Биологически активный карнозин-анзеринсодержащий комплекс и способ его получения

Биологически активный карнозин-анзеринсодержащий комплекс и способ его получения

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и касается производства биологически активных средств, включающих гистидинсодержащие дипептиды, обладающих антиоксидантной, иммуномодулирующей активностью, получаемых на основе природного сырья - мышечной ткани курицы, которое может быть применено в медицинской, пищевой промышленностях, в косметике, ветеринарии, животноводстве.

Известно, что антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью обладают как природные, так и синтетические продукты различного строения и состава. К таким продуктам относятся, например, гистидинсодержащие дипептиды, аминокислоты. Большое внимание в последние годы уделялось исследованию гистидинсодержащих дипептидов с антиоксидантной активностью, а именно карнозина, имеющего структуру Ala-His и его производным, таким как анзерин структуры Ala-N-MeHis. Карнозин впервые был выделен и исследован уже в 1900 году (А.А.Болдырев. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. М., 1998). В настоящее время природный дипептид-карнозин, содержащийся в скелетных мышцах человека и позвоночных животных, охарактеризован как эффективный водорастворимый антиоксидант, иммуномодулятор и рН-буфер, применяемый как противоопухолевое, антигистаминное, антистрессорное, противоязвенное, антикатарактное средство, обладающее также ранозаживляющим и антинеопластическим действием (РФ, патент №2084457, С 07 К 5/062, 1997). Карнозин природный впервые был выделен из водной суспензии мясного фарша высаживанием этиловым спиртом (Gulewitsh WS Amiradzibi S Uber das Carnosin eine neue organische Base des Fleischxtraktes Ber Deutsch Chem Ges 1900, 33, 1902-1903). В клинической практике в настоящее время применяется как природный, так и синтетический карнозин, а также его гомологи, в частности анзерин. Синтетический карнозин в настоящее время выпускается зарубежными фирмами, например, такими как SERUA, SIGMA (Италия). Однако, как это известно из дополнительных экспериментальных исследований, а также из имеющихся информационных источников, синтетические гистидинсодержащие дипептиды и их смеси из-за наличия побочно образующихся при синтезе продуктов обладают достаточно высокой токсичностью, что ограничивает возможность их применения (РФ, патент №2084457, С 07 К 5/062, 1997). В 1996 году в России был освоен промышленный выпуск природного карнозина экстрагированием из говяжьего мяса. Продукт, полученный данным методом, был внесен в Регистр лекарственных средств России за №96/50/02. Природный карнозин признан малотоксичным по сравнению с его синтетическими аналогами. Его LD 50 составляла 21 г/кг массы тела. Однако сам карнозин в отсутствии активирующих добавок обладает сравнительно невысокой антиоксидантной активностью, что ограничивает его применение в качестве терапевтического препарата, и что привело к поиску более активных форм данного препарата, например, к подбору составов смесей, включающих карнозин. Так, известен состав, применяемый в качестве фармацевтического или диетического препарата, содержащий карнозин и/или его производные, такие как гомокарнозин, анзерин, офидин и/или их фармакологически приемлемые соли и/или их ацильные производные в смеси с аминокислотами разветвленной структуры, выбранными из группы: лейцин, изолейцин, валин, а также дополнительно содержащий соли органических и неорганических кислот, например карбонаты, лактаты, сульфаты, глюконаты магния, цинка, железа, и другие добавки, такие как витамины, флавоноиды (ЕР, патент №0825871, А 61 К 38/05, 2001). В известном составе карнозин и его гомологи составляют 1-0.5 мас.%, предпочтительно 15-25 мас.% к общему весу всей смеси, а смесь трех аминокислот составляет 50-70 мас.%, причем лейцин содержится в смеси на уровне 20 мас.%. Данная композиция применяется как оральный препарат в виде таблеток, капсул, жидких растворов. Композицию получают смешением входящих в нее компонентов, их термообработкой и последующим выделением. В качестве исходных дипептидов в данном составе применяются синтетические продукты. Антиоксидантная эффективность данного препарата проверялась на подопытных животных по изменению липопероксидов в плазме крови, печени и было установлено, что карнозин в комплексе с разветвленными аминокислотами снижает содержание пероксидов на 35,5%. Дозировки данного известного препарата зависят от характера и степени заболевания и составляют 0,1-500 мг/кг веса тела. Данная композиция близка по своему составу и области применения новому средству и поэтому выбрана в качестве его прототипа. Недостатком известной композиции прототипа является ее недостаточная эффективность, что ограничивает ее область применения.

В известных публикациях отсутствуют сведения, касающиеся получения из природного сырья композиций, содержащих как аминокислотный комплекс, так и гистидинсодержащие дипептиды. Применение же природного белкового сырья широко описано для получения биологически активных аминокислотных комплексов методом ферментативного гидролиза. В качестве исходного сырья для получения известных ферментативных белковых гидролизатов применяются, например, спилки шкур млекопитающих (РФ, патент №2068879, С 12 N 1/00, 1992), внутренние органы птицы, подвергаемые гидролизу под действием эндогенных ферментов кишечника птицы в щелочной среде (СССР, а.с. №878780, С 12 N 1/20, 1979), мясное или мясокостное сырье убойных животных, измельченное и подвергнутое ферментативному гидролизу при рН 6,5-7,8 с применением протосубтилина Г20Х и протеолитических ферментов, полученных из поджелудочной железы убойных животных (РФ, патент №2112397, А 23 J 1/10, 1998), мышечная ткань крупного рогатого скота или свиней (СССР, а.с. №1025722, С 12 N 1/00, 1983). В последнем цитированном источнике тщательно измельченную мышечную ткань крупного рогатого скота или свиней подвергают ферментативному гидролизу в присутствии протеолитических ферментов, в качестве которых используют поджелудочную железу крупного рогатого скота или свиней либо панкреатин с активностью 45 ЕД. По завершению гидролиза при его глубине, составляющей 0,9-1,0, проводится осаждение высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке и последующая фильтрация и высушивание препарата. Получаемый известный сухой ферментативный гидролизат содержит не менее 18 аминокислот, суммарное количество которых составляет 63-69%. Однако данный комплекс не содержит карнозина с анзерином, что является основной целью нового изобретения. Ферментативный сухой гидролизат белков мышц крупного рогатого скота или свиней был применен для создания питательной среды для выращивания культур клеток и биопрепаратов. Однако из-за того, что крупный рогатый скот подвержен опасному заболеванию, так называемому коровьему бешенству, способному при определенных условиях передаться и человеку, в последнее время ограничивается использование мяса крупного рогатого скота и свиней для фармацевтической и пищевой промышленностей.

Как говорилось выше, карнозин и его гомологи применяются в составе антиоксидантных композиций, в частности в косметических кремах, обладающих лечебным эффектом. Например, известны: композиция карнозина с арнитином и другими эффективными добавками, применяемыми при лечении и профилактике фотодерматозов (РСТ, патент №1175898, А 61 К 7/48, 2002), косметическая композиция в форме крема, обладающая противовоспалительным действием и применяемая для кожи, склонной к угревой сыпи. Количество карнозина в таком креме составляет 0,0009-0,0011 мас.% (РФ, патент №2045949, А 61 К 7/48, 1995).

Для расширения ассортимента биологически активных препаратов, обладающих повышенной эффективностью и малой токсичностью, ферментативным способом из мышечной ткани курицы получен новый состав биологически активного комплекса, содержащего карнозин и анзерин в смеси с другими биологически активными веществами в следующих весовых частях по отношению к содержанию карнозина с анзерином: аминокислоты - 1-7 вес. частей, олигопептиды в количестве, составляющем 0,5-12 вес. частей, и циклические и полициклические фенольные соединения в количестве 0,1-15 вес. частей. Биологически активный комплекс выполняется в форме экстракта или твердого порошка.

Данный биологически активный карнозин-анзеринсодержащий комплекс получается ферментативным гидролизом мышечной ткани курицы, которую после измельчения и гомогенизации в воде подвергают обработке протеолитическими ферментами при рН 4,5-5,5 или 8,0-9,0 при температуре 45-65°С с использованием 2-5 мас.% фермента по отношению к содержанию белка в гомогенате и последующему охлаждению и фильтрационной очистке. При этом гомогенизированное исходное сырье разбавляют водой, предпочтительно, в диапазоне соотношения 0,2-0,6. Перед стадией ферментативного гидролиза разбавленный водой гомогенат предварительно нагревается при 45-65°С. При получении продукта в виде порошка выделенный очищенный экстракт дополнительно подвергают вакуумному упариванию и/или распылительной или лиофильной сушке.

Лечебно-косметическая композиция, содержащая указанный биологически активный комплекс и косметически приемлемую основу, содержит комплекс “Био Куратор” в эффективном количестве, зависящем от выбранной косметической формы (крема, эмульсии, лосьона и т.д. (и от других факторов) назначения, возраста клиента и т.д.)

Получаемый биологически активный комплекс содержит смесь аминокислот, таких как аспарагин, триптофан, серин, глутамин, пролин, глицин, аланин, цистеин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гидроксилизин, лизин, гистидин, аргинин. Новое средство, в отличие от известного состава-прототипа, содержит всегда смесь двух гистидинсодержащих дипептидов (карнозина и анзерина), а также более широкий спектр аминокислот, что самое главное, дополнительно содержит олигопептиды, а также циклические и полициклические фенольные соединения неопределенной структуры, обеспечивающие значительный синергетический эффект, проявляющийся в повышенной эффективности нового комплекса, значительно превышающей известные препараты аналогичного действия и состава. Данные свойства у нового биологически активного комплекса создаются при определенной последовательности операций и соблюдении определенных режимов в процессе его получения. Для исследования антиоксидантного эффекта полученного комплекса был применен метод хемилюминесцентного анализа перекисного окисления липопротеидов донорской крови, индуцированного железом. Суть метода состоит в том, что при добавлении к образцам липопротеидов ионов двухвалентного железа происходит индукция активных форм кислорода, вызывающих цепную реакцию процесса образования свободных радикалов, сопровождающуюся возгоранием хемилюминесценции. Результаты тестирования антиоксидантной активности нового биологически активного комплекса в зависимости от концентрации в пробе биологически активных веществ приведены в таблице 3. Конечный объем пробы в исследованиях составил 1,0 мл. В таблице 3 приведены также результаты тестирования, в которых в качестве образца для сравнения участвовал синтетический карнозин. Полученные результаты указывают на высокую эффективность действия нового комплекса. Уже при добавлении пробы биологически активного комплекса в количестве, равном 10 мкл, отмечено достоверное увеличение продолжительности латентного периода и снижение интенсивности основной вспышки хемилюминесценции /Н/. Для сравнения действующие концентрации для карнозина и анзерина при их индивидуальном использовании в этой модели составляют 500 мМ и выше (Болдырев А.А. - Карнозин и защита тканей от окислительного стресса. Москва, 1999). Таким образом, получаемый новым способом препарат указанного состава благодаря своей эффективности может быть применен в фармацевтической, косметической промышленностях как отдельный препарат либо ингредиент композиций, например, лечебно-косметических композиций, обладающих антиоксидантной, УФ-отражающей активностью.

Ниже приводятся примеры, иллюстрирующие новый препарат, и способ его получения и лечебно-косметические составы на его основе.

Пример 1.

Мышечную ткань кур в количестве 1 кг измельчают на мясорубке и гомогенизируют. Полученную смесь-гомогенат разводят 3 литрами очищенной воды при разбавлении в диапазоне 0,3 и проводят водную экстракцию при 45°С. После этого отделяют водный экстракт от осадка методом фильтрации, а белковые соединения в полученном экстракте подвергают ферментативному гидролизу при рН 5,5 с помощью протеолитического фермента Flavourzime, используемого в количестве 4 мас.% и при температуре 50°С до момента прекращения нарастания величины аминного азота. После этого экстракт нагревают для инактивации фермента при 75°С в течение 30 минут, далее проводят охлаждение и удаление сформировавшегося осадка, а насадочную жидкость фильтруют с помощью глубинных фильтров. Получают продукт с показателями, отраженными в таблицах 1-3.

Пример 2.

Пример 2 проводят аналогично примеру 1 при использовании филе куриных грудок, при этом процесс водной экстракции проводят с применением 4 литров воды, а ферментативную обработку проводят при температуре 55°С и рН 8,5 с применением того же протеолитического фермента в количестве, составляющем 5 мас.% от содержания белка в экстракте. Получаемый продукт охарактеризован в таблицах 1-3.

Пример 3

Процесс экстракции и гидролиза проводят аналогично примеру 1. В конце экстракции конечный продукт концентрируют до конечной концентрации не менее 10 мас.% и сушат распылительной сушкой при 100°С.

Пример 4.

Мышечную ткань в количестве 1 кг измельчают и гомогенизируют, после чего полученный гомогенат смешивают с очищенной водой в количестве 4 литров и помещают в реактор. Используют комплексный амилопротеолитический фермент Протеаза “С” при рН 8.0 при температуре 50-55°С в количестве 4 мас.% от содержания белков в гомогенате. Гидролиз ведут до момента прекращения нарастания величины аминного азота. Полученный продукт охарактеризован в таблицах 1-3.

Примеры 5, 6. Лечебно-косметические средства на основе препарата “Био Куратор” (выше рассмотренного биологически активного комплекса).

В косметически приемлемую основу, содержащую перечисленные ниже компоненты, вводят эффективное количество водного экстракта препарата “Био Куратор”, перемешивают компоненты до получения гомогенной массы и фасуют. Ниже приводятся примеры составов на основе препарата “Био Куратор”. Однако приведенные примеры никак не ограничивают возможности создания других лечебно-косметических средств на основе этого препарата.

Пример 5. Солнцезащитный крем состава (мас.%):

Цетарет 25-2.0, Цетарет 6 - 2.0, цетиариловый спирт - 3.0, этилгексилметоксициномат - 5.0, бензофенон 3-1.0, бутилметоксидибензоилметан - 1,0, цетиарилизононаноат - 6.0, кокоглицериды - 2.0, глицерин - 5.0, карбомер - 0.3, триэтаноламин - 0.4, токоферолацетат - 0.5, глюкан - 0.5, циклометикон - 1.5, диметикон - 0.5, метилпарабен - 0.3, пропилпарабен - 0.2, “БиоКуратор - 0.5 (в виде 7%-ного водного раствора), вода - остальное до 100%.

Пример 6. Противовоспалительный бальзам состава, (мас.%):

Фитостеарин - 1.0, липидный комплекс - 2.0, пропилпарабен - 0.2. метилпарабен - 0.3, глицерин - 5.0, аллантоин - 0.2, карбомер - 0.4, триэтаноламин - 0.5, “Био Куратор” - 1.0 /в виде 5-%-ного водного раствора, Д-пантенол - 0.3, бисаболол - 0.3.

Ниже приводятся таблицы, отражающие эффективность биологически активного комплекса.

Таблица 1.Содержание карнозина и анзерина в биологически активном комплексе в зависимости от способа его получения.
Наименование показателя	Примеры 1-2	Пример 4
Карнозин, мг/мл	1.5-4.5	1.6-6.5
Анзерин, мг/мл	2.5-10	2.5-13.5

Таблица 2.Физико-химические показатели биологически активного комплекса в зависимости от способа его получения.
Наименование показателя	Примеры 1-2	Пример 4
Содержание сухих веществ в неупаренном экстракте, % мас., не менее	4	7
Массовая доля общего азота, % мас., не менее	2.6	4.7
Аминный азот, мг/мл, не менее	1.6	3.5

Таблица 3.Исследование антиоксидантной активности биологически активного комплекса для различных примеров.
Вариант	Объем, мкл/пробу	Анзерин, мкг/пробу	Карнозин, мкг/пробу	Гидроперекиси (h), % от контроля	Латентный период (τ), % от контроля	Окисляемость (H), % от контроля
Пример 1-2	10	3.2	2.5	60	125	96
Состав пробы: Карнозин: 2.45 мг/мл	25	8	6.25	54	175	85
Анзерин: 3,19 мг/мл	50	16	12.5	50	300	87
Сухие вещества: 45.8 мг/мл Для анализа проба была разведена в 10 раз	100	32	25.0	33	325	65
Пример 4	10	11	6.2	70	123	98
Состав пробы: Карнозин: 6.2 мг/мл	25	30	15.5	63.5	143	95
Анзерин: 11 мг/мл	50	55	33.75	50	154	91
Сухие вещества: 65.8 мг/мл Для анализа проба была разведена в 10 раз	100	110	62.00	49	183	55
Без экстракта	Контроль	105±12, mV	90±8, сек	1524±85, mV
Карнозин	1 mM		226	40	160	90
0.5 mM		113	52	144	94
0.25 mM		56.5	57	125	95
0.1 mM		11.3	36	96	100

Таблица 4Состав препаратов “БИОКУРАТОР” промышленные образцы
Образец	Сухое в-во (%)70 мг/мл	Дипептиды (мг/мл) (по данным ВЭЖХ)	Баланс аминокислот (мг/мл) (по данным, полученным на анализаторе аминокислот)	Эффективность аппаратного гидролиза бульона(%)
Анзерин	Карнозин	Сумма	Свободные I	После полного гидролиза II
№1	7,2	1,452	0,807	2,259	10,29	36,80	28
№2	7,4	1,780	0,820	2,6	15,07	46,90	31
№3	7,2	1,845	0,735	2,58	28,57	47,04	44

По данным аминокислотного анализа можно сделать заключение, что процесс аппаратного гидролиза проходит не до конца: в 1-ом и 2-ом образцах глубина гидролиза составила 28 и 31%, соответственно, в 3-ем - 44%. Выход дипептидов во 2-ом и 3-ем образцах практически одинаковый.

Таблица-5Антиоксидантная активность препаратов “БИОКУРАТОР”
Образец	Дипептиды, концентрация в образцах (mМ)	Антиоксидантная активность
Конц-ия в тест-пробе (мМ)	Восстановление ДФПГ (нмоль/мин)	Конц-ия в тест-пробе (мМ)	Подавление накопления МДА (%)
Анзерин	Карнозин	Сумма
№1	6,02	3,57	9,59	0,19	1,76	0,96	16,4±0,48
№2	7,38	3,63	11,01	0,22	1,71	1,1	26,8±0,88
№3	7,65	3,25,	10,9	0,22	3,19	1,09	33,6±1,16
Карнозин	20 мМ			0,40	0,26	1,0	0%
			0,8	0,39	2,0	16,5±0,55

Антиоксидантную (АО) активность препаратов БИОКУРАТОРА определяли в двух тестах:

- По скорости восстановления стабильного радикала - дифенилпикрилгидразила [Schlesier К., Harwat М., Вöhm V, Bitsch R. Assessment of antioxidant activity by using different in vitro methods // Free Radic. Res., 36, pp.177-187, (2002)]

- По подавлению накопления МДА в реакции индуцированного железом перекисного окисления липопротеинов в сыворотке крови доноров [Ohkawa H., Ohishi N., Yagi К. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction.//Anal Biochem, 95(10), 351-358 (1979)]

Полученные результаты указывают на то, что по сравнению с карнозином препараты БИОКУРАТОРА обеспечивают большую АО активность, чем можно было бы ожидать, исходя из суммарного содержания в них гистидинсодержащих дипептидов (ГСД). При внесении в реакционную систему в тесте восстановления ДФПГ аликвот препаратов БИОКУРАТОР, обеспечивающих действующую концентрацию ГСД 0,19-0,22 мМ. АО активность в 20-40 раз превышает наблюдавшуюся для карнозина. Учитывая тот факт, что использованный тест выявляет антиоксидантную активность соединений, обладающих определенными гидрофобными свойствами, можно предположить, что АО активность препарата БИОКУРАТОР в значительной степени зависит от присутствия в их составе других (не ГСД) антиоксидантов. На это указывают и данные, полученные в тесте по подавлению накопления МДА: в этом тесте препараты БИОКУРАТОРА в 2-4 раза превосходят по своей АО активности карнозин.

1. Биологически активный карнозин-анзеринсодержащий комплекс, включающий аминокислоты, отличающийся тем, что дополнительно содержит олигопептиды и циклические и полициклические фенольные соединения и представляет собой комплекс биологически активных веществ природного происхождения, полученный ферментативным гидролизом мышечной ткани курицы, характеризуемый следующим весовым соотношением компонентов смеси, вес. ч.:

Карнозин и анзерин 1

Аминокислоты 1-7

Олигопептиды 0,5-12

Циклические и полициклические

фенольные соединения 0,1-1

2. Биологически активный комплекс по п.1, отличающийся тем, что выполнен в форме водного экстракта либо твердого порошкообразного продукта.

3. Биологически активный комплекс по пп.1 и 2, отличающийся тем, что является составной частью наружно-косметических лечебных средств.

4. Способ получения биологически активного карнозин-анзеринсодержащего комплекса, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют измельченную гомогенизированную мышечную ткань курицы, которую подвергают ферментативному гидролизу с последующим охлаждением и фильтрационной очисткой выделяемого конечного продукта, причем после измельчения и гомогенизации гомогенат разбавляют водой и подвергают обработке протеолитическими ферментами, работающими при рН 4,5-5,5 или 8,0-9,0 и температуре 45-65°С и используемыми в количестве, составляющем 2-5 мас.% от содержания белка в гомогенате.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что измельченное гомогенизированное исходное сырье разбавляют водой предпочтительно в диапазоне отношения, равном 0,2-0,6.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что перед стадией ферментативного гидролиза разбавленный водой гомогенат нагревают при 45-65°С и подвергают фильтрационной очистке.

7. Способ по любому из пп.4-6, отличающийся тем, что при получении продукта в виде порошка выделенный очищенный экстракт дополнительно подвергают вакуумному упариванию и/или распылительной или лиофильной сушке.