Композиции микрочастиц и способы их получения

Композиции микрочастиц и способы их получения

Реферат

Статус родственных заявок

Настоящее изобретение относится к серийной патентной заявке № 60/236077, поданной 28 сентября 2000 г. Указанная заявка полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям. В частности, изобретение относится к микрочастицам с адсорбирующими поверхностями, способам получения таких микрочастиц и к их использованию. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим биоразлагаемые микрочастицы, где на поверхности таких микрочастиц адсорбированы биологически активные вещества, такие как терапевтически полезные полинуклеотиды, полипептиды, антигены и адъюванты.

Предпосылки создания изобретения

Для достижения контролируемой парентеральной доставки терапевтических соединений используют носители в виде частиц. Такие носители разрабатывают с целью удержания активного вещества в системе доставки в течение длительного периода времени. Примеры носителей в виде частиц включают такие носители, которые получены из полиметилметакрилатных полимеров, а также на основе микрочастиц, полученных из поли(лактидов) (см., например, патент США № 3773919), поли(лактидкогликолидов), известных как ПЛГ (PLG) (см., например, патент США № 4767628) и из полиэтиленгликоля, известного как ПЭГ (см., например, патент США № 5648095). Полиметилметакрилатные полимеры относятся к недеградируемым веществам, тогда как частицы ПЛГ разлагаются при ненаправленном неэнзиматическом гидролизе сложноэфирных связей на молочную и гликолевую кислоты, которые выделяются обычными метаболическими путями.

Так, например, в патенте США № 5648095 описывается использование микросфер с инкапсулированными в их состав фармацевтическими агентами в качестве систем доставки лекарственных средств для назальной, пероральной, легочной и оральной доставки. Были также описаны композиции с медленным высвобождением, содержащие различные полипептидные факторы роста. См., например, международную публикацию № WO 94/12158, патент США № 5134122 и международную публикацию № WO 96/37216.

Fattal et al., Journal of Controlled Release 53:137-143 (1998) описывает наночастицы, полученные из полиалкилцианоакрилатов (ПАЦА), включающие адсорбированные олигонуклеотиды.

Носители в виде частиц с адсорбированными на них или захваченными в их состав антигенами также используются с целью достижения адекватных иммунных реакций. Такие носители презентируют иммунной системе множественные копии выбранного антигена и способствуют захвату и удерживанию антигенов в локальных лимфатических узлах. Частицы могут быть подвергнуты фагоцитозу за счет действия макрофагов, и они могут усилить презентирование антигена за счет высвобождения цитокина. Так, например, в одновременно рассматриваемой заявке совместного владения № 09/015652, поданной 29 января 1998 г., описывается использование микрочастиц с адсорбированным антигеном и инкапсулированным антигеном для стимуляции клетко-опосредованных иммунологических реакций, а также способы изготовления таких микрочастиц.

Так, например, в одновременно рассматриваемой серийной заявке совместного владения № 09/015652, поданной 29 января 1998 г., раскрывается способ образования микрочастиц, который включает объединение полимера с органическим растворителем, при последующих добавке стабилизатора эмульсии, такого как поверхностно-активное вещество поливиниловый спирт (ПВС), и выпаривании органического растворителя с образованием при этом микрочастиц. Поверхность микрочастиц включает полимер и стабилизатор. На указанных поверхностях могут быть также адсорбированы макромолекулы, такие как ДНК, полипептиды и антигены.

В патентах США №№ 5814482 и 6015686 раскрываются эукариотические слоистые векторные системы инициации (ELVIS векторы), в особенности те, которые получены и сконструированы на основе геномов альфа-вирусов (таких как Синдбис вирус), для использования в стимуляции иммунной реакции на антиген, в процессах ингибирования патогенных агентов и при доставке гетерологичных нуклеотидных последовательностей в эукариотические клетки и, в числе других, в клетки животных.

В международной патентной заявке совместного владения РСТ/US99/17308 и в совместно рассматриваемой серийной заявке на патент США № 09/715902 раскрываются способы получения микрочастиц, содержащих адсорбированные макромолекулы, такие как фармацевтический агент, полинуклеотид, полипептид, белок, гормон, фермент, медиатор транскрипции или трансляции, интермедиат метаболического пути, иммуномодулятор, антиген, адъювант или их сочетания и др. Микрочастицы включают, например, полимер, такой как поли(альфа-гидроксикислота) (например, ПЛГ), полигидроксимасляная кислота, поликапролактон, полиортоэфир, полиангидрид и др., которые получают с использованием, например, катионных, анионных или неионных детергентов.

Несмотря на то, что ПЛГ микрочастицы с адсорбированным антигеном обеспечивают значительные преимущества в сравнении с другими более токсичными системами, тем не менее адсорбция биологически активных агентов на поверхности микрочастиц может быть улучшена. Так, например, зачастую бывает трудно или невозможно осуществить адсорбцию заряженных или объемных биологически активных веществ, таких как полинуклеотиды, крупные полипептиды и др., на поверхности микрочастиц. Таким образом, существует постоянная потребность в гибких системах доставки для таких веществ и в особенности для лекарственных средств, которые характеризуются высокой чувствительностью и сложностями при составлении на их основе композиции.

Краткое описание сущности изобретения

Авторами настоящего изобретении было обнаружено, что адсорбция макромолекул на микрочастицах может быть улучшена за счет обеспечения доступности детергента в образовании комплекса с макромолекулами при адсорбции. Такая доступность может быть достигнута, например, посредством отдельного добавления некоторого количества детергента при адсорбции макромолекулы или за счет обеспечения того, что процесс образования микрочастиц приведет к получению продукта, содержащего существенное количество несвязанного детергента. Указанный подход противоречит методикам известного уровня техники, согласно которым микрочастицы тщательно промывают для удаления остаточных количеств детергента перед проведением адсорбции макромолекул. Так, в частности, в цитированном выше документе РСТ/US99/17308 приведены примеры, согласно которым микрочастицы промывают много раз водой (т.е. их промывают водой четыре раза с последующим центрифугированием) перед введением интересующей макромолекулы. Такие стадии промывки удаляют, по существу, весь несвязанный детергент, в результате чего в готовом продукте более 99% оставшегося детергента связано с частицами.

Таким образом, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предлагается композиция микрочастиц, которая содержит (1) микрочастицы, которые дополнительно включают полимер и первую часть детергента, которая связана с полимером, и (2) комплекс биологически активной макромолекулы со второй частью детергента, причем указанный комплекс адсорбирован на поверхности микрочастиц. Первая часть детергента и вторая часть детергента могут содержать один и тот же детергент или разные детергенты.

Предпочтительные биологически активные макромолекулы выбирают из группы, состоящей из полипептида, полинуклеотида, полинуклеозида, антигена, фармацевтического агента, гормона, фермента, медиатора транскрипции или трансляции, интермедиата метаболического пути, иммуномодулятора и адъюванта.

Предпочтительные полимеры представляют собой поли(α-гидроксикислоты), более предпочтительно, те из них, которые выбирают из группы, состоящей из поли(L-лактида), поли(D,L-лактида) и поли(D,L-лактидкогликолида). Более предпочтительными являются поли(D,L-лактидкогликолидные) полимеры. Предпочтительные поли(D,L-лактидкогликолидные) полимеры представляют собой такие полимеры, которые характеризуются молярным соотношением лактид/гликолид в диапазоне от 30:70 до 70:30, более предпочтительно, от 40:60 до 60:40 и имеют молекулярную массу, варьирующую от 10000 до 100000 дальтон, более предпочтительно, от 30000 дальтон до 70000 дальтон. Более предпочтительные биологически активные макромолекулы включают бактериальные и вирусные антигены (например, ВИЧ антигены, такие как gp120, gp140, p24gag и p55gag, антигены менингита В, антигены стрептококка В и антигены гемагглютинина гриппа А), а также полинуклеотиды, которые кодируют антигены. Биологически активные макромолекулы могут находиться, например, в виде плазмиды, ELVIS вектора или конструкции на основе РНК-вектора. Особенно предпочтительной биологически активной макромолекулой является pCMV-p55gag.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается композиция микрочастиц с дополнительной биологически активной макромолекулой, которая может находиться в связанном или несвязанном виде и может быть даже захвачена полимером. Так, например, может быть получена композиция микрочастиц с адъювантом, в частности, с Th1-стимулирующим адъювантом. Предпочтительные адъюванты включают CpG олигонуклеотиды, LTK63, LTR72, MPL и соли алюминия, включая фосфат алюминия.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первая часть детергента и вторая часть детергента содержат один и тот же детергент. Предпочтительными для данной цели детергентами являются катионные детергенты, например ЦТАБ. В таких вариантах осуществления изобретения первая часть детергента (которая связана с полимером), предпочтительно, составляет примерно 5-95% от общего количества детергента в композиции, более предпочтительно, примерно 10-90%, еще более предпочтительно, примерно 10-60% и, наиболее предпочтительно, примерно 25-40%.

В других вариантах осуществления изобретения первая часть детергента и вторая часть детергента содержат разные детергенты. Так, например, первая часть детергента может включать неионный детергент (например, ПВС), и вторая часть детергента может включать катионный детергент (например, ЦТАБ).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения к указанным выше композициям микрочастиц добавляют фармацевтически приемлемый эксципиент.

Другой аспект настоящего изобретения относится к доставке макромолекулы позвоночному субъекту, которая включает введение позвоночному субъекту указанной выше композиции микрочастиц.

В дополнительном аспекте изобретение относится к способу проявления клеточной и/или гуморальной иммунной реакции у позвоночного субъекта, который включает введение позвоночному субъекту терапевтически эффективного количества композиции микрочастиц, определенной выше.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу иммунизации, который включает введение позвоночному субъекту терапевтически эффективного количества композиции микрочастиц, определенной выше.

В других аспектах настоящего изобретения указанные выше композиции микрочастиц используют при диагностике заболеваний, при лечении заболеваний, в составе вакцин и/или для усиления иммунитета.

Еще другие аспекты настоящего изобретения относятся к способам получения композиций микрочастиц. В целом, указанные способы включают: (а) получение эмульсии, содержащей (i) полимер, выбранный из группы, состоящей из поли(α-гидроксикислоты), полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона, полиортоэфира, полиангидрида и полицианоакрилата, (ii) органический растворитель, (iii) детергент и (iv) воду; и последующее (b) удаление органического растворителя. В указанном варианте осуществления изобретения примерно 10-90% всего детергента в полученной композиции, предпочтительно, связано с микрочастицами, более предпочтительно, примерно 10-60% и, наиболее предпочтительно, примерно 25-40%. В целом, указанные композиции микрочастиц далее инкубируют с биологически активной макромолекулой, такой как указано выше, с образованием биологически активной композиции.

Предпочтительно, эмульсия представляет собой эмульсию вода–в–масле–в–воде, которая образуется посредством способа, включающего: (а) эмульгирование органической фазы, содержащей полимер и органический растворитель, с первой водной фазой,

содержащей воду, с образованием эмульсии вода–в–масле; и (b) эмульгирование второй водной фазы, содержащей катионный детергент и воду, с эмульсией, образованной на стадии (а), с получением эмульсии вода – в – масле – в – воде.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения детергент представляет собой катионный детергент, который обеспечивается в виде эмульсии при массовом соотношении детергента к полимеру от примерно 0,05:1 до примерно 0,5:1. В указанных вариантах осуществления изобретения способ, предпочтительно, дополнительно включает фильтрование частиц в поперечном потоке после стадии удаления растворителя. В конкретном варианте осуществления изобретения полимер представляет собой поли(D,L-лактидкогликолид), катионный детергент представляет собой ЦТАБ и катионный детергент обеспечивается в виде эмульсии при массовом соотношении детергента к полимеру от примерно 0,1:1 до примерно 0,5:1.

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения детергент представляет собой катионный детергент, который обеспечивается в виде эмульсии при массовом соотношении детергента к полимеру, от примерно 0,001:1 до примерно 0,05:1. При указанных низких уровнях обычно отсутствует необходимость в стадии фильтрования или промывания для удаления избытка детергента. В конкретном варианте осуществления изобретения катионный детергент представляет собой ЦТАБ, полимер представляет собой поли(D,L-лактидкогликолид), катионный детергент обеспечивается в виде эмульсии при массовом соотношении детергента к полимеру от примерно 0,002:1 до

примерно 0,04:1, и микрочастицы не подвергают стадии удаления ЦТАБ из композиции.

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к способам получения композиций микрочастиц, при этом указанные способы включают: (1) получение микрочастиц в процессе эмульгирования, причем указанные микрочастицы включают полимер и первую часть детергента, который связывается с микрочастицами; и (2) адсорбирование комплекса биологически активной макромолекулы и второй части детергента на поверхности микрочастицы. Первая часть детергента и вторая часть детергента могут включать один и тот же детергент или разные детергенты. Полимер, предпочтительно, выбирают из группы, состоящей из поли(α-гидроксикислоты), полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона, полиортоэфира, полиангидрида и полицианоакрилата.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первая и вторая части детергента включают один и тот же детергент. Указанный детергент, предпочтительно, представляет собой катионный детергент, например, ЦТАБ. В таких вариантах осуществления изобретения примерно 10-90%, более предпочтительно, примерно 10-60% и, наиболее предпочтительно, 25-40% от всего количества детергента в композиции микрочастиц присутствует в виде первой части детергента, который связан с микрочастицами. В типичном случае весь детергент добавляют в ходе процесса эмульгирования.

В других вариантах осуществления изобретения первая часть детергента включает первый детергент, а вторая часть детергента

включает второй детергент, отличающийся от первого детергента. В типичном случае первый детергент добавляют в ходе процесса эмульгирования, а второй детергент добавляют после процесса эмульгирования, предпочтительно, одновременно с добавлением биологически активной макромолекулы. Предпочтительно, первая часть детергента включает неионный детергент, такой как ПВС, а вторая часть детергента включает катионный детергент, такой как ЦТАБ.

Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения будут понятны специалистам в данной области из приведенного ниже раскрытия.

На чертеже представлена схематическая диаграмма аппарата, подходящего для получения микрочастиц согласно настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Практическое осуществление настоящего изобретения включает, если особо не оговорено иное, традиционные методы химии, химии полимеров, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, все из которых доступны специалистам в данной области. Такие методики хорошо представлены в литературе. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S., ed. CRC Press, 1997) и Seymour/Carraher's Polymer Chemistry (4th edition, Marcel Dekker Inc., 1996).

Все публикации, патенты и заявки на патенты, процитированные в настоящем описании ранее или далее, включены в настоящее описание в качестве ссылки.

В контексте настоящего описания и предлагаемой формулы изобретения термин "микрочастица" (в единственном числе) относится к одной или более микрочастицам и т.д.

А. Определения

В ходе описания настоящего изобретения будут использоваться следующие термины и их следует понимать как указано ниже.

Если особо не оговорено иное, все проценты и соотношения даются на основе массовых частей.

Термин "микрочастица" в контексте настоящего описания относится к частице с диаметром от примерно 10 нм до примерно 150 мкм, более предпочтительно, с диаметром от примерно 200 нм до примерно 30 мкм и, наиболее предпочтительно, с диаметром от примерно 500 нм до примерно 10 мкм. Предпочтительно, микрочастицы имеют диаметр, который позволяет осуществлять парентеральное введение или введение через слизистую без закупорки игл и капилляров. Размер микрочастицы может быть легко определен известными в данной области техники способами, такими как фотонно-корреляционная спектроскопия, лазерная дифрактометрия и/или электронная сканирующая микроскопия. Термин "частица" может также использоваться для обозначения микрочастицы, определенной в настоящем описании.

Полимерные микрочастицы для использования согласно настоящему описанию получают из материалов, которые могут подвергаться стерилизации, являются нетоксичными и биоразлагаемыми. Такие материалы включают, не ограничиваясь этим, поли(α-гидроксикислоту), полигидроксимасляную кислоту, поликапролактон, полиортоэфир, полиангидрид, ПАЦА и полицианоакрилат. Предпочтительно, микрочастицы, используемые согласно настоящему изобретению, представляют собой микрочастицы полимера, полученного из поли(α-гидроксикислоты), в частности, из поли(лактида) ("ПЛА") или из сополимера D,L-лактида и гликолида или гликолевой кислоты, такого как поли(D,L-лактидкогликолид) ("ПЛГ" или "ПЛГА"), или сополимера D,L-лактида и капролактона. Микрочастицы полимера могут быть получены из любого из множества исходных полимерных материалов, характеризующихся различными молекулярными массами, и в случае сополимеров, таких как ПЛГ, характеризующихся различными соотношениями лактид:гликолид, выбор которых определяется, главным образом, конкретной ситуацией, зависящей, в частности, от природы совместно вводимой макромолекулы. Указанные параметры более подробно обсуждаются ниже.

Термин "детергент" в контексте настоящего описания включает поверхностно-активные вещества, диспергирующие агенты, суспендирующие агенты и стабилизаторы эмульсий. Анионные детергенты включают, не ограничиваясь этим, ДСН (додецилсульфат натрия), ЛСН (лаурилсульфат натрия), ДСС (дисульфосукцинат), сульфатированные жирные спирты и др. Катионные детергенты включают, не ограничиваясь этим, цетримид (цетилтриметиламмония бромид или "ЦТАБ"), хлорид бензалкония, ДДА (бромид диметилдиоктодециламмония), ДОТАП (диолеоил-3-триметиламмонийпропан) и др. Неионные детергенты включают, не ограничиваясь этим, неионные поверхностно-активные вещества, такие как ПВС, повидон (известный также, как поливинилпирролидон или ПВП), сложные эфиры сорбитана, полисорбаты, полиоксиэтилированные гликолевые моноэфиры, полиоксиэтилированные алкилфенолы, полоксамеры и др.

После образования микрочастиц детергент может быть связан или не связан с ними. В случае наличия связи детергент может быть присоединен к микрочастицам посредством любого механизма, включая, но не ограничиваясь этим, ионную связь, водородную связь, ковалентную связь, физический захват, связь Ван-дер-Ваальса, а также связь по типу гидрофильного/гидрофобного взаимодействия.

Термин "макромолекула" в контексте настоящего описания относится, без ограничения, к фармацевтическому агенту, полинуклеотиду, полипептиду, гормону, ферменту, медиатору транскрипции или трансляции, интермедиату метаболического пути, иммуномодулятору, антигену, адъюванту или к их сочетаниям. Ниже более подробно описаны конкретные макромолекулы, используемые согласно настоящему изобретению. "Комплексованная" (в виде комплекса) макромолекула представляет собой макромолекулу, которая сформировала ассоциацию с детергентом и которая после этого стала способна к адсорбции на микрочастице.

Термин "фармацевтический агент" относится к биологически активным соединениям, таким как антибиотики, противовирусные средства, факторы роста, гормоны и др., которые ниже обсуждаются более детально.

Термин "адъювант" относится к любому веществу, которое способствует действию фармацевтического агента или модифицирует его, включая, но не ограничиваясь, иммунологические адъюванты, которые повышают или разнообразят иммунную реакцию на антиген.

"Полинуклеотид" представляет полимер нуклеиновой кислоты, который в типичном случае кодирует биологически активный (например, иммуногенный или терапевтический) белок или полипептид. В зависимости от природы полипептида, кодируемого полинуклеотидом, полинуклеотид может включать всего лишь 10 нуклеотидов, например, когда полинуклеотид кодирует антиген. Далее, "полинуклеотид" может включать двухцепочечные и одноцепочечные последовательности и относиться, не ограничиваясь этим, к кДНК на основе вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, последовательностям геномной РНК и ДНК из вирусной (например, РНК и ДНК вирусов и ретровирусов) или прокариотической ДНК, и в особенности, синтетическим последовательностям ДНК. Указанный термин также охватывает последовательности, которые включают любые из известных аналогов оснований ДНК и РНК. Термин также включает модификации, такие как делеции, добавки и замещения (в основном, консервативные по природе) на основе природных последовательностей, предпочтительно, таких, когда молекула нуклеиновой кислоты кодирует терапевтический или антигенный белок. Указанные модификации могут быть осуществлены как через сайт-направленный мутагенез, так и в ходе случайных событий, таких как последствия мутаций хозяйских клеток, продуцирующих антигены.

Термины "полипептид" и "белок" относятся к полимерам из аминокислотных остатков, причем без ограничения минимальной длины продукта. Так, пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и им подобные включены в настоящее определение. Данным определением охватываются и белки полной длины, и их фрагменты. Указанные термины включают также модификации, такие как делеции, добавки и замещения (в основном, консервативные по своей природе) природных последовательностей, предпочтительно, таких, когда белок сохраняет способность вызывать иммунологическую реакцию или оказывать терапевтическое воздействие у субъекта, которому вводят белок.

Термин "антиген" обозначает молекулу, которая содержит один или более эпитопов, способных к стимуляции иммунной системы хозяйской клетки с генерированием клеточного антигенспецифичного иммунного ответа, когда антиген присутствует в соответствии с настоящим изобретением, или гуморального ответа, опосредованного антителами. Антиген может обладать способностью к генерированию клеточного или гуморального ответа либо сам по себе, либо когда он присутствует в комбинации с другой молекулой. В норме эпитоп будет включать примерно от 3 до 15, в основном, примерно от 5 до 15 аминокислот. Эпитопы соответствующего белка могут быть идентифицированы с помощью множества методик картирования эпитопа, хорошо известных в данной области техники. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Так, например, линейные эпитопы могут быть определены, например, посредством одновременного синтеза большого числа пептидов на твердых подложках, причем пептиды соответствуют частям белковой молекулы, и взаимодействием пептидов с антителами, когда пептиды все еще остаются прикрепленными к подложкам. Такие методики известны в данной области техники и описаны в патенте США № 4701871 и Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23, 709-715, которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Аналогично, легко могут быть идентифицированы конформационные эпитопы посредством определения пространственной структуры аминокислот, например, методами рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, указано выше.

Термин "антиген" в контексте настоящего описания обозначает как субъединичные антигены, то есть антигены, которые были очищены и выделены из целого организма, с которым антиген связан в природе, так и убитые, аттенцированные или инактивированные бактерии, вирусы, паразиты или другие микробы. Антитела, такие как антиидиотипические антитела, или их фрагменты, и синтетические пептидные мимотопы, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту, также охватываются определением антигена в контексте настоящего описания. Аналогично, в определение антигена в контексте настоящего описания включены олигонуклеотид или полинуклеотид, которые экспрессируют терапевтический или иммуногенный белок, или антигенную детерминанту in vivo, из числа тех, что находят применение в генной терапии и при иммунизации нуклеиновой кислотой.

Кроме того, для целей настоящего изобретения антигены могут быть получены из любого представителя ряда известных вирусов, бактерий, паразитов и грибов, а также из любого из множества опухолевых антигенов. Кроме того, для целей настоящего изобретения термин "антиген" относится к белку, который включает модификации, такие как делеции, добавки и замещения (в основном, консервативные по природе), природных последовательностей при том условии, что белок сохраняет способность вызывать иммунологический ответ. Указанные модификации могут быть осуществлены либо посредством сайт-направленного мутагенеза, либо они могут быть результатом случайных событий, таких, например, которые возникают при мутации хозяйских клеток, продуцирующих антигены.

Понятие "иммунологическая реакция" на антиген или композицию представляет собой развитие у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа на молекулы, присутствующие в интересующей композиции. В рамках настоящего изобретения термин "гуморальная иммунная реакция" относится к иммунной реакции, опосредованной молекулами антител, в то время как понятие "клеточная иммунная реакция" представляет собой иммунную реакцию, опосредованную через Т-лимфоциты и/или иные лейкоциты. Один важный аспект клеточного иммунитета включает антигенспецифичную реакцию цитолитических Т-клеток (ЦТК). ЦТК обладают специфичностью к пептидным антигенам, которые присутствуют в сочетании с белками, кодируемыми основным гистосовместимым комплексом (ОГК [MHC]) и экспрессирующимися на поверхности клеток. ЦТК содействуют индукции и усилению внутриклеточной деструкции внутриклеточных микробов или лизису клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета включает антигенспецифичные реакции Т-хелперов. Т-хелперы действуют в направлении стимуляции функции и концентрации активности неспецифических эффекторных клеток против клеток, несущих на своей поверхности пептидные антигены в сочетании с молекулами ОГК. Термин "клеточная иммунная реакция" также относится к образованию цитокинов, хемокинов и других таких молекул, продуцируемых активированными Т-клетками и/или другими лейкоцитами, включая те из них, которые получены из CD4+ и CD8+ Т-клеток.

Композиция, такая как иммуногенная композиция, или вакцина, которая вызывает клеточную иммунную реакцию, могут служить для сенсибилизации позвоночного субъекта посредством презентирования антигена в сочетании с молекулами ОГК на клеточной поверхности. Опосредованная через клетки иммунная реакция направлена на клетки, несущие на своей поверхности антиген, или на участки рядом с ними. Кроме того, антигенспецифичные Т-лимфоциты могут быть генерированы с целью осуществления последующей защиты иммунизированного хозяина.

Способность конкретного антигена или композиции стимулировать опосредованную через клетки иммунологическую реакцию может быть обнаружена с помощью множества тестов, таких как тесты на лимфопролиферацию (активацию лимфоцитов), тесты на цитотоксичность ЦТЛ путем исследования специфичности Т-лимфоцитов на указанный антиген у сенсибилизированного субъекта, или посредством измерения образования цитокина Т-клетками в ответ на повторную стимуляцию антигеном. Такие тесты хорошо известны в данной области техники. См., например, Erickson et al., J. Immunol (1993) 151: 4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 2369-2376; и приведенные ниже примеры.

Таким образом, иммунологическая реакция в контексте настоящего описания может представлять собой такую реакцию, которая стимулирует продукцию ЦТЛ и/или продукцию или активацию Т-хелперных клеток. Интересующий антиген может также вызывать иммунную реакцию, опосредованную антителами. Следовательно, иммунологическая реакция может включать один или более следующих эффектов: образование антител В-клетками и/или активацию супрессорных Т-клеток и/или γδ-Т-клеток, специфически направленную на антиген или антигены, присутствующие в интересующей композиции или вакцине. Указанные реакции могут служить для нейтрализации инфекционности и/или играть роль посредника в системе антитело – комплемент или в антителозависимой клеточной цитотоксичности (AОКЦ) с целью обеспечения защиты иммунизированного хозяина. Такие реакции могут быть определены с помощью стандартных иммунологических методов анализа и методов нейтрализации, известных в данной области техники.

Композиция, которая содержит выбранный антиген, адсорбированный на микрочастице, проявляет "повышенную иммуногенность", которая характеризуется тем, что она проявляет более высокую способность вызывать иммунный ответ по сравнению с иммунным ответом, вызываемым эквивалентным количеством антигена в случае его доставки без сочетания с микрочастицей. Таким образом, композиция может проявлять "повышенную иммуногенность", поскольку антиген характеризуется более высокой иммуногенностью за счет его адсорбции на микрочастице, или поскольку необходима меньшая доза антигена для проявления иммунной реакции у субъекта, которому вводится данная композиция. Такая повышенная иммуногенность может быть определена посредством введения композиции микрочастица/антиген и антигенного контроля животным и сравнения титра антител в обоих вариантах с использованием стандартных методов анализа, таких как радиоиммуноанализ и ELISA (ИФТФА), известных в данной области техники.

Термины "эффективное количество" или "фармацевтически эффективное количество" композиции, содержащей микрочастицы с адсорбированными макромолекулами, в контексте настоящего описания относятся к нетоксичному, но достаточному количеству композиции микрочастица/макромолекула для лечения или диагностики данного состояния. Так, например, указанные выражения могут относиться к количеству, достаточному для обеспечения желательной реакции, такой как иммунологическая реакция, и соответствующего терапевтического эффекта, или в случае доставки терапевтического белка, к количеству, достаточному для эффективного лечения субъекта, как указано ниже. Как будет также указано ниже, точное необходимое количество будет варьировать от субъекта к субъекту в зависимости от вида, возраста и общего состояния здоровья субъекта, от тяжести состояния, которое предстоит лечить, от конкретной природы интересующей макромолекулы, от способа введения и др. Соответствующее "эффективное" количество в любом индивидуальном случае может быть определено специалистом в данной области техники с использованием рутинных экспериментов.

Термин "позвоночный субъект" обозначает любого представителя позвоночных, включая, без ограничения, млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы, лошади и человек; домашних животных, таких как собаки и кошки; и птиц, включая домашних, диких и поющих птиц, таких как петухи и куры, включая цыплят, индеек и других представителей группы куриных. Термин не указывает на конкретный возраст субъекта. Так, и взрослые, и новорожденные животные охватываются данным термином.

Термин "фармацевтически приемлемый" или "фармакологически приемлемый" относится к материалу, который не является биологически или по какой-либо иной причине нежелательным, то есть указанный материал может вводиться индивидууму в сочетании с композицией микрочастиц, не вызывая каких-либо нежелательных биологических эффектов у индивидуума или не вступая во вредные взаимодействия с какими-либо компонентами композиции, в составе которой они находятся.

Термин "эксципиент" относится к веществам, которые обычно входят в состав готовых дозированных форм и которые включают носители, связующие вещества, дезинтегранты, наполнители (разбавители), лубриканты, глиданты (усилители текучести), добавки для прессования, красители, подсластители, консерванты, суспендирующие/диспергирующие средства, пленкообразующие средства/покрытия, вкусовые вещества и маркировочные краски.

Понятие "физиологический рН" или "рН в физиологическом диапазоне" обозначает значение рН в диапазоне приблизительно 7,2-8,0, включительно, более типично, в диапазоне приблизительно 7,2-7,6, включительно.

В контексте настоящего описания термин "лечение" (включая его вариации, например, "лечить" или "подвергнуть лечению") относится к любому из следующих определений: (i) профилактика инфекции или повторной инфекции, как в случае традиционной вакцины; (ii) снижение или устранение симптомов и (iii) существенная или полная элиминация патогена или рассматриваемого заболевания. Лечение может осуществляться профилактически (до инфекции) или терапевтически (в процессе инфекции).

В контексте настоящего описания выражение "нуклеиновая кислота" относится к ДНК, РНК или химерным формам, образованным на их основе.

В контексте настоящего описания выражение "олигонуклеотид, включающий, по меньшей мере, один мотив CpG", относится к полинуклеотиду, включающему, по меньшей мере, один динуклеотид CpG. Олигонуклеотиды, включающие, по меньшей мере, один мотив CpG, могут включать множественные CpG мотивы. Указанные олигонуклеотиды известны в данной области техники также, как "CpG олигонуклеотиды". В контексте настоящего описания выражение "CpG мотив" относится к динуклеотидной части олигонуклеотида, которая включает цитозиновый нуклеотид, за которым следует гуанозиновый нуклеотид. Вместо цитозина может также использоваться 5-метилцитозин.

В контексте настоящего описания термин "репликон вектора альфа-вирусной РНК", "конструкция РНК-вектора" и "репликон" относится к молекуле РНК, которая способна осуществлять свою собственную амплификацию или саморепликацию in vivo, внутри целевой клетки. Репликон вектора альфа-вирусной по происхождению РНК должен содержать следующую порядковую последовательность элементов: вирусные 5'-последовательности, которые необходимы в цис-форме для репликации (также обозначаемые, как 5'-CSE), последовательности, которые при их экспрессии кодируют биологически активные неструктурные белки альфа-вирусов (например, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), вирусные 3'-последовательности, необходимые в цис-форме для репликации (также обозначаемые, как 3'-CSE), и полиаденилатный участок. Репли