А человека, а обычно представляет собой сигнальный пептид белка некоторых млекопитающих, не являющегося α -Gal А.

Специалистам известно, что ДНК-последовательность (либо кДНК [SEQ ID NO:5], либо геномная ДНК) человеческой α -Gal A или последовательности, которые отличаются от ДНК α -Gal А либо заменами молчащего кодона, либо заменами кодона, приводящими к заменам консервативных аминокислот, могут быть использованы для генетической модификации культивированных клеток человека так, чтобы они сверхпродуцировали и секретировали указанный фермент. Некоторые мутации в ДНК-последовательности α -Gal A могут кодировать полипептиды, которые сохраняют ту же ферментативную активность или обладают улучшенной ферментативной активностью α -Gal А. Так, например, ожидается, что замены консервативных аминокислот будут иметь незначительное влияние или вообще не будут оказывать влияния на биологическую активность, а особенно, если они представляют менее чем 10% от общего числа остатков в данном белке. Консервативными заменами обычно являются замены внутри следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; фенилаланин, тирозин. См., например, патент США 5356804, который вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Болезнь Фабри

Болезнь Фабри представляет собой наследственное заболевание, вызываемое дефицитом активности фермента α -Gal А. Термин "дефицит α -Gal А" означает любой дефицит количества или активности этого фермента у пациента, приводящий к аномальной аккумуляции нейтральных гликолипидов (например, глоботриаозилцерамида) в гистиоцитах в стенках кровеносных сосудов с образованием ангиокератом в области бедер, ягодиц и гениталий, к гипогидрозу, парестезии в конечностях, извитости роговицы и к спицеобразной задней субкапсулярной катаракте. Отложение этого материала может приводить к болям, тяжелому почечному и сердечно-сосудистому заболеванию и к инсульту. Аккумуляция гликолипида может приводить к тяжелым симптомам, обычно наблюдаемым у мужчин, страдающих болезнью Фабри. Альтернативно, такая аккумуляция может индуцировать относительно умеренные симптомы, которые могут иногда наблюдаться у женщин - гетерозиготных носителей дефектного гена. Страдающие этим заболеванием индивидуумы имеют прогнозируемую короткую продолжительность жизни; смерть обычно наступает в результате осложнений на почки, сердце или сердечно-сосудистую систему в возрасте приблизительно 40 лет. Какого-либо конкретного способа лечения этой болезни не существует. Болезнь Фабри классифицируется как расстройство, связанное с накоплением лизосом, которым страдают более чем 15000 человек во всем мире.

Болезнь Фабри, описанная выше, представляет собой сложный клинический синдром, характеризующийся вовлечением в патологический процесс множества органов и систем. Пациентов, у которых наблюдается комбинация признаков дистрофии роговицы, поражений кожи (ангиокератомы), болезненной невропатии, сердечно-сосудистого заболевания, кардиомиопатии и почечной дисфункции, относят к категории, рассматриваемой как "классический" фенотип. Однако имеются пациенты, у которых проявляются некоторые, но не все аспекты указанного классического фенотипа. Эти пациенты классифицируются как пациенты с "атипическими вариантами болезни Фабри". Существует несколько фенотипов атипического варианта, ассоциированных с дефицитом α -галактозидазы А. Так, например, некоторые пациенты с дефицитом α -галактозидазы А страдают вариантом болезни Фабри, сопровождающимся лишь поражением сердца, например гипертрофией левого желудочка (ГЛЖ).

Имеется также другой фенотипический вариант, при котором пациенты страдают лишь поражением почек. Хотя оба этих фенотипических варианта были определены в мужских гемизиготах, однако, вариантные формы болезни Фабри были также описаны в женских гетерозиготах.

У пациентов, страдающих атипическим вариантом с поражением сердца, симптомы этой болезни проявляются в более позднем возрасте. Средний возраст диагностики этой болезни у пациентов с фенотипическим вариантом, проявляющимся поражением сердца, составляет приблизительно 52 года, тогда как для классического фенотипа, этот возраст составляет приблизительно 29 лет (Desnick et al., In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 6th edition (1996), Scriver et al. (eds), McGraw-Hill (New York), pp. 2741-2784; Meikle et al., J.Am.Med. Assoc. 281:249-254 (1999)). Среди пациентов с этим синдромом часто встречаются пациенты со слабыми симптомами нарушения сердечной функции, такими как одышка при физической нагрузке. Обычно стандартный эхокардиографический анализ показывает, что у пациентов с сердечным фенотипическим вариантом наблюдается гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ) или асимметрическая гипертрофия перегородки. Однако могут также встречаться пациенты с инфарктом миокарда или кардиомиопатией (Scheidt et al., New Engl. J.Med. 324:395-399 (1991); Nakao et al., New Engl. J.Med. 333:288-293 (1995)). Этих пациентов в большинстве случаев подвергают миокардиальной биопсии, которая показывает, что патология с такой разновидностью синдрома, в основном, аналогична классической болезни Фабри, т.е. миокардиальной инфильтрации в результате отложения гликолипида. Ферментные анализы α -галактозидазы А у этих пациентов выявили наличие широкого диапазона уровней фермента. Так, например, сообщалось, что пациенты с "сердечным" вариантом имеют ферментативную активность, составляющую до 30% от нормальных уровней активности фермента α -галактозидазы А, и, таким образом, до настоящего времени эти пациенты рассматривались как кандидаты на заместительную терапию α -Gal A.

Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что, хотя пациенты с атипическим сердечным вариантом или атипическим почечным вариантом могут иметь уровни активности фермента α -галактозидазы А, которые являются относительно высокими по сравнению с уровнями у пациентов с классическим фенотипом болезни Фабри, однако, у этих пациентов может также наблюдаться благоприятный исход в результате проведения терапии с использованием фермента α -галактозидазы А. Так, например, пациенты могут иметь мутацию, продуцирующую кинетически нестабильный фермент α -Gal А в клетке, и у этих пациентов уровни фермента α -Gal А могут быть значительно увеличены путем введения препаратов α -Gal А настоящего изобретения. Кроме того, сообщалось, что у некоторых пациентов, страдающих атипичным фенотипическим сердечным вариантом, имеется точковая мутация в аминокислоте 215 α -галактозидазы А. Эта аминокислота в немутированном белке представляет собой аспарагин, который является гликозилированным (Eng et al., Am. J. Hum. Genet. 53:1186-1197 (1993)). Таким образом, заместительная терапия ферментом α -Gal А с использованием препаратов на основе соответствующим образом гликозилированной α -галактозидазы А настоящего изобретения может оказаться эффективной для этих пациентов. Более того, сообщалось, что у пациентов с атипическим почечным вариантом, у которых наблюдалось лишь клиническое проявление болезни Фабри, имеется слабая протеинурия. Однако биопсия почек выявила типичные для болезни Фабри гликолипидные вклю