Штамм enterobacter agglomerans, способ получения l-глутаминовой кислоты (варианты) и способ получения микроорганизма для выработки l-глутаминовой кислоты

Штамм enterobacter agglomerans, способ получения l-глутаминовой кислоты (варианты) и способ получения микроорганизма для выработки l-глутаминовой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки для изобретения

Настоящее изобретение касается способа получения L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации, сопряженной с ее осаждением. L-глутаминовая кислота широко используется в качестве различных добавок и т.д.

В целом, L-глутаминовая кислота вырабатывается в ходе ферментационного процесса с использованием т.н. коринебактерий, являющихся продуцентами L-глутаминовой кислоты и относящихся к родам Brevibacterium, Corynebacterium или Microbacterium или представляющих их мутантные штаммы («Amino Acid Fermentation», Gakkai Shuppan Center, 1986, pp.195-215). В качестве способов выработки L-глутаминовой кислоты путем ферментации с использованием других бактериальных штаммов известен способ, в котором используются микроорганизмы, относящиеся к родам Bacillus, Streptomyces, Penicillum или подобным (патент США № 3220929), способ, основанный на использовании микроорганизмов, относящихся к родам Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida или подобным (патент США № 3563857), способ, в котором используются микроорганизмы, относящиеся к родам Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (в настоящее время определяемого как Enterobacter aerogenes) или подобным (японская патентная публикация (Ко Ко Ku) № 32-9393), способ, основанный на использовании мутантного штамма Escherichia coli (открытая японская патентная публикация (Ко Kai) № 5-244970 и другие. Кроме того, заявители настоящего изобретения представляют способ выработки L-глутаминовой кислоты с использованием микроорганизма, относящегося к родам Klebsiella, Erwinia или Pantoea (открытая японская патентная заявка № 2000-106869).

Кроме того, были заявлены различные способы повышения способности к выработке L-глутаминовой кислоты за счет усиления активностей ферментов, участвующих в биосинтезе L-глутаминовой кислоты за счет использования методологии рекомбинантной ДНК. Например, было сообщено, что внесение гена, кодирующего цитратсинтазу, происходящую от Escherichia coli или Corynebacterium glutamicum, было эффективным с точки зрения повышения способности вырабатывать L-глутаминовую кислоту бактериями родов Corynebacterium или Brevibacterium (японская патентная публикация № 7-121228). Кроме того, в открытой японской патентной заявке № 61-268185 заявляется клетка, несущая рекомбинантную ДНК, включающую ген глутаматдегидрогеназы, происходящий от коринебактерии Corynebacterium. Далее, открытая японская патентная заявка №63-214189 заявляет способ повышения способности вырабатывать L-глутаминовую кислоту путем амплификации гена глутаматдегидрогеназы, гена изоцитратдегидрогеназы, гена аконитатгидратазы и гена цитратсинтазы.

Хотя уровень выработки L-глутаминовой кислоты в существенной степени повышается в результате воспроизводства упоминавшихся выше микроорганизмов или улучшения способов выработки, тем не менее разработка способов более эффективной выработки L-глутаминовой кислоты при низких затратах является необходимой с точки зрения дальнейшего повышения потребности в будущем.

Известен способ, в соответствии с которым ферментация осуществляется так, что кристаллизующаяся L-аминовая кислота накапливается в культуре (открытая японская патентная заявка № 62-288). В этом способе концентрация L-аминокислоты в культуре поддерживается на уровне, ниже некоторого значения путем осаждения накопленной в культуре L-аминокислоты. В частности, L-триптофан, L-тирозин или L-лейцин осаждают в ходе ферментационного процесса путем доведения температуры и рН культуры или путем добавления поверхностно-активного агента к культуральной среде.

При том, что способ ферментации, сопряженный с осаждением L-аминокислоты, известен, на что было указано выше, а аминокислотами, пригодными для ферментации таким способом, являются аминокислоты, характеризующиеся относительно низкой растворимостью в воде, в то время как не было известно примеров применения данного способа в отношении хорошо растворимых в воде аминокислот, таких как L-глутаминовая кислота. Кроме того, культуральная среда для осаждения L-глутаминовой кислоты должна характеризоваться низким значением рН. Однако вырабатывающие L-глутаминовую кислоту бактерии, такие как те бактерии, которые упоминались выше, не могут расти в кислых условиях, а следовательно, ферментация L-глутаминовой кислоты должна проводиться в нейтральных условиях (патенты США №№ 3220929 и 3032474; K.C.Chao & J.W.Foster, 1959, J.Bacteriol., 77, pp.715-725). Таким образом, выработка L-глутаминовой кислоты в ферментационном процессе в сопряжении с осаждением была неизвестна. Более того, известно, что рост большинства ацидофильных бактерий подавляется в присутствии органических кислот, таких как уксусная кислота, молочная кислота и янтарная кислота («Extreme Environment Microorganism Handbook», ed. Y.Oshima, Sci. Forum, p.231; R.M.Borichewski, 1967, J.Bacteriol., 93, pp.597-599; и др.). Таким образом, предполагается, что большое число микроорганизмов является чувствительным к L-глутаминовой кислоте, которая также является органической кислотой, в кислых условиях; при этом отсутствуют сообщения о попытках поиска микроорганизмов, проявляющих способность вырабатывать L-глутаминовую кислоту в кислых условиях.

Резюме изобретения

В описанной выше современной ситуации объектом настоящего изобретения явился поиск и воспроизводство микроорганизма, который бы вырабатывал L-глутаминовую кислоту в условиях низких значений рН, а также представление способа выработки L-глутаминовой кислоты с использованием полученного микроорганизма путем ферментации, сопровождающейся осаждением L-глутаминовой кислоты.

Заявители настоящего изобретения в ходе анализа улучшения выработки L-глутаминовой кислоты в ферментационном процессе предположили, что подавление выработки L-глутаминовой кислоты, накопленной в культуральной среде при высокой концентрации, являлось одним из факторов, не позволяющих достичь повышения уровня выработки. Например, у клеток имеется экскреционная (выделительная) система и система поглощения для L-глутаминовой кислоты. Однако, если L-глутаминовая кислота, однажды уже выделившаяся в результате экскреции в среду, снова поглощается этой клеткой, то это приводит не только к существенному снижению эффективности выработки, но также и к подавлению реакций биосинтеза L-глутаминовой кислоты. С целью исключения подавления выработки таким высококонцентрированным накоплением L-глутаминовой кислоты заявители настоящего изобретения протестировали микроорганизмы, которые могут размножаться в кислых условиях и в присутствии высокой концентрации L-глутаминовой кислоты. В результате удалось успешно выделить из почвы микроорганизмы, для которых характерны такие свойства, что тем самым позволило завершить настоящее изобретение.

Таким образом, в настоящем изобретении представляется следующее.

(1) Микроорганизм, который может метаболизировать источник углерода при конкретной величине рН в жидкой культуральной среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и данный источник углерода, и который обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем то ее количество, которое соответствует концентрации насыщения в жидкой среде при данном рН.

(2) Микроорганизм в соответствии с п.(1), который может расти в жидкой культуральной среде.

(3) Микроорганизм в соответствии с пп.(1) или (2), при том, что рН не превышает 5,0.

(4) Микроорганизм в соответствии с любым из пп.(1)-(3), обладающий по крайней мере одним из следующих признаков:

(a) микроорганизм проявляет повышенную активность фермента, катализирующего реакцию биосинтеза L-глутаминовой кислоты; и

(b) микроорганизм характеризуется уменьшенной или отсутствующей активностью фермента, катализирующего реакцию, отклоняющуюся от биосинтетического пути L-глутаминовой кислоты и обеспечивающего выработку иного, нежели L-глутаминовая кислота, соединения.

(5) Микроорганизм в соответствии с п.(4), при том, что фермент, который катализирует реакцию биосинтеза L-глутаминовой кислоты, является по крайней мере одним из группы, включающей цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу и глутаматдегидрогеназу.

(6) Микроорганизм в соответствии с пп.(4) или (5), при том, что ферментом, который катализирует реакцию, отклоняющуюся от биосинтетического пути L-глутаминовой кислоты и связанную с выработкой иного, нежели L-глутаминовой кислота, соединения, является α-кетоглутаратдегидрогеназа.

(7) Микроорганизм в соответствии с любым из пп.(1)-(6), при том, что этот микроорганизм относится к роду Enterobacter.

(8) Микроорганизм в соответствии с п.(7), являющийся видом Enterobacter agglomerans.

(9) Микроорганизм в соответствии с п.(8), несущий мутацию, которая обусловливает сниженную интенсивность внеклеточной секреции вязкого материала по сравнению со штаммом дикого типа в случае культивирования в среде, содержащей сахариды.

(10) Способ выработки L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации, который включает культивирование микроорганизма, определенного в любом из пп.(1)-(9), в жидкой культуральной среде, рН которой доведена до величины, при которой происходит осаждение L-глутаминовой кислоты, с целью выработки и накопления L-глутаминовой кислоты и осаждения L-глутаминовой кислоты в культуральной среде.

(11) Способ скрининга микроорганизма, пригодного для выработки L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации, сопряженной с осаждением L-глутаминовой кислоты в жидкой культуральной среде, который включает внесение содержащего микроорганизмы образца в кислую среду, содержащую L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и источник углерода, и отбор штамма, который способен метаболизировать этот источник углерода.

(12) Способ в соответствии с п.(11), при том, что штамм, способный расти в данной культуральной среде, выбирается как штамм, который способен метаболизировать данный источник углерода.

(13) Способ в соответствии с пп.(11) или (12), при том, что рН среды не превышает 5,0.

В соответствии со способом по настоящему изобретению L-глутаминовая кислота может быть выработана с помощью ферментации, сопряженной с осаждением L-глутаминовой кислоты. В результате концентрация L-глутаминовой кислоты в среде поддерживается ниже определенной, и L-глутаминовая кислота может вырабатываться, не будучи подверженной ингибированию высокой концентрацией L-глутаминовой кислоты.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана рестрикционная карта фрагмента ДНК, производного от плазмиды pTWVEK101 Enterobacter agglomerans.

На фигуре 2 отображено сравнение аминокислотной последовательности, выведенной из нуклеотидной последовательности гена sucA энтеробактерии Enterobacter agglomerans и такого же гена кишечной палочки Escherichia coli. Верхняя последовательность - Enterobacter agglomerans; нижняя последовательность - Escherichia coli (такое взаиморасположение принято здесь и далее).

На фигуре 3 отображено сравнение аминокислотной последовательности, выведенной из нуклеотидной последовательности гена sucB Enterobacter agglomerans и такого же гена Escherichia coli.

На фигуре 4 отображено сравнение аминокислотной последовательности, выведенной из нуклеотидной последовательности гена sdhB Enterobacter agglomerans и такого же гена Escherichia coli.

На фигуре 5 отображено сравнение аминокислотной последовательности, выведенной из нуклеотидной последовательности гена sucC Enterobacter agglomerans и такого же гена Escherichia coli.

На фигуре 6 показана конструкция плазмиды pMWCPG, включающей ген gltA, ген ррс и ген gdhA.

На фигуре 7 показана конструкция плазмиды RSF-Tet, включающей сайт начала репликации, производный от плазмиды RSF1010, характеризующейся сродством к широкому кругу хозяев, и ген резистентности к тетрациклину.

На фигуре 8 изображена конструкция плазмиды RSFCPG, включающей сайт начала репликации, производный от плазмиды RSF1010, характеризующейся сродством к широкому кругу хозяев, ген резистентности к тетрациклину, ген gltA, ген ррс и ген gdhA.

На фигуре 9 показана конструкция плазмиды pSTVCB, включающей ген gltA.

Подробное описание изобретения

Здесь и далее настоящее изобретение будет описано подробно.

Микроорганизмом по настоящему изобретению является микроорганизм, который: (1) способен метаболизировать источник углерода при конкретной величине рН в жидкой культуральной среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и данный источник углерода, и (2) обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем то количество, которое соответствует концентрации насыщения в данной культуральной среде при данном значении рН.

Термин «концентрация насыщения» обозначает концентрацию L-глутаминовой кислоты, растворенной в жидкой культуральной среде, при которой эта жидкая среда оказывается насыщенной по L-глутаминовой кислоте.

Здесь и далее будет описан способ скрининга микроорганизма, который способен метаболизировать источник углерода в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и данный источник углерода при конкретной величине рН. Содержащий микроорганизмы образец вносят в жидкую культуральную среду, содержащую L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и источник углерода, при конкретной величине рН: отбирают штамм, который способен метаболизировать этот источник углерода. Конкретное значение рН в принципе не ограничено, но обычно не должно превышать примерно 5,0, предпочтительно не должно превышать примерно 4,5 и более предпочтительно не должно превышать примерно 4,3. Микроорганизм по настоящему изобретению используется для выработки L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации, сопряженной с осаждением L-глутаминовой кислоты. Если значение рН слишком высоко, то затруднительным становится обеспечить выработку микроорганизмом достаточного для осаждения количества L-глутаминовой кислоты. Следовательно, значение рН предпочтительно находится в указанном выше диапазоне.

Если величина рН водного раствора, содержащего L-глутаминовую кислоту, снижается, то растворимость L-глутаминовой кислоты в значительной степени уменьшается до величины, примерно равной рКа γ-карбоксильной группы (4,25 при 25°С). Растворимость становится наименьшей при достижении изоэлектрической точки (рН=3,2) - и L-глутаминовая кислота сверх количества, определяющего концентрацию насыщения, осаждается из раствора. С учетом зависимости от состава культуральной среды L-глутаминовую кислоту обычно растворяют в количестве 10-20 г/л при рН=3,2, 30-40 г/л при рН=4/0 и 50-60 г/л при рН=4,7 (при примерно 30°С). Обычно нет необходимости доводить рН до величин меньше 3,0, потому что эффект осаждения L-глутаминовой кислоты достигает плато-фазы при рН, меньшем некоторого значения. Однако величина рН может быть и меньше 3,0.

Кроме того, выражение «микроорганизм способен метаболизировать источник углерода» означает, что он способен размножаться или утилизировать источник углерода даже без способности к размножению: следовательно, это определяет то, что он катаболизирует источники углерода, такие как сахариды или органические кислоты. Более конкретно, например, если микроорганизм размножается в случае его культивирования в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения, при рН=4,0-5,0, предпочтительно при рН=4,0-4,5, более предпочтительно при рН=4,0-4,3, а наиболее предпочтительно рН=4,0, при подходящей температуре, например при 28°С, 37°С или 50°С, в течение 2-4 дней, то этот микроорганизм способен метаболизировать источник углерода в среде. Далее, например, даже если микроорганизм не размножается в случае его культивирования в жидкой культуральной среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения, при рН=4,0-5,0, предпочтительно при рН=4,0-4,5, более предпочтительно при рН=4,0-4,3, а наиболее предпочтительно рН=4,0, при подходящей температуре, например при 28°С, 37°С или 50°С, в течение 2-4 дней, то этот микроорганизм, который утилизирует данный источник углерода в среде, является тем микроорганизмом, который способен метаболизировать источник углерода в среде.

Микроорганизм, который способен метаболизировать источник углерода, включает микроорганизмы, которые способны расти в жидкой культуральной среде.

Выражение микроорганизм «способен расти» означает то, что он способен размножаться или способен вырабатывать L-глутаминовую кислоту даже при отсутствии способности к размножению. Более конкретно, например, если микроорганизм размножается в случае его культивирования в жидкой культуральной среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения, при рН=4,0-5,0, предпочтительно при рН=4,0-4,5, более предпочтительно при рН=4,0-4,3, а наиболее предпочтительно рН=4,0, при подходящей температуре, например при 28°С, 37°С или 50°С, в течение 2-4 дней, то этот микроорганизм способен расти в данной культуральной среде. Далее, например, даже если микроорганизм не размножается в случае его культивирования в жидкой синтетической среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения, при рН=4,0-5,0, предпочтительно при рН=4,0-4,5, более предпочтительно при рН=4,0-4,3, а наиболее предпочтительно рН=4,0, при подходящей температуре, например при 28°С, 37°С или 50°С, в течение 2-4 дней, то этот микроорганизм, который обеспечивает повышение количества L-глутаминовой кислоты в культуральной среде, является тем микроорганизмом, который способен расти в данной культуральной среде.

Описанный выше отбор может быть повторен дважды или большее число раз при тех же самых условиях или при измененяющейся величине рН или концентрации L-глутаминовой кислоты. Исходный отбор может быть осуществлен в среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации, меньшей концентрации насыщения, а после этого последующий отбор может быть проведен в среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения. Далее могут быть отобраны штаммы, обладающие предпочтительными характеристиками, такими как лучшие параметры размножения.

В дополнение к свойству, описанному выше, микроорганизм по настоящему изобретению характеризуется способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем то количество, которое соответствует концентрации насыщения L-глутаминовой кислоты в жидкой культуральной среде. Величина рН упомянутой выше жидкой культуральной среды предпочтительно такова же или близка к таковой у культуральной среды, использовавшейся для скрининга микроорганизма, обладающего описанным выше свойством (1). Обычно микроорганизм становится чувствительным к высокой концентрации L-глутаминовой кислоты тогда, когда величина рН снижается. Следовательно, предпочтительным является, чтобы рН не была слишком низкой с точки зрения резистентности к L-глутаминовой кислоте, но при этом низкое значение рН предпочтительно с точки зрения выработки L-глутаминовой кислоты, сопряженной с ее осаждением. Для удовлетворения таким условиям величина рН может находиться в диапазоне 3-5, предпочтительно в диапазоне 4-5, более предпочтительно в диапазоне 4,0-4,7, еще более предпочтительно в диапазоне 4,0-4,5 и конкретно предпочтительно в диапазоне 4,0-4,3.

В качестве микроорганизма по настоящему изобретению или его воспроизводительного материала можно упомянуть, например, микроорганизмы, относящиеся к родам Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Bacillus, Saccharomyces и подобное. Среди них предпочтительными являются микроорганизмы, относящиеся к роду Enterobacter. Здесь и далее описание микроорганизмов по настоящему изобретению в основном будет относиться к микроорганизмам рода Enterobacter, хотя настоящее изобретение может быть применено к микроорганизму, относящемуся к другим родам, т.е. не ограничивается родом Enterobacter.

В качестве микроорганизма, относящегося к роду Enterobacter, можно, в частности, упомянуть вид Enterobacter agglomerans, предпочтительно Enterobacter agglomerans штамма AJ13355. Этот штамм был выделен из пробы почвы из Иваты (провинция Шицуока, Япония) в качестве штамма, который способен размножаться в культуральной среде, содержащей L-глутаминовую кислоту и источник углерода при низких значениях рН.

Физиологические характеристики штамма AJ13355 таковы:

(1) грамотрицательная бактерия;

(2) отношение к кислороду - факультативный анаэроб;

(3) позитивна по каталазе;

(4) негативна по оксидазе;

(5) способностью восстанавливать нитраты не обладает;

(6) тест Фогса-Проскауера: +;

(7) тест с метиловым красным: -;

(8) негативна по уреазе;

(9) выработка индола: +;

(10) обладает подвижностью;

(11) слабая активность по выработке сероводорода в среде TSI;

(12) позитивна по β-галактозидазе;

(13) свойства по ассимиляции сахаридов:

арабиноза - +;

сахароза - +;

лактоза - +;

ксилоза - +;

сорбитол - +;

инозитол - +;

трегалоза - +;

мальтоза - +;

глюкоза - +;

адонитол - -;

раффиноза - +;

салицин - -;

мелибиоза - +;

(14) ассимиляция глицерина - +;

(15) свойства по ассимиляции органических кислот:

лимонная кислота - +;

тартаровая кислота - -;

глюконовая кислота - +;

уксусная кислота - +;

малоновая кислота - -;

(16) негативна по аргининдегидратазе;

(17) негативна по орнитиндекарбоксилазе;

(18) негативна по лизиндекарбоксилазе;

(19) негативна по фенилаланиндеаминазе;

(20) образуемый пигмент - желтый;

(21) имеется способность разжижать желатин;

(22) диапазон рН для роста: может расти при рН=4, хорошо растет при рН=4,5-7;

(23) температура для роста: хорошо растет при 25°С, хорошо растет при 30°С, хорошо растет при 37°С, возможен рост при 42°С, рост при 45°С невозможен.

Основываясь на этих бактериологических параметрах, исследованный штамм АJ13355 был идентифицирован по принадлежности к виду Enterobacter agglomerans.

Штамм AJ13355 Enterobacter agglomerans был внесен в коллекцию Национального института биологии и биотехнологии человека Агентства по науке и технологии в промышленности Министерства международной торговли и промышленности Японии (по адресу 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan) 19 февраля 1998 года с получением депозитарного №FERM Р-16644. Затем на основании Будапештского соглашения он был внесен в международный депозитарий 11 января 1999 года с получением депозитарного №FERM BP-6614.

Микроорганизм по настоящему изобретению может являться микроорганизмом, исходно обладающим способностью вырабатывать L-глутаминовую кислоту, или микроорганизмом, у которого способность вырабатывать L-глутаминовую кислоту придана или усилена с помощью внесения мутаций, с применением методов рекомбинантной ДНК или подобного.

Способность вырабатывать L-глутаминовую кислоту может быть придана или усилена, например, путем повышения активности фермента, который катализирует реакцию в биосинтезе L-глутаминовой кислоты. Способность вырабатывать L-глутаминовую кислоту также может быть усилена путем снижения активности фермента, который катализирует реакцию, отклоняющуюся от биосинтетического пути L-глутаминовой кислоты и приводящую к образованию иного, нежели L-глутаминовая кислота, соединения, или путем нарушения такой активности.

В качестве ферментов, катализирующих реакцию в биосинтезе L-глутаминовой кислоты, могут быть упомянуты глутаматдегидрогеназа (здесь и далее обозначаемая как GDH), глутаминсинтетаза, глутаматсинтаза, изоцитратдегидрогеназа, аконитатгидратаза, цитратсинтаза (здесь и далее обозначаемая как CS), фосфоенолпируваткарбоксилаза (здесь и далее обозначаемая как РЕРС), пируватдегидрогеназа, пируваткиназа, енолаза, фосфоглицеромутаза, фосфоглицераткиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, фруктозобифосфатальдолаза, фосфофруктокиназа, глюкозофосфатизомераза и т.д. Среди этих ферментов предпочтительными являются один или два фермента из CS, РЕРС, GDH, или все три этих фермента. Далее, предпочтительным является, чтобы активность всех этих трех ферментов (CS, РЕРС и GDH) повышалась у микроорганизма по настоящему изобретению. В частности, предпочтительным является фермент CS Brevibacterium lactofermentum, поскольку он не подвержен ингибированию α-кетоглутаровой кислотой, L-глутаминовой кислотой и НАД.

С целью усиления активности ферментов CS, РЕРС или GDH, например ген, кодирующий CS, РЕРС или GDH, может быть клонирован в состав подходящей плазмиды, а микроорганизм-хозяин может быть трансформирован с использованием полученной плазмиды. В результате число копий гена, кодирующего фермент CS, РЕРС или GDH (здесь и далее эти гены обозначаются как «ген gltA», «ген ррс» и «ген gdhA» соответственно), в трансформированном штамме клеток увеличивается, что обусловливает повышение активности ферментов CS, РЕРС или GDH.

Клонированные ген gltA, ген ррс и ген gdhA вносят в упомянутый выше исходный родительский штамм по отдельности или в случайном сочетании двух из них, или все три вместе. Когда вносят два или три типа генов, то эти два или три типа генов могут быть клонированы в одну и ту же плазмиду и внесены в организм-хозяин, или же они могут быть клонированы по отдельности в два или три типа плазмид, которые могут сосуществовать и быть внесенными в данный организм-хозяин.

Могут быть внесены в один и тот же организм-хозяин два или большее число генов, кодирующих ферменты одного типа, но происходящие от различных видов микроорганизмов.

Тип упоминавшихся выше плазмид, в принципе, ни чем не ограничивается, помимо того, что они должны автономно реплицироваться в клетках микроорганизма, относящегося, например, к роду Enterobacter или подобному: при этом можно, например, упомянуть плазмиды pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pACYC177, pACYC184 и т.д. Помимо этого также могут быть использованы векторы, основанные на фаговой ДНК.

Трансформация может быть осуществлена, например, с помощью метода Моррисона (D.M.Morrison, 1979, Meth. Enzymol., 68, 326), метода, в котором проницаемость ДНК повышается путем обработки клеток бактерий-реципиентов хлоридом кальция (M.Mandel & A.Higa, 1970, J. Mol. Biol., 53, 159), с помощью электропорации (J.H.Miller, 1992, «A Short Course in Bacterial Genetics», Cold Spring Harbor Lab. Press, США.) и подобного.

Активность ферментов CS, РЕРС или GDH также может быть повышена за счет интеграции множественных копий гена gltA, гена ррс или гена gdhA в хромосомную ДНК упоминавшегося выше исходного родительского штамма, взятого в качестве организма-хозяина. С целью внесения множественных копий гена gltA, гена ррс или гена gdhA в хромосомную ДНК микроорганизма, относящегося к роду Enterobacter или подобного, может быть использована нуклеотидная последовательность, которая в большом числе копий присутствует в хромосомной ДНК, такая как повторяющаяся ДНК или инвертированные повторы, имеющиеся на концах транспозонов. С другой стороны, множественные копии гена могут быть внесены в хромосомную ДНК путем переноса транспозона, включающего ген gltA, ген ррс или ген gdhA. В результате число копий гена gltA, гена ррс или гена gdhA в трансформированном клеточном штамме будет увеличено, а следовательно, повысится и активность ферментов CS, РЕРС или GDH.

В качестве организмов-источников гена gltA, гена ррс или гена gdhA, число копий которых предполагается увеличить, может быть использован любой организм, лишь бы он обладал активностями ферментов CS, РЕРС или GDH. Помимо прочего предпочтительными являются бактерии, являющиеся прокариотическими организмами, например те, которые относятся к родам Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium и Bacillus. В качестве конкретных примеров могут быть упомянуты Escherichia coli, Brevibacterium lactofermentum и т.д. Ген gltA, ген ррс или ген gdhA могут быть получены из состава хромосомной ДНК описанных выше микроорганизмов.

Ген gltA, ген ррс или ген gdhA могут быть получены с использованием мутантного штамма, являющегося дефицитным по активности ферментов CS, РЕРС или GDH, с целью выделения фрагмента ДНК, который комплементирует ауксотрофность, обусловливаемую хромосомной ДНК упоминавшихся выше микроорганизмов. С учетом того, что нуклеотидные последовательности этих генов у кишечной палочки Escherichia и коринебактерии Corynebacterium ранее были уже определены (Biochemistry, 22, pp.5243-5249, 1983; J.Biochem., 95, pp.909-916, 1984; Gene, 27, pp.193-199, 1984, Microbiology, 140, pp.1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet., 218, pp.330-339, 1989; Mol. Microbiol., 6, pp.317-326, 1992), они также могут быть получены с применением ПЦР с использованием затравок, основанных на каждой из таких нуклеотидных последовательностей, и с использованием хромосомной ДНК в качестве матрицы.

Активность ферментов CS, РЕРС или GDH также может быть увеличена путем усиления экспрессии гена gltA, гена ррс или гена gdhA кроме упомянутой выше амплификации.

Например, экспрессия может быть усилена путем замены промотора гена gltA, гена ррс или гена gdhA на другие, более сильные промоторы. Например, в качестве сильных промоторов известны промотор lac, промотор trp, промотор tac, промоторы P_R и P_L λ-фага и другие сильные промотры. Ген gltA, ген ррс или ген gdhA, в составе которых заменяют промотор, клонируют в состав плазмиды и вносят в микроорганизм-хозяин или интегрируют в состав хромосомной ДНК микроорганизма-хозяина с помощью повторяющейся ДНК, инвертированных повторов, транспозона или подобного.

Активность ферментов CS, РЕРС или GDH также может быть усилена путем замены промотора в составе гена gltA, гена ррс или гена gdhA, находящихся в составе хромосомы, на более сильные промоторы (см. международную патентную заявку WO 87/03006 и открытую японскую патентную заявку №61-268183) или встраивания сильного промотора выше кодирующей последовательности каждого из этих генов (см. Gene, 29, pp.231-241, 1984). В частности, гомологичная рекомбинация может быть осуществлена между ДНК, включающей ген gltA, ген ррс или ген gdhA, в составе которых проведена замена на более сильный промотор или его фрагмент, и соответствующим геном в составе хромосомы.

Примерами ферментов, катализирующих реакцию, отклоняющуюся от биосинтетического пути L-глутаминовой кислоты и приводящую к образованию иного, нежели L-глутаминовая кислота, соединения, являются α-кетоглутаратдегидрогеназа (здесь и далее обозначается как α-KGDH), изоцитратлиаза, фосфатацетилтрансфераза, ацетаткиназа, синтаза ацетогидрооксокислот, ацетолактатсинтаза, форматацетилтрансфераза, лактатдегидрогеназа, глутаматдекарбоксилаза, 1-пирролиндегидрогеназа и т.д. Среди этих ферментов предпочтительным является α-KGDH.

С целью достижения снижения или нарушения активности упомянутого выше фермента у микроорганизма, относящегося к роду Enterobacter или подобного, мутация, обусловливающая снижение или блокировку внутриклеточной активности такого фермента, может быть внесена в последовательность гена, кодирующего упомянутый выше фермент с применением стандартного метода мутагенеза или генетической инженерии.

Примеры методов мутагенеза включают, например, методы, основанные на использовании рентгеновского или ультрафиолетового облучения, методы, связанные с обработкой мутагенным агентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином, и т.д. Сайт, по которому происходит возникновение мутации в данном гене, может приходиться на кодирующий сегмент, детерминирующий этот фермент, или на сегмент, регулирующий его экспрессию, такой, каковым является промотор.

Примеры методов генетической инженерии включают, например, методы, основанные на генной рекомбинации, трансдукции, слияния клеток и т.д. Например, ген резистентности к химическому соединению встраивают в состав клонированного гена-мишени с целью конструирования гена, который утрачивает свои исходные функции (дефектный ген). После этого такой дефектный ген вносят в клетку микроорганизма-хозяина, в результате чего ген-мишень из состава генома заменяется на упомянутый выше дефектный ген в результате прохождения гомологичной рекомбинации (этап «разрушения гена»).

Снижение или нарушение внутриклеточной активности фермента-мишени и степень снижения такой активности может быть определена путем измерения уровня активности этого фермента в клеточном экстракте или в его очищенной фракции, выделенных из анализируемого штамма с последующим сравнением со штаммом дикого типа. Например, активность фермента α-KGDH может быть измерена с применением метода Рида с соавт. (L.J.Reed & В.B.Mukherjee, 1969, Meth. Enzymol., 13, pp.55-61).

В зависимости от фермента-мишени являющийся мишенью мутантный штамм может быть выбран, исходя из фенотипа такого мутантного штамма. Например, мутантный штамм, дефицитный по активности α-KGDH или характеризующийся сниженной активностью α-KGDH, не может размножаться или характеризуется существенно сниженным пролиферационным индексом в минимальной среде, содержащей глюкозу, или в минимальной среде, содержащей уксусную кислоту или L-глутаминовую кислоту в качестве единственного источника углерода, в аэробных условиях. Однако нормальное размножение становится возможным даже в таких же условиях после добавления янтарной кислоты или лизина, метионина и диаминопимеловой кислоты к минимальной среде, содержащей глюкозу. С использованием этого эффекта в качестве индикаторного могут быть отобраны мутантные штаммы, характеризующиеся сниженной активностью α-KGDH или дефицитные по такой активности.

Способ получения дефицитного по α-KGDH штамма Brevibacterium lactofermentum с применением гомологичной рекомбинации подробно описан в международной патентной заявке WO 95/34672. Сходные способы могут быть применены в отношении и других микроорганизмов.

Далее, такие методы, как клонирование генов и расщепление и лигирование ДНК, трансформация и т.д. подробно описаны в руководстве «Molecular Cloning», 2d ed., Cold Spring Harbor Press (1989) и других.

В качестве конкретного примера мутантного штамма, дефицитного по активности фермента α-KGDH или характеризующегося сниженной активностью α-KGDH, полученного в соответствии с описанным выше, можно упомянуть штамм AJ13356 Enterobacter agglomerans. Штамм AJ13356 Enterobacter agglomerans был внесен в коллекцию Национального института биологии и биотехнологии человека Агентства по науке и технологии в промышленности Министерства международной торговли и промышленности Японии (по адресу 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan) 19 февраля 1998 года с получением депозитарного № FERM Р-16645. Затем на основании Будапештского соглашения он был внесен в международный депозитарий 11 января 1999 года с получением депозитарного №FERM BP-6615. Штамм AJ13356 Enterobacter agglomerans дефицитен по активности фермента α-KGDH в результате разрушения гена, кодирующего Е1-субъединицу α-KGDH (ген sucA).

Когда Enterobacter agglomerans, как пример микроорганизма по настоящему изобретению, культивируют в среде, содержащей сахариды, то при этом во внеклеточное пространство секретируется вязкий материал, в результате чего снижается производственная эффективность. Следовательно, при использовании Enterobacter agglomerans, обладающей таким свойством секретировать вязкий материал, предпочтительным является использование такого мутантного штамма, который бы секретировал меньшее количество вязкого материала по сравнению со штаммом дикого типа. Примеры методов мутагенеза включают, например, методы, основанные на использовании рентгеновского или ультрафиолетового облучения, методы, связанные с обработкой мутагенным агентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином, и т.д. Мутантный штамм, обладающий сниженным уровнем секреции вязкого материала, может быть отобран путем инокуляции мутировавших бактериальных клеток в среде, содержащей сахариды, например, на пластине среды LB, содержащей 5 г/л глюкозы, с культивированием его при наклоне культуральной пластины на 45 градусов, отбирая колонию, которая не смывается с пластины жидкостью.

В настоящем изобретении способствование или усиление способности к выработке L-глутаминовой кислоты и придания других важных свойств, таких как мутирование в сторону секреции менее вязкого материала, описанного выше, могут быть осуществлены в произвольном порядке.

Путем культивирования микроорганизма по настоящему изобретению в жидкой культуральной среде, величина рН которой доведена до значения, при котором L-глутаминовая кислота осаждается, L-глутаминовая кислота может быть выработана и накоплена с осаждением в культуральной среде. L-глутаминовая кислота также может быть осаждена путем постановки данной культуры при нейтральном рН и затем продолжения и завершения культивирования при рН, при котором L-глутаминовая кислота осаждается.

Величина рН, при которой L-глутаминовая кислота осаждается, означает ту величину, при которой L-глутаминовая кислота осаждается тогда, когда микроорганизм вырабатывает и накапливает L-глутаминовую кислоту.

В качестве упоминавшейся выше культуральной среды обычная питательная среда, содержащая источник углерода, исто