Мемнопептиды, способ их получения и их применение

Мемнопептиды, способ их получения и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к новым производным пептидов, называемыми мемнопептидами, которые можно получить брожением Memnoniella echinata FH2272, DSM 13195 в культуральной среде, к способу получения мемнопептидов и к применению мемнопептидов в качестве фармацевтических препаратов, например, для производства фармацевтического препарата для лечения сердечной недостаточности.

Сердечно-сосудистые заболевания еще занимают первое место в качестве причин смерти в западных промышленных странах. Значительную часть из них представляют собой пациенты с диагнозом сердечной недостаточности. Значение термина «сердечная недостаточность» подразумевает неадекватное функционирование сердца. Сердце неспособно продуцировать выброс, соответствующий потребностям млекопитающего. Сердечная недостаточность представляет собой острую или хроническую неспособность сердца в условиях нагрузки или даже в покое обеспечить выброс крови, необходимый для метаболизма, или принять венозный возврат. Она представляет собой состояние сердца, при котором такие механизмы компенсации как частота сердечных сокращений, ударный объем или повышенное давление больше не достаточны для поддержания нормального сердечного выброса. Сердечная недостаточность имеет множество причин, например, воспалительные и дегенеративные изменения миокарда (сердечной мышцы), расстройства коронарного кровообращения и инфаркт миокарда. Сердечная недостаточность приводит к изменениям периферического кровообращения, к нарушению дыхания, почечной функции и электролитного баланса, а также к снижению силы скелетной мускулатуры, а в конечном счете она часто приводит к смерти.

Сердечная недостаточность преимущественно возникает в немолодом возрасте. Ее частота составляет 3 расстройства в год на 1000 жителей в возрасте от 35 до 64 лет и 10/1000/год в возрастной группе от 65 до 94 лет. Фактор смертности у лиц в возрасте 75 лет возрастает почти на 200 по сравнению с возрастной группой от 35 до 44 лет. Как показали исследования в США, с 1970 по 1983 г смертность оставалась приблизительно постоянной. Для Федеративной Республики Германии те же цифры предстоит определить. Более 50% больных умирают в первые 5 лет после установления диагноза. Данное статистическое исследование само по себе показывает большое значение сердечной недостаточности для населения, но оно также подтверждает неадекватные возможности медикаментозного лечения, которые имеются у врача в настоящее время.

Учитывая неадекватность современных способов лечения, были разработаны новые концепции, которые должны привести к созданию новых сердечных лекарственных препаратов. Способность сердечных и скелетных мышц сокращаться и, таким образом, выполнять механическую работу, зависит от (1) сократительных структурных элементов (миофибрилл) и (2) химической энергии (АТФ), доступной для миофибрилл, которая превращается в механическую энергию в процессе сокращения. Укорочение миофибрилл происходит в процессе сокращения. Это может инициироваться двигательными нервными импульсами, под действием которых ионы кальция (Са²⁺) входят в саркоплазматическое пространство из внеклеточного пространства в пределах нескольких миллисекунд, и депо кальция опорожняются. При недостаточности миокарда (сердечной недостаточности) концентрация Са²⁺ в миофибриллах может быть снижена. Однако ионы Са²⁺ играют ключевую роль в активации сократительного аппарата. Если имеется возросшая потребность, Са²⁺ преимущественно закачивается в саркоплазматический ретикулум (СР) под влиянием катализа мембранной Са²⁺-зависимой Mg²⁺-АТФазы: этот фермент также называется Са²⁺АТФаза сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA2). В соответствии с гидропатическим анализом Са²⁺АТФаза включает 10 трансмембранных спиралей и ряд внемембранных петель. С цитозольной стороны образуются домены связывания Са²⁺ и АТФ, фосфорилирования и взаимодействия с модуляторным белком фосфоламбаном (PLB). Последний представляет собой белковый пентамер, который локализуется в мембране СР и оказывает ингибирующее влияние на SERCA2 в нефосфорилированном состоянии. В условиях физиологического стресса происходит фосфорилирование PLB, которое увеличивает сродство SERCA2 с Са²⁺ и, таким образом, увеличивает скорость транспорта ионов Са²⁺ в СР. Фосфорилирование PLB (белка из 52 аминокислот) происходит на двух аминокислотных остатках: серин-16 может фосфорилироваться цАМФ-зависимой протеинкиназой, а треонин может фосфорилироваться в положении 17 киназой, зависимой от Са²⁺/кальмодулина. Фосфорилирование вызывает изменение конформации PLB, за которым следует увеличенное сродство SERCA2 с Са²⁺. Антитела против PLB способны имитировать эффект фосфорилирования PLB и, таким образом, подтверждают ключевую роль PLB в качестве регулятора сократительной активности сердца (Phospholamban: Protein Structure, Mechanism of Action and Role in Cardiac Function. H.K. Simmermann and L.R. Jones, Physiological Reviews; Vol.78, №4,921ff, 1998). Таким образом, активаторы SERCA2 должны оказать благоприятное влияние при сердечной недостаточности.

Неожиданно было обнаружено, что культуры штамма грибов Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 содержат естественные вещества, которые способны проявлять благоприятные воздействия на сердце и кровообращение. Выделенные активные соединения, мемнопептиды, представляют собой естественные вещества, включающие специфические составные группы. Эти составные группы включают терпеновые звенья, так называемую поликетидную часть, и группу, содержащую водород.

Терпены представляют собой естественно встречающиеся соединения, которые могут формально трактоваться как продукты полимеризации углеводорода изопрена. В соответствии с рядом изопреновых групп можно дифференцировать монотерпены (С₁₀), сесквитерпены (C₁₅), дитерпены (С₂₀) и т.д. Большое число соединений может образовываться из родительских структур замещением, циклизацией, перегруппировкой, окислением и т.д.; соответственно, в литературе было описано много тысяч терпенов. Также сообщалось о содержащих азот соединениях, происходящих от терпенов, но они перечисляются среди алкалоидов (например, алколоиды Gentiana) [Römpp Chemie Lexikon [Römpp's Chemical Encyclopedia], 9^th Edition, Volume 6, page 4508 ff., Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York, 1992]. Однако эти терпены кардинально отличаются от мемнопептидов в соответствии с изобретением, в котором терпены не содержат поликетидную группу, с помощью которой они могут связывать азот.

Примерами других известных содержащих азот терпенов являются:

- Стахибоцины [J.Antibiotics, 48:1396 (1995)];

- Стахиботрины [Y.Nozawa et al. J.Antibiotics, 50:635-645 (1997)];

- Спиродигидробензофурановые лактамы [J.Antibiotics, 49:13 (1996)];

- Накиджихиноны [Tetrahedron, 51:10867-10874 (1995)];

- F1839-A-F1839-J представляют собой содержащие азот терпены, имеющие поликетидные части [патенты Японии 061864133 и 08283118]. Они являются ингибиторами холестеринэстеразы.

Данные терпеновые производные были синтезированы из различных штаммов родов Memnoniella echinata и Stachybotrys и других. Они были описаны как антагонисты эндотелинового рецептора, как ингибиторы протеазы ВИЧ-1 и холестринэстеразы и как тонизирующие средства для волос. Ингибитор инозитолмонофосфотазы L-671,776 был, кроме того, выделен из культур штамма Memnoniella echinata ATCC 20928 [Y.К.Т.Lam et al. J. Antibiotics, 45, pp.1397-1402, (1992)].

Мемнопептиды в соответствии с изобретением имеют отличающийся спектр активности. Характерным признаком является их активирующее воздействие на SERCA2 и, таким образом, на сердце при его недостаточности.

Таким образом, настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)

в которой

R₁ и R₂ вместе представляют собой О с двойной связью, или Н₂, или Н и ОН, или Н и O-C₁-C₄-алкил;

R₃ и R₄ вместе представляют собой О с двойной связью, или Н₂, или Н и ОН, или Н и O-С₁-С₄-алкил;

R₈ выбран из Н, ОН, С₁-С₄-алкила и O-С₁-С₄-алкила, такого как O-метил;

R₆ представляет собой группу формулы (II)

в которой

R₉ представляет собой Н или сахар, связанный гликозидной связью, или группу формулы (III)

в которой R₁₀ представляет собой Н или сахар, связанный гликозидной связью;

и в которой,

если R₆ представляет собой группу формулы (II), то R₅ представляет собой связь с атомом углерода С9 формулы (II), а R₇ представляет собой Н, или R₇ представляет собой связь с атомом углерода С9 формулы (II), a R₅ представляет собой Н и

если R₆ представляет собой группу формулы (III), то R₅ и R₇ представляют собой Н;

А представляет собой аминокислоту;

n представляет собой целое число, выбранное от 1 до 12, причем каждая А такая же или отлична от каждой другой А;

в которой атом азота в изоиндольном кольце формулы (I) представляет собой азот N-концевого амина первой аминокислоты группы (А)_n;

или их соли или производному;

при условии, что

А представляет собой аминокислоту, отличную от Glu, когда n равно 1 и R₁ и R₂ вместе представляют собой О с двойной связью и R₃ и R₄ вместе представляют собой H₂, a R₆ представляет собой группу формулы (II), a R₅ представляет собой связь с атомом углерода С9 группы формулы (II), а R₇ представляют собой Н, a R₈ представляют собой Н и R₉ представляют собой Н.

В формуле (I) (А)n может представлять собой, по меньшей мере, одну природную аминокислоту, выбранную из: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Ser, Thr, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, Asp, His, Glu, Asn, Gin, Cys и Met. A(n) может представлять собой пептидную цепь, имеющую от 2 до 12 аминокислот. В одном варианте реализации А(n) включает 10 аминокислот.

С₁-С₄-алкил представляет собой прямоцепочечный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода, такой как метил, этил, изо-пропил или трет-бутил.

Сахар может представлять собой гексозу, например альдогексозу, такую как манноза, глюкоза или галактоза, которая может быть необязательно замещена дополнительными группами, такими как C₁-C₄-алкил или NH₂.

Настоящее изобретение, кроме того, относится ко всем очевидным производным соединений формулы I. Производные представляют собой соли, продукты восстановления, сложные эфиры, простые эфиры, ацетаты, а также амиды и продукты N-алкилирования, кроме того, все оптические антиподы, диастереомеры и все стереомерные формы.

В одном варианте реализации соединение формулы (I) имеет формулу (IV)

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₉ и (А)n имеют значение, как указано выше. В формуле (IV) R₁ и R₂, взятые вместе, могут представлять собой О с двойной связью, R₃ и R₄ вместе могут представлять собой Н₂, и R₉ может представлять собой Н.

В одном варианте реализации соединение изобретения представляет собой мемнопептид A, C₇₆H₁₀₈N₁₆O₁₈S формулы (IVa)

В этой формуле декалиновая структура, имеющая 4-метиловые и одну метиленовую группу, представляет собой терпеновую часть; замещенное изоиндольное кольцо представляет собой кетидную часть. Аминокислотная последовательность:

Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro (SEQ ID NO:1)

является частью казеиновой последовательности. Метионин (Met) может быть окислен до сульфоксида.

Формула (IVb) показывает предпочтительную пространственную форму:

в которой (А)n имеет значение, как указано выше.

Физико-химические и спектроскопические свойства предпочтительного соединения в соответствии с изобретением можно обобщить следующим образом:

Мемнопептид А

Внешний вид:	Бесцветное вещество, растворимое в полярных органических растворителях и в воде.
Обладает	Устойчивостью в нейтральной, слегка кислотной среде
Эмпирическая формула:	C76H108N16O18S,
Молекулярная масса:	1565,87 Да,
Поглощение УФ света (λmax):	270 нм
Данные ЯМР:	См. табл.1

Нумерация атомов углерода и ассоциированных ЯМР химических сдвигов классифицируется в соответствии с процедурой нумерации для циклических сесквитерпенов.

Фиг.1: Нумерация циклического сесквитерпена кетолида.

Таблица 1Данные ЯМР (химические сдвиги) мемнопептида А в ДМСО - d6 при 310К.
	δ-13С	м	δ-1H	м	nJнн	nJСН (10 Гц)	Принадлеж-ть
1	15.42	кв	0.668	д	1.802	1.802	Терпен-8-Me
2	15.72	кв	0.978	s	-	2.035, 1.763	Терпен-10-Ме
3	20.37	т	1.409	м	2.035, 1.538	2.035	Терпен-6
			1.460		2.035
4	21.43	кв	0.873	д	1.678	1.678, 1.428, 0.890	Leu8-δ
5	22.25	кв	0.827	s	0.918	0.918, 2.035	Терпен-4-Me
6	22.64	т	2.182	ддт	4.892, 2.788, 2.632	4.892, 2.788, 2.632	Мет1-β
			2.307	ддт
	22.80	т	2.19	ддт	4.869, 2.757, 2.635	4.869, 2.752, 2.635
			2.31	ддт
7	23.08	кв	0.890	д	1.678	1.678, 1.428, 0.873	Leu6-β'
8	23.88 ушир	д	1.678	м	0.87, 0.88		Leu8-γ
9	23.90	т	1.764	мм	0.962, 1.416, 1.871	0.978, 1.416, 3.227	Терпен-1
			0.962

	δ-13С	м	δ-1H	м	nJнн	nJСН (10 Гц)	Принадлеж-ть
10	24.22	т	1.910	м	2.144, 4.588, 3.467	2.144, 1.771, 4.588,3.467, 3.689	Pro9-γ
11	24.32	т	1.863	м	2.031, 1.798, 3.625	4.356, 3.625, 2.153,1.792	Pro4-γ
12	24.37	т	1.927	м	(2.153), (1.814),3.624	4.388, 3.624, 1.814	Pro7-γ
13	24.43	т	1.926	м	2.144, 1.840,3.655, 3.538	4.224, 3.655,3.538	Pro10-γ
14	24.77	т	1.8401.416	мм	1.416, 1.740, 0.9621.840, 0.926	-	Терпен-2
15	26.51	т	1.9401.719	мм	1.719, 4.484, 2.1981.719, 4.484, 2.198	2.198	Gln3-β
16	26.85	т	1.9271.722	мм	1.722, 4.468, 2.1661.927, 4.468, 2.166	2.166	Gln6-β
17	27.04 ушир	т	2.9763.067	дд дд	4.598	-	His5-β
18	27.09	т	2.9373.067	дд дд	4.570	(4.570)	His2-β
19	27.50	т	2.1441.771	мм	1.771, 4.578, 1.905,1.9452.144, 4.578, 1.905,1.945	1.945, 3.689, 3.467,4.578	Pro9-β
20	28.34	т	2.1441.840	мм	1.840, 4.223, 1.9262.144, 4.223, 1.926	4.223, 3.669,3.533	Pro10-β
21	28.50	KB	0.918	s	0.827	0.827	Терпен-4-Ме
22	28.86	т	1.7982.031	мм	4.356, 2.031,(1.863)		Pro4-β
23	28.89	т	1.8142.012	мм	2.012, 4.388, (1.927)1.814, 4.388, (1.927)	4.388, 3.646	Pro7-β
24	30.63	т	1.5381.430	мм	1.430, 1.460, (1.409)(1.802)1.538, 1.460,1.802	0.667	Терлен-7
25	30.64	т	2.166	т	1.927, 1.722	1.927, 1.722, 4.466,	Gln6-γ
26	30.65	т	2.192	т	1.940, 1.719	1.940,	Gln3-γ
27	31.62	т	3.1542.792	дд	2.7923.154	6.598	Терпен-11
28	36.43	д	1.802	ддкв	1.538, 1.430, 0.667	0.667, 2.790, 3.156	Терпен-8
29	37.22	S	-	-	-	0.903, 0.824	Терпен-4
30	37.7337.84	KB	2.5482.546	s	-	2.682, 2.7582.633, 2.783	Мет1-ε

	δ-13С	м	δ-1Н	м	nJНН	nJСН (10 Гц)	Принадлеж-ть
31	39.45	д	2.035	дд	1.409, 1.460	0.903, 0.824, 0.971	Терпен-5
32	40.0740.03	т	1.428	дт	4.536, 1.678	0.890, 0.873,4.536	Leu8-β
33	41.71	s	-	-	-	3.156, 2.790, 0.977, (1.764), 2.035	Терпен-10
34	44.25	т	4.332	-	-	4.881	Терпен-8'
35	46.10	т	3.6693.533		1.934	4.223, 2.147, 1.934,1.851	Pro10-δ
36	46.53	т	3.6893.467	мм	1.905,1.936	4.588, 2.165, 1.781,1.936	Pro9-δ
37	46.81	т	3.624	м	1.927	1.814, 4.388	Pro7-δ
38	46.87	т	3.644	м	1.863	-	Pro4-δ
39	48.56	д	4.534	дт	7.918, 1.428	7.918, 1.428,1.678	Leu8-α
40	49.4449.70	т т	2.6822.758 2.6332.783	ддтддт ддтддт	2.758, 2.162, 2.2892.682, 2.162,2.289 2.783, 2.289 2.1622.633, 2.289, 2.162	4.892, 2.5504.869, 2.545	Met1-γ
41	50.18	д	4.466	дт	8.110, 1.927, 1.722	2.166	Gln6-α
42	50.31	д	4.484	дт	8.206, 1.935, 1.707	2.182	Gln3-α
43	51.37	д	4.570	ддд	8.135, 2.975, 3.082	2.975, 3.082	His2-α
44	51.68	д	4.5904.585	ддд	8.496, 2.934, 3.0678.506, 2.934, 3.067	2.934, 3.067	His2-α
45	53.3053.62	д	4.8924.869		2.162, 2.284,2.162, 2.284	2.162	Met1-α
46	57.33	д	4.588	дд	2.144, 1.771	2.144,1.771, 1.905,	Pro9-α
47	58.31	д	4.223	дд	2.144, 1.840	3.669,3.553,1.926,	Pro10-α
48	59.20	д	4.388	дд	2.012, 1.814	2.012	Pro7-α
49	59.44	д	4.356	дд	2.031, 1.798	3.635, 1.880	Pro4-α
50	73.5073.51	д	3.227	дд	1.840, 1.416	0.903, 0.824	Терпен-3
51	97.9397.91	s	-			3.154, 2.792,0.972, 0.668	Терпен-9
52	100.90100.88	д	6.5986.596	с	-	-	Терпен-3'
53	112.62112.55	s	-	-	-	6.593, 4.330	Терпен-5'

	δ-13С	м	δ-1H	М	nJHH	nJСН (10 Гц)	Принадлеж-ть
54	116.92116.90	s	-	-	-	3.154, 2.792, 6.597	Терпен-1'
55	116.95	д	7.230	s	8.655	(3.067), 2.937,8.665	His2-ε
56	117.26	д	7.322	s	8.771	3.092, 3.000,	His5-ε
57	129.32	s	-	-	-	8.783, 7.322, 3.083,2.976, 4.585	His5-γ
58	129.63	s	-	-	-	7.230, 3.064, 2.937,4.592	His2-γ
59	133.00132.96	s	-	-	-	4.330	1-4'
60	133.63	д	8.655	s	7.230	7.230	His2-δ
61	133.68	д	8.771	s	7.320	7.320	His5-δ
62	153.60153.62	s	-	-	-	6.597, 3.157,2.792	Терпен-2'
63	155.73	s	-	-	-	(6.597), 3.154,2.792, 4.330	Терпен-6'
64	168.11168.07	s	-	-	-	6.597,4.330, 4.881	Терпен-7'
65	169.57	s	-	-	-	4.588, (4.223)	Pro9-CO
66	169.59	s	-	-	-	8.110, (4.570)	His5-CO
67	169.69	s	-	-	-	4.534, 1.444	Leu8-CO
68	169.74	s	-	-	-	8.207, 2.937, 4.585	His2-CO
69	169.97169.89	s	-	-	-	8.513, 4.869, 2.1908.499, 4.892, 2.182	Met1-CO
70	170.07	s	-	-	-	4.471, 1.733,1.924, 4.356	Gln3-CO
71	170.21	s	-	-	-	4.466, 1.722, 1.927,4.388	Gln6-CO
72	170.99	s	-	-	-	4.538, 4.388, 2.012,1.844, 7.918	Pro7-CO
73	171.32	s	-	-	-	8.138, 4.356, 2.003,1.805, 4.570	Pro4-CO
74	173.10	s	-	-	-	4.225, 2.144, 1.840	Pro10-CO
75	173.80173.81	s	-	-	-	2.19, 1.93, 1.73	3-Gln-δ-CO
76	173.88173.86	s	-	-	-	7.26, 2.19, 1.93,1.73	4-Gln-δ-CO
	ОН		9.75	Ушир		NOE: 6.598	Терпен-2'-ОН
	NH		8.5068.496	Дд	4.585 4.590	NOE: 4.869/4.692	His2-NH

Таблица 2

	δ-13С	м	δ-1H	M	nJHH	nJСН (10 Гц)	Принадлеж-ть
	NH		8.206	д	4.484	NOE: 3.072, 2.948,4.588	Gln3-NH
	NH		8.135	д	4.563		His5-NH
	NH2		8.110	д	4.470	NOE:4.570, (4.470),1.727, (1.927)	Gln6-NH
	NH2		7.918	д	4.534	NOE: 4.388, 1.827,1.688,1.427	Leu8-NH
	NH2		7.2606.807	ss	(6.807) (7.260)		Gln6-NH2
	NH2		7.2306.789	ss	(6.789) (7.230)		Gln3-NH2

В одном варианте реализации изобретения соединения формулы (I) можно получить брожением Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 или одного из его вариантов или мутантов в подходящих условиях в культуральной среде до тех пор пока, по меньшей мере, один мемнопептид формулы (I) не будет присутствовать в культуральной среде, с последующим выделением мемнопептидов.

Поэтому изобретение, кроме того, относится к способу получения соединения формулы I, который включает культивацию микроорганизма Memnoniella echinata FH2272, DSM 13195 в культуральной среде до тех пор, пока, по меньшей мере, один мемнопептид формулы (I) не будет присутствовать в культуральной среде, и последующее выделение мемнопептида из культуральной среды.

В одном варианте реализации штамм FH2272, DSM 13195, его мутанты и/или варианты подвергаются культивации в питательном растворе (называемом также культуральная среда), включающем, по меньшей мере, один источник атомов углерода и, по меньшей мере, один источник атомов азота и, необязательно, включающий обычные неорганические соли, до тех пор пока мемнопептиды не будут присутствовать в культуральной среде. Затем мемнопептиды могут быть выделены из культуральной среды и, необязательно, разделены на отдельные активные компоненты и подвергнуты очистке. В одном варианте реализации мемнопептиды накапливаются в культуральной среде и разделяются на отдельные компоненты.

В другом варианте реализации, по меньшей мере, один источник атомов азота, используемый для культуральной среды, выбирается из аминокислот и пептидов. Аминокислоты и пептиды, используемые в качестве источников атомов азота, могут быть такими же, как группа (А)n, как определено выше.

Способ в соответствии с изобретением может использоваться для культивации в лабораторном масштабе (в диапазоне от мл до л) и в промышленном масштабе (в масштабе м³).

Была выращена колония Memnoniella echinata FH2272, характеризующаяся сильной продуцирующей способностью. Изолят был депонирован 14 декабря 1999 г. в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 330 Brunswick, Germany, в соответствии с правилами Будапештской конвенции, под следующим номером: Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195.

Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 имеет коричнево-зеленый мицелий и характеризуется конидиофорами, характерными для рода Memnoniella.

Варианты и мутанты штамма Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 могут также применяться для синтеза, по меньшей мере, одного соединения мемнопептидов в соответствии с изобретением. Такие мутанты могут быть получены per se известным способом, физическими методами, например, облучения, такого как облучение ультрафиолетовыми или рентгеновскими лучами, или химическим мутагенезом, с использованием таких реагентов, как этилметансульфонат (EMS), 2-гидрокси-4-метоксибензофенон (MOB) или N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (MNNG). Возможные варианты включают тесно связанные виды грибов Stachybotrys, такие как Stachybotrys atra, Stachybotrys chartarum или Stachybotrys complementi.

Скрининг для выявления мутантов и вариантов, которые синтезируют, по меньшей мере, одно соединение мемнопептидов в соответствии с изобретением, может проводиться в соответствии со следующей схемой:

- Отделение мицелия после культивации;

- Экстракция мицелия органическим растворителем;

Экстракция мемнопептидов из фильтрата культуры с использованием твердых фаз;

- Анализ посредством ВЭЖХ нисходящей хроматографии или испытание биологической активности.

Описанные ниже условия культивации относятся к грибу Memnoniella echinata FH 2272, депонированному изоляту DSM 13195 и к его мутантам и вариантам.

В одном варианте реализации в питательном растворе, включающем, по меньшей мере, один источник атомов углерода, казеиновый пептон в качестве источника атомов азота и обычные неорганические соли, Memnoniella echinata FH 2272 продуцирует мемнопептид А. В одном варианте реализации Memnoniella echinata FH 2272 представляет собой DSM 13195.

Возможные источники атомов углерода для аэробной культивации включают ассимилируемые углеводы и сахарные спирты, такие как глюкозу, лактозу, сахарозу, крахмалы, декстрины, фруктозу, мелассу, глицерин, галактозу и D-маннитол, и содержащие углеводы естественные продукты, такие как экстракт солода. Возможные источники атомов азота включают, например, аминокислоты, пептиды, белки, продукты распада аминокислот, пептидов и белков, такие как казеин, пептоны и триптоны; экстракты мяса; экстракты дрожжей; экстракты арахиса; пророщенные семена, например, кукурузы, пшеницы, бобов, сои и хлопчатника; композиции, содержащие семена; остатки перегонки при производстве спиртов; мясная мука; экстракты дрожжей; аммониевые соли и нитраты. В одном варианте реализации, по меньшей мере, один источник атомов азота выбран из синтетически полученных пептидов и биосинтетически полученных пептидов. Питательный раствор необязательно включает, по меньшей мере, одну неорганическую соль. В одном варианте реализации неорганическая соль выбрана из хлоридов, карбонатов, сульфатов и фосфатов. Сульфаты и фосфаты могут быть выбраны из сульфатов щелочных металлов, фосфатов щелочных металлов, сульфатов щелочноземельных металлов и фосфатов щелочноземельных металлов, причем щелочноземельные металлы выбраны из железа, цинка, кобальта и марганца.

Образование мемнопептидов в соответствии с изобретением может проходить в питательном растворе, включающем казеиновый пептон. В одном варианте реализации питательный раствор включает концентрацию казеинового пептона в диапазоне от около 0,05 до 5%. Другой вариант реализации включает концентрацию казеинового пептона в диапазоне от 0,1 до 1%. Еще один вариант реализации включает концентрацию казеинового пептона в диапазоне от 0,2 до 5%. Питательный раствор может включать глюкозу. Один вариант реализации включает концентрацию глюкозы в диапазоне от 0,5 до 3%. Питательный раствор может также включать кукурузный гидролизат. В одном варианте реализации питательный раствор включает концентрацию кукурузного гидролизата в диапазоне от 0,05 до 1%. Другой вариант реализации включает концентрацию кукурузного гидролизата в диапазоне от 0,1 до 0,5%. Питательный раствор может включать следовые количества, по меньшей мере, одного компонента, выбранного из хлорида калия, сульфата магния и сульфата железа.

В одном варианте реализации питательный раствор включает казеиновый пептон, глюкозу, кукурузный гидролизат и следовые количества хлорида калия, сульфата магния и сульфата железа. В другом варианте реализации питательный раствор включает концентрацию казеинового пептона в диапазоне от около 0,05 до 5%, концентрацию глюкозы в диапазоне от 0,5 до 3%, концентрацию кукурузного гидролизата в диапазоне от 0,05 до 1% и следовые количества хлорида калия, сульфата магния и сульфата железа. Данные в процентах в каждом случае связаны с массой всего питательного раствора.

В этом питательном растворе Memnoniella echinata, которая может представлять собой Memnoniella echinata FH 2272 DSM 13195, образует смесь мемнопептидов. В зависимости от состава питательного раствора количественная доля одного или нескольких мемнопептидов в соответствии с изобретением может варьировать. Кроме того, синтез отдельных мемнопептидов может контролироваться составом сред так, что мемнопептид может не продуцироваться вообще или может продуцироваться микроорганизмом в количестве ниже предела выявления.

Культивирование микроорганизма может проводиться в аэробных условиях, т.е., например, погружением со встряхиванием или перемешиванием во встряхиваемых колбах или ферментерах, необязательно с введением воздуха или кислорода. Оно может проводиться в диапазоне температур от около 18 до 37°С, в более узком диапазоне от около 20 до 32°С и в еще более узком диапазоне от 25 до 30°С. Диапазон рН должен быть от 6 до 8, например, от 6,5 до 7,5. В целом микроорганизм культивируется в этих условиях в течение периода от 24 до 300 ч, обычнее от 36 до 140 ч.

Преимущественно культивирование может проводиться в несколько этапов, т.е., по меньшей мере, одна прекультура может быть получена в жидкой питательной среде и затем может быть посеяна в действительную продукционную среду, основную культуру, например, в объемном соотношении 1:10. Прекультура может быть получена, например, посевом мицелия в питательный раствор и предоставлением ей возможности расти в течение приблизительно от 36 до 120 ч, например, в течение от 48 до 72 ч. Мицелий может быть получен, например, предоставлением возможности штамму расти в течение приблизительно от 3 до 40 дней, например, от 4 до 10 дней, на твердой или жидкой питательной среде, например, на солодово-дрожжевом агаре или картофельном декстрозном агаре (стандартная среда для плесневых грибов, например, продаваемая компанией Difco).

За течением культивирования можно следить посредством контроля рН культур или объема мицелия, а также с использованием хроматографических способов, такими как тонкослойная хроматография или высокоэффективная жидкостная хроматография, или испытанием биологической активности. Соединение в соответствии с изобретением может быть и в мицелии, и в фильтрате культуры, но самая большая часть обычно обнаруживается в фильтрате культуры.

Описанный ниже процесс выделения служит для очистки мемнопептидов в соответствии с изобретением, например, мемнопептида А. Выделение или очистка мемнопептида в соответствии с изобретением из культуральной среды может проводиться в соответствии с известными способами с учетом химических, физических и биологических свойств естественных веществ. Для тестирования концентраций мемнопептидов в культуральной среде на отдельных этапах выделения может применяться тонкослойная хроматография, например, на силикагеле, с использованием в качестве элюента изопропанол/25% NH₃, или ВЭЖХ. Определение при выделении тонкослойной хроматографией может проводиться, например, посредством цветных реагентов, таких как хлорсульфоновая кислота/ледяная уксусная кислота, причем количество образовавшегося вещества целесообразно сравнивать с калибровочным раствором.

Для выделения мемнопептида в соответствии с изобретением мицелий в целом сначала удаляют из культурального бульона с использованием обычных процедур, а затем мемнопептиды экстрагируют из клеточной массы с использованием необязательно смешиваемого с водой органического растворителя. Фаза органического растворителя содержит естественные вещества в соответствии с изобретением; она может необязательно концентрироваться в вакууме, и остаток может быть подвергнут дальнейшей очистке, как описано ниже. В одном варианте реализации мемнопептид экстрагируется из культуры добавлением растворителя в смесь грибов и среды.

Фильтрат культуры может необязательно объединяться с концентратом экстракта мицелия и экстрагироваться подходящим, не смешиваемым с водой органическим растворителем, например н-бутанолом. Удаленная в последующем органическая фаза может необязательно концентрироваться в вакууме. Для обезжиривания ценных продуктов концентрат может быть разбавлен неполярным растворителем, в котором соединения в соответствии с изобретением не очень растворимы, например с гексаном, петролейным эфиром или простым диэтиловым эфиром. При этом процессе мемнопептиды осаждаются, а липофильные примеси остаются растворенными и могут быть удалены обычными методами разделения твердой и жидкой фазы.

Преципитат, включающий мемнопептиды, может быть растворен в 1/30 исходного объема воды/метанола. Преципитат растворяется полностью в ходе этой манипуляции и может быть лиофилизирован. Лиофилизат, называемый в последующем неочищенным продуктом, может включать от 5 до 50% мемнопептидов и может применяться для дальнейшего выделения.

Дальнейшая очистка, по меньшей мере, одного пептида в соответствии с изобретением может проводиться хроматографией на подходящих материалах, например, на молекулярных ситах, на силикагеле, оксиде алюминия, на ионообменниках или на адсорбирующих смолах, или на обращенных фазах (RF). Мемнопептиды могут отделяться с помощью данной хроматографии. Хроматография мемнопептидов может проводиться с использованием буферных водных растворов или смесей водных и органических растворов.

Понятие «смеси водных и органических растворов» подразумевает все смешиваемые с водой органические растворители, такие как метанол, пропанол и ацетонитрил, в концентрации от 5 до 80% растворителя, обычнее от 20 до 50% растворителя или, альтернативно, все буферные водные растворы, которые смешиваемы с органическими растворителями. Буферы, которые должны применяться, могут быть такими же, как указано выше.

Отделение мемнопептидов на основании их отличающейся полярности может проводиться с помощью хроматографии в обращенной фазе, например, на MCI® (адсорбирующая смола от компании Mitsubishi, Japan) или Amberlite XAD® (Toso Haas), или дополнительных гидрофобных материалов, таких как на фазах RF-8 или RF-18. Кроме того, отделение может проводиться с помощью нормальнофазной хроматографии, например, на силикагеле, оксиде алюминия и им подобных.

Хроматография мемнопептидов может проводиться с использованием буферного или подкисленного водных растворов или смесей водных растворов со спиртами или другими смешиваемыми с водой органическими растворителями. В одном варианте реализации органический растворитель выбран из пропанола и ацетонитрила.

Под понятием «буферные или подкисленные водные растворы» подразумевается, по меньшей мере, один раствор отдельно или в комбинации. Например, указанный, по меньшей мере, один раствор может быть выбран из воды, фосфатных буферов, ацетата аммония, цитратных буферов и кислот. В одном варианте реализации цитратный буфер находится в концентрации в диапазоне от 0 до 0,5 М. Кислоты выбраны из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты и из всех коммерчески доступных кислот, известных специалисту в данной области. В одном варианте реализации коммерчески доступная кислота находится в концентрации в диапазоне от 0 до 1%. Еще в одном варианте реализации концентрация кислоты составляет 0,1%.

Хроматография может проводиться с использованием градиента, который начинается со 100% воды и заканчивается 100% растворителя. Используется, по меньшей мере, один растворитель. Может также применяться смесь двух или более растворителей. В одном варианте реализации линейный градиент поддерживается от 20 до 50% растворителя, выбранного из пропанола и ацетонитрила.

Альтернативно, может также проводиться гель-хроматография или хроматография на гидрофобных фазах.

Гель-хроматография может проводиться на полиакриламидных или сополимерных гелях, таких как Biogel-P 2®(Biorad) или Fractogel TSK HW 40® (Merck, Germany, или Toso Haas, USA).

Еще одним очень эффективным способом очистки соединений в соответствии с изобретением может быть использование ионообменников. Например, основной мемнопептид А может быть с большим преимуществом выделен на катионных обменниках, таких как Fractogel® EMD SO₃. Могут использоваться буферные растворы с рН от 5 до 8, например с рН от 6 до 7,5. Элюция может быть достигнута, например, использованием повышающегося солевого градиента. В дополнение к воде целесообразно также использовать смеси водных буферных растворов с органическим растворителем в качестве растворителей. Доля органического растворителя может составлять от 10% до 90%, например, от 30 до 60%.

Последовательность указанных выше хрома