Способ секреторной продукции белка

Способ секреторной продукции белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к способу эффективного получения гетерологичного белка секреторной продукции.

Ранее сообщалось о ряде способов секреторной продукции гетерологичных белков, таких как описаны в обзоре по секреторной продукции гетерологичного белка бактерий, относящихся к роду Bacillus [Microbial. Rev., 57, 109-137 (1993)], в обзоре по секреторной продукции гетерологичного белка метилотрофными дрожжами Pichia pastoris [Biotechnol., 11, 905-910 (1993)] и в сообщении о промышленном получении гетерологичных белков с использованием плесени, относящейся к роду Aspergillus [Biotechnol., 6, 1419-1422 (1988); Biotechnol., 9, 976-981 (1991)].

Трансглютаминаза, получаемая секреторной продукцией по одному воплощению настоящего изобретения, представляет собой фермент, который катализирует реакцию переноса ацила γ-карбоксиламидных групп в пептидной цепи белка. Когда фермент взаимодействует с белком, то может иметь место образование поперечной связи ε-(γ-Glu)-Lys и замещение Gln на Glu в результате дезамидирования. Трансглютаминазу применяют для производства желированных пищевых продуктов, таких как желе, йогурт, сыр, и желированных косметических средств и других, а также для улучшения качества мяса и тому подобное (публикация прошедшей экспертизу заявки на выдачу патента Японии №1-50382). Более того, трансглютаминаза представляет собой фермент, имеющий высокую промышленную применимость в отношении использования для производства веществ для термостабильных микрокапсул, носителей для иммобилизованных ферментов и т.п.

Ранее были известны трансглютаминазы, полученные из животных и из микроорганизмов (микробная трансглютаминаза: в последующем относится к «MTG»). Первая представляет собой зависимый от ионов кальция фермент, который имеется в органах, коже, крови животных и т.п. Примеры включают печеночную трансглютаминазу морской свинки (K.Ikura et al., Biochemistry 27, 2898 (1988)), эпидермальную кератиноцитарную трансглютаминазу человека (M.A.Phillips et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333 (1990)), фактора свертывания крови XIII человека (A.Ichinose et al., Biochemistry 25, 6900 (1990)) и другие.

К настоящему времени обнаружены независимые от ионов кальция трансглютаминазы, происходящие из бактерий, относящихся к роду Streptoverticillium, которые включают, например, Streptoverticillium gliseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum подвид cinnamoneum (в последующем в сокращенном виде они могут быть обозначены как S. cinnamoneum) IFO 12852, Streptoverticillium mobaraense (в последующем сокращенном виде они могут быть обозначены, как S. mobaraense) IFO13819 и другие (публикация не прошедшей экспертизу заявки на выдачу патента Японии (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №64-27471)). В результате картирования пептидов и структурного анализа генов было установлено, что первичная структура трансглютаминазы, продуцируемой данными микроорганизмами, не имеет гомологии с трансглютаминазами от животных (публикация заявки на Европейский патент №0481504 А1).

Поскольку происходящие из микроорганизмов трансглютаминазы (MTG) получают выделением из культур микроорганизмов, таких как описаны выше, возникают проблемы в плане количества и эффективности и тому подобное. Предпринималась попытка получения трансглютаминазы с использованием генно-инженерных способов. Сообщалось о белках и генах трансглютаминаз, например в Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994), Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 88-92 (1994), Biochimie, 80, 313-319 (1998), Eur. J. Biochem., 257, 570-576 (1998), WO 96/06931, WO 96/22366 и т.д., в этих источниках приводятся данные об экспрессии и продукции трансглютаминазы в системах хозяин-вектор, таких как Streptomyces lividans, Aspergillus oryzae и Escherichia coli. В дополнение к этой информации сообщалось о способе, в котором трансглютаминазу получают секреторной продукцией в микроорганизмах, таких как E.coli и дрожжи (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №5-199883), и о способе, в котором активную MTG получают экспрессией MTG в виде неактивного слитого белка в виде включения в E.coli, последующей солюбилизацией включения с использованием денатурирующих белок агентов и затем его восстановлением посредством удаления денатурирующих агентов (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-30771). Однако при этом отмечалась проблема, заключающаяся в том, что уровень экспрессии был очень низким при секреторной продукции такими микроорганизмами, как E.coli или дрожжи.

С другой стороны, имеются предшествующие примеры эффективной секреторной продукции гетерологичных белков с использованием коринеформных бактерий, включая секрецию нуклеаз и липаз (патент США №4965197, J. Bacteriol., 174, 1854-1861 (1992)] и секрецию протеаз, таких как субтилизин [Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)], с использованием Corynebacterium glutamicum (в последующем в сокращенном виде они могут быть обозначены, как С. glutamicum), секрецию белков клеточной поверхности коринеформных бактерий [заявка на международный патент, опубликованная в патенте Японии №6-502548], секрецию связывающегося с фибронектином белка с использованием данного исследования [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], также имеется сообщение, в котором секрецию белков усиливали с использованием мутантного секреторного аппарата [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №11-169182] и т.д., но в целом имеется ограниченное число сообщений по ограниченным белкам. Что касается накапливающегося количества белка в Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995) описывается, что накапливалось примерно 2,5 мг/мл белка при экспрессии гена щелочной протеазы из Dichelobacter nodosus в С. glutamicum с использованием промотора гена субтилизина (аргЕ) из Bacillus subtilis, связывающегося с рибосомами сайта и последовательности сигнального пептида, но в патенте США №4965197, не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №6-502548 и не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №11-169182 конкретно не описываются значения количества секретируемых и накапливающихся белков. Более того, в случае связывающегося с фибронектином белка [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], секреторное накопление белка составило примерно 2,5 мкг/л. Таким образом, отсутствуют сообщения о том, что гетерологичные белки могут эффективно накапливаться в среде в концентрации, имеющей практическое значение.

Кроме того, технология генной инженерии для коринеформных бактерий была разработана в системе с использованием плазмиды и фага, такой как проведение трансформации протопластом [J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984); J. Bacteriol., 161, 463-467 (1985)], разработка различных типов векторов [Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984); J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984); J. Gen. Microbiol., 130, 2237-2246 (1984); Gene, 47, 301-306 (1986); Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 65-69 (1989)], разработка способа регуляции экспрессии генов [Bio/Technology, 6, 428-430 (1988)] и разработка космиды [Gene, 39, 281-286 (1985)]. Кроме того, имеются сообщения по клонированию генов, полученных из коринеформных бактерий [Nucleic Acids Res., 14, 10113-1011 (1986); J. Bacteriol., 167, 695-702 (1986); Nucleic Acids Res., 15, 10598 (1987); Nucleic Acids Res., 15, 3922 (1987); Nucleic Acids Res., 16, 9859 (1988); Agric. Biol. Chem., 52, 525-531 (1988); Mol. Microbiol., 2, 63-72 (1988); Mol. Gen. Genet., 218, 330-339 (1989); Gene, 77, 237-251 (1989)].

Позднее также сообщалось о мобильном генетическом элементе, полученном из коринеформных бактерий [WO 93/18151; Европейский патент 0445385; не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-46867; Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994); Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994); Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); FEMS Microbiol. Lett., 126, 1-6 (1995); не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №7-107976].

Мобильный генетический элемент представляет собой фрагмент ДНК, который можно переносить в хромосому и который, как известно, имеется у широкого ряда микроорганизмов от прокариотов до эукариотов. Были разработаны транспозоны с использованием мобильных генетических элементов [WO 93/18151; не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №7-107976; Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №9-70291], и стало возможным экспрессировать гетерологичный ген с использованием транспозона.

Краткое описание изобретения

Объектом изобретения является способ получения гетерологичного белка при получении коринеформной бактерии, продуцирующей промышленно применимый гетерологичный белок, например трансглютаминазу, и эффективно секретирующей продукт из клетки (т.е. секреторной продукцией).

Авторы настоящего изобретения обнаружили мутанта, который обладает очень высокой продуцирующей способностью при получении гетерологичных белков, с использованием коринеформной бактерии по сравнению с диким типом Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, результатом чего явилось настоящее изобретение.

Следовательно, настоящее изобретение относится к способу получения гетерологичных белков, отличающемуся тем, что слитый белок продуцируется и секретируется (секреторная продукция) мутантной коринеформной бактерией, которая обладает, по меньшей мере, в 2 раза более высокой способностью секретировать гетерологичный белок, который связан в прямом направлении с сигнальным пептидом из коринеформной бактерии, по сравнению с Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 дикого типа.

Конкретнее, изобретение относится к способу получения большого количества желаемого гетерологичного белка, например трансглютаминазы, введением генетической экспрессирующей конструкции в коринеформную бактерию, культивированием трансформированной таким образом коринеформной бактерии, эффективным внеклеточным секретированием полученного белка и выделением секретированного белка, в котором генная экспрессирующая конструкция включает последовательность гена, кодирующего желаемый белок, которая лигирована в прямом направлении с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, полученный из коринеформной бактерии, особенно сигнальный пептид клеточного поверхностного белка.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «секреция» белка или пептида относится к транспорту молекулы белка или пептида из бактериальной клетки (внеклеточный транспорт), включая случай, когда молекула белка или пептида в конечном итоге находится в полностью свободной форме в среде, а также случай, когда только часть молекулы белка или пептида находится вне клетки, и случай, когда они расположены на поверхности клетки.

Описание предпочтительных воплощений

В способе по изобретению коринеформную бактерию используют в качестве векторной системы-хозяина и можно получить большое количество внеклеточно секретируемого интересующего белка получением экспрессирующей конструкции, в которой ген, кодирующий интересующий белок, лигирован в прямом направлении с сигнальным пептидом клеточного поверхностного белка из коринеформной бактерии, введением конструкции в коринеформную бактерию и ее экспрессией.

Белки, которые можно получить секреторной продукцией способом по настоящему изобретению включают ферменты, физиологически активные белки и пептиды, которые являются промышленно применимыми. Трансглютаминазу, которую получают секреторной продукцией в одном воплощении настоящего изобретения, широко используют при обработке продуктов питания, производстве фармацевтических препаратов и тому подобное.

Известно, что секреторный белок, как правило, транслируется в виде препептида или препропептида и затем превращается в зрелый белок. То есть, как правило, он транслируется в виде препептида или препропептида, затем сигнальный пептид (преобласть) отщепляется, и таким образом он превращается в зрелый пептид или пропептид дальнейшим отщеплением прообласти под действием протеазы. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «сигнальная последовательность» относится к последовательности, которая расположена в N-конце предшественника секретируемого белка и которая отсутствует в нативном зрелом белке, а «сигнальный пептид» относится к пептиду, который отщепляется от такого предшественника белка. Как правило, сигнальная последовательность отщепляется одновременно с секрецией из клетки под действием протеазы (обычно относится к сигнальной пептидазе). Несмотря на то, что для сигнального пептида характерны некоторые общие свойства последовательности среди организмов разных видов, сигнальный пептид, который обладает секреторной функцией у одного вида, необязательно обладает такой же секреторной функцией у другого вида.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется, белок, который включает как сигнальный пептид, так и прообласть, т.е. первичный продукт трансляции называют «препробелком», и белок, который не включает сигнальный пептид, но включает прообласть, называют «пробелком». Прообласть пробелка называют «проструктурной областью» или «проструктурой». Термин «проструктурная область/проструктура» белка можно использовать здесь взаимозаменяемо с термином «прообласть» белка. Сигнальный пептид в препробелке или пребелке можно получить из другого белка или он может быть сигнальным пептидом, естественно присутствующим в желаемом белке и предпочтительно полученным из подлежащего применению секреторного белка хозяина. Альтернативно его можно модифицировать с включением оптимального кодона в зависимости от характера использования кодонов, применяемых хозяином.

Более того, сигнальный пептид, который можно использовать для целей изобретения, может включать часть N-концевой аминокислотной последовательности нативного зрелого белка, из которого получен сигнальный пептид. В частности, препробелок можно назвать «гетерологично слитым препробелком», когда сигнальный пептид получен из другого белка. Например, когда белок представляет собой трансглютаминазу, то он соответственно называется «препротрансглютаминазой», «протрансглютаминазой» и «гетерологино слитой препротрансглютаминазой». Белком, в котором «прообласть отщеплена», называется белок, в котором, по меньшей мере, одна или несколько аминокислот, которые составляют его прообласть, удалены при расщеплении пептидной части, включая белок, имеющий аналогичную N-концевую аминокислоту с нативным белком, кроме того, этот термин относится к белку, имеющему одну или несколько дополнительных аминокислот в N-конце, происходящих из прообласти нативного белка, а также к белку, имеющему более короткую аминокислотную последовательность по сравнению с нативным зрелым белком, при условии, что во всех случаях белок обладает активностью желаемого белка.

Как уже отмечалось в разделе «Предпосылки изобретения», в ограниченном числе сообщений было показано, что внеклеточная секреторная продукция гетерологичного белка из клетки достигалась с использованием коринеформных бактерий, а технология секреторной продукции не была разработана. Кроме того, оставалось неизвестным, что коринеформные бактерии сами по себе секретируют из клетки такой белок, как протеаза. Известные примеры представляют собой эндогенную ДНКазу [патент США №4965197], и сведения, что белок клеточной поверхности, используемый в настоящем изобретении, отделяется от клеточной поверхности во внешнюю среду [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-502548]. Однако был не известен какой-либо сигнальный пептид, который участвует в секреции белка коринеформной бактерии, за исключением белков клеточной поверхности. К настоящему времени единственными известными белками клеточной поверхности коринеформных бактерий являются продукты генов PS1 и PS2, белков клеточной поверхности Corynebacterium glutamicum [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-502548], и продукта гена SlpA, клеточного поверхностного белка Corynebacterium ammoniagenes (которые в последующем в сокращенном виде могут быть обозначены, как С. ammoniagenes) [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №10-108675]. Среди этих белков PS1 и SlpA обладают некоторой гомологией (примерно на 30%), но у других гомология практически отсутствует, и, кроме того, не было установлено гомологии в домене сигнальной последовательности. В качестве примеров сигнальных последовательностей в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 представлены сигнальные последовательности PS1 и PS2 Corynebacterium glutamicum и в SEQ ID NO: 3 показана сигнальная последовательность SlpA из Corynebacterium ammoniagenes.

Следовательно, авторы настоящего изобретения клонировали ген белка PS2 из С. glutamicum (раньше Brevibacterium lactofermentum) штамма АТСС13869 и определили последовательность. Было установлено, что различия в домене сигнальной последовательности из известной последовательности С. glutamicum отсутствовали, но имелись две различные аминокислоты в последовательности 38 N-концевых аминокислотных остатков зрелого клеточного поверхностного белка (остаток Asn на Thr в положении 40 и остаток Glu на Gly в положении 55 в аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO: 5).

Нуклеотидная последовательность, кодирующая 68 остатков, включая 30 аминокислотных остатков сигнального пептида, и 38 аминокислотных остатков N-конца зрелого клеточного белка и его области в 5'-направлении, включая промотор, показана в SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 5.

Затем авторы настоящего изобретения исследовали секрецию гетерологичного белка с использованием области, включающей промотор или область сигнального пептида клеточного поверхностного белка, для определения того, можно ли получить у коринеформных бактерий внеклеточную секреторную продукцию гетерологичного белка в больших количествах.

Поскольку ген трансглютаминазы из актиномицета имеет высокое содержание GC, и ген из коринеформной бактерии обладает близким уровнем GC с геном из актиномицетов, и также они обладают примерно одинаковым характером использования кодона, то можно с преимуществом непосредственно использовать ген из актиномицетов. Следовательно, авторы исследовали вероятность прямого использования гена трансглютаминазы из актиномицетов и установили, что сигнальный пептид трансглютаминазы из актиномицетов не функционирует эффективно в коринеформной бактерии. Однако было установлено, что ген трансглютаминазы, кодирующий зрелый белок, содержащий проструктурную область из актиномицетов, слитую с сигнальным пептидом клеточного поверхностного белка из коринеформной бактерии, эффективно функционировал без какой-либо модификации и эффективно секретировался из клетки в виде пробелка, включающего проструктурную область. Когда использовали ген трансглютаминазы с проструктурной областью, которая дополнительно включает 30 аминокислотных остатков из клеточного поверхностного белка и 38 аминокислотных остатков из N-концевого домена зрелого клеточного поверхностного белка, т.е. когда использовали ген трансглютаминазы, слитой с N-концевым доменом зрелого клеточного поверхностного белка, то эффективность секреции трансглютаминазы из клетки дополнительно повышается.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется, коринеформная бактерия представляет собой аэробную грамположительную бациллу, которая включает бактерии, ранее классифицированные, как Brevibacterium, но в настоящее время определяемые, как Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), включая Brevibacterium, которые очень близки к Corynebacterium. Применение Corynebacterium является преимущественным в том плане, что им свойственна секреция значительно меньшего количества белков из клеток по сравнению с плесенью, дрожжами или бактериями, относящимися к Bacillus, которые ранее были признанными в качестве применимых для секреции гетерологичного белка, что облегчает и сокращает процесс выделения продукта при секреторной продукции, и это выгодно в плане стоимости сред, метода и выхода культивирования, поскольку они хорошо растут на простых культуральных средах, включающих аммиак, неорганические соли и так далее.

Примерами Corynebacterium, которые можно использовать в качестве хозяина-бактерии в настоящем изобретении, являются мутанты, обладающие, по меньшей мере, в 2 раза более высокой способностью секретировать гетерологичные белки по сравнению с Corynebacterium glutamicum дикого типа. Данные мутанты можно получить из штаммов дикого типа, включая Brevibacterium saccharolyticum АТСС14066, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, Brevibacterium roseum ATCC13825, Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC14067, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC15990, Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871 или из их мутантов. Мутанты по настоящему изобретению включают мутантные штаммы, дефектные по их способности продуцировать глутамат, мутантные штаммы по продукции аминокислот, таких как лизин и тому подобное, и мутантные штаммы по продукции других соединений, таких как нуклеиновые кислоты, например инозин. Мутанты по настоящему изобретению можно получить при отборе штаммов, обладающих повышенной способностью к секреторной продукции белков, после облучения УФ-светом или обработки бактерий химическим мутагеном, таким как N-метил-N'-нитрозогуанидин.

В частности, Corynebacterium glutamicum (С. glutamicum) AJ12036 (FERM BP-734) (первоначально помещенный на хранение 26 марта 1984 г.) (в настоящее время Независимое Административное Агентство, Национальный институт по прогрессу в промышленной науке и технологии, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japan) обладает в 2-3 раза более высокой способностью к секреторной продукции гетерологичных белков по сравнению с исходным штаммом (штаммом дикого типа) в оптимальных условиях культивирования, что количественно оценивали по накоплению, это может иметь место за счет мутации функционных генов, ответственных за секрецию белков. Таким образом, данный штамм применим в качестве хозяина. Кроме того, особенно предпочтительно использовать штамм, который получен из такого мутанта и который модифицирован таким образом, что он не продуцирует клеточные поверхностные белки, поскольку при этом облегчается выделение секретированных гетерологичных белков. Подобные модификации можно проводить введением мутации в области, кодирующие клеточные поверхностные белки или области, регулирующие их экспрессию, имеющиеся в геноме, мутагенезом или применением методов рекомбинации генов.

Генетическая конструкция, которую можно использовать в настоящем изобретении, как правило, включает промотор, последовательность, кодирующую правильный сигнальный пептид, и участок нуклеиновой кислоты, кодирующий желаемый белок, и регуляторную последовательность (оператор или терминатор и т.д.), необходимые для экспрессии гена желаемого белка в коринеформной бактерии, в правильном положении, чтобы они могли функционировать. Желаемый белок может иметь проструктурную область в N-конце. Векторы, которые можно использовать для этой конструкции, особым образом не ограничиваются и включают векторы, которые могут функционировать в коринеформной бактерии, и они могут представлять таковые, которые автономно размножаются, такие как плазмиды или векторы, которые вставлены в хромосому бактерии. Особенно предпочтительными являются плазмиды, полученные из коринеформной бактерии. Они включают, например, рНМ1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), рАМ330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)) и плазмиды, полученные их модификацией, которые включают ген устойчивости к лекарственным препаратам.

Можно также использовать искусственные транспозоны. В случае, когда используют транспозон, то желаемый ген вводят в хромосому посредством гомологичной рекомбинации или ее собственной способности к транспозиции.

Промоторы, которые можно использовать по изобретению, особым образом не ограничиваются. Как правило, можно использовать любой промотор, который может функционировать в клетке коринеформной бактерии. Также это может быть промотор, полученный из других видов, например промотор, полученный из E.coli, такой как tac-промотор и т.д. Среди подобных промоторов более предпочтительным является сильный промотор, включая tac-промотор и т.д.

Примеры промоторов, полученных из коринеформной бактерии, включают промоторы генов белков клеточной поверхности PS1, PS2 и SlpA, промоторы генов в биосинтезе различных аминокислот, например гена глютаматдегидрогеназы, участвующей в биосинтезе глутаминовой кислоты, гена глютаминсинтетазы, участвующей в синтезе глутамина, гена аспартаткиназы, участвующей в биосинтезе лизина, гена гомосериндегидрогеназы, участвующей в биосинтезе треонина, гена ацетогидроксилатсинтазы, участвующей в биосинтезе изолейцина и валина, гена 2-изопропилмалатсинтазы, гена глутаматкиназы, участвующих в синтезе пролина и аргинина, гена фосфорибозил-АТФ-пирофосфорилазы, участвующей в синтезе гистидина, гена дезоксиарабиногептуроновой кислоты-фосфат (DAHP)-синтазы, участвующей в синтезе ароматических аминокислот, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин и т.д., гена фосфорибозилпирофосфат(PRPP)амидотрансферазы, гена инозинатдегидрогеназы и гена гуанилатсинтазы, участвующих в биосинтезе производных нуклеиновой кислоты, таких как инозинат и гуанилат.

Сигнальный пептид, который используется в настоящем изобретении, представляет собой сигнальный пептид секреторного белка из хозяина, коринеформной бактерии, и предпочтительно представляет собой сигнальный пептид клеточного поверхностного белка из коринеформной бактерии. Клеточные поверхностные белки включают PS1 и PS2, полученные из С. glutamicum (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-502548), и SlpA, полученный из С. ammoniagenes (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №10-108675). Аминокислотная последовательность PS1 представлена в SEQ ID NO: 2, аминокислотная последовательность PS2 - в SEQ ID NO: 1 и аминокислотная последовательность SlpA показана в SEQ ID NO: 3. Кроме того, сообщалось, что ДНКаза из коринеформной бактерии также обладает сигнальным пептидом, как описано в патенте США №4965197, который также можно использовать в настоящем изобретении.

С сигнальным пептидом может быть соединен участок N-концевой аминокислотной последовательности секреторного белка, из которого получен сигнальный пептид. Сигнальную последовательность отщепляют сигнальной пептидазой во время секреции из клетки транслированного продукта. Кроме того, можно также использовать ген, кодирующий сигнальный пептид, либо в нативной форме, либо в модифицированной форме, включающей оптимальные кодоны в зависимости от характера использования кодонов у хозяина, который применяется.

В случае, когда используются данные сигнальные пептиды, то гены, кодирующие желаемые белки, соединяют с 3'-концом генов, кодирующих сигнальные пептиды, и располагают таким образом, что они подвергаются регуляции экспрессии промоторами, описанными выше.

Применимые белки, которые можно получить секреторной продукцией по настоящему изобретению, в основном представляют собой без ограничения все секреторные белки, полученные из животных, растений и микроорганизмов. Например, можно получить секрецией по настоящему изобретению такие белки, как протеаза, экзопептидаза, аминопептидаза, карбоксипептидаза, коллагеназа и хитиназа. Белки, которые получают секреторной продукцией по настоящему изобретению, предпочтительно являются нативными секреторными белками, более предпочтительно белками, имеющими дополнительные проструктурные области. Трансглютаминаза является особенно предпочтительной в качестве применимого белка, получаемого секреторной продукцией по настоящему изобретению. В качестве генов трансглютаминазы для целей настоящего изобретения можно использовать гены трансглютаминазы секреторного типа, полученные из актиномицетов, например S. mobaraense IFO13819, S. cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptomyces lydicus [WO 9606931] и т.д., и плесени, такой как Oomycetes [WO 9622366] и т.д. Гены, кодирующие данные белки, можно модифицировать в зависимости от типа хозяина, который используется для достижения желаемой активности, и модификации могут включать добавление, делецию, замену одного или несколько аминокислотных остатков и необязательно можно оптимизировать их кодонный состав в зависимости от частоты использования кодонов у хозяина.

Когда белок, полученный секреторной продукцией по настоящему изобретению, представляет собой белок, экспрессируемый в естественных условиях в виде препропептида, то предпочтительно использовать фрагмент гена, кодирующий пробелок, включающий проструктурную область (прообласть), хотя это не является существенным. Когда используется ген, кодирующий препробелок, то прообласть полученного белка в результате экспрессии гена можно отщепить подходящими способами, например, протеазой. Для этого можно использовать аминопептидазы, эндопептидазы, которые расщепляют в соответствующем сайте, или несколько специфические протеазы. Предпочтительно использовать протеазы, которые расщепляют белок таким образом, что расщепленный белок будет обладать одинаковой активностью или несколько высокой активностью, чем нативный белок. Альтернативно последовательность гена, кодирующую желаемый белок или кодирующую проструктурную область желаемого белка, можно также модифицировать и сконструировать для экспрессии белка, обладающего сайтом узнавания для протеазы, специфической для желаемого положения. Общие молекулярно-биотехнологические способы, включая также методы модификации, методы клонирования генов и методы детектирования продуцированных белков, хорошо известны специалистам в данной области и их можно найти у Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and (D.N.Glover ed. 1985), F.M.Ausubel et al. (Eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994), PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H.Erlich, ed., Stockton Press and etc.

N-концевая область белка, которую можно получить в конечном итоге по настоящему изобретению, необязательно является такой же, как у нативного белка и, следовательно, можно добавить от одной до нескольких аминокислот к или, напротив, удалить их из нативного белка. Когда используют протеазу, то предпочтительно, чтобы полученный белок расщеплялся примерно по тому же положению, что и нативный белок в отношении активности, и является более предпочтительным, если она является такой же, как у зрелого пептида нативного белка. Следовательно, специфические протеазы, которые расщепляют пропептид в таком положении, что в результате получают такой же белок, что и нативный белок, как правило, являются наиболее предпочтительными. Однако для определенной цели пептиды, имеющие более длинную или несколько короткую последовательность аминокислотного остатка, отличающуюся на один или несколько остатков в N-конце по сравнению с N-концом нативного белка, могут обладать более подходящей активностью. Подобные протеазы включают, например, диспазу (производства Boehringer Manheim Co.), которая промышленно доступна, и протеазы, полученные из культуральной среды микроорганизмов, такой как, например, культуральная среда актиномицетов. Такие протеазы можно использовать в неочищенной форме или необязательно можно использовать после очистки до соответствующей чистоты.

Другим примером подходящих протеаз для удаления прообласти протрансглютаминаз из Streptomyces, является SAMP45, сериновая протеаза, продуцируемая Streptomyces albogriseolus (в последующем в сокращенной форме S. albogriseolus). Последовательность гена и кодируемая полноразмерная аминокислотная последовательность (1-13: сигнальная последовательность, 32-76: прообласть, 77-407: зрелая трансглютаминаза) для трансглютаминазы S. mobaraense представлены соответственно в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7. В случае протрансглютаминазы S. mobaraense, то поскольку SAMP45 расщепляет между Ser⁷² и Phe⁷³ в проструктурной области, то полученный белок имеет структуру, в которой дополнительные 4 аминокислоты (Phe-Arg-Ala-Pro, SEQ ID NO: 60) с С-конца прообласти соединены с N-концом нативной зрелой трансглютаминазы. Авторы настоящего изобретения установили, что такие белки обладают активностью трансглютаминазы. Уже определена последовательность гена SAPM45, и аминокислотная последовательность белка с дополнительной проструктурной областью (npoSAMP45) представлена в SEQ ID NO: 8 (J. Bacteriol., 179, 430-438 (1997)).

Кроме того, зрелую трансглютаминазу, идентичную нативной трансглютаминазе, можно получить при использовании пролиновой специфической пептидазы, продуцируемой S. mobaraense (svPEP), которая была обнаружена заявителями наряду с SAMP45, что приводит к удалению четырех аминокислот Phe-Arg-Ala-Pro, добавленных в N-конец.

Данная svPEP представляет собой фермент, который специфически расщепляет пептиды или аналоги пептидов, представленные последующей формулой (I) в сайте, обозначенном в формуле *, т.е. с карбоксильной концевой стороны третьего или четвертого остатка пролина с N-конца:

Y-Pro-*-Z (I),

в которой Y представляет собой олигопептид, состоящий из двух или трех аминокислотных остатков, и Z представляет собой аминокислоту, пептид, амид или эфир.

Нуклеотидная последовательность гена svPEP и кодируемая полная аминокислотная последовательность представлены соответственно в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. В случае, когда svPEP взаимодействует с протрансглютаминазой вместе с протеазой, находясь в виде бульона S. mobaraense или клеток S. mobaraense, то проструктурная область может быть полностью отщеплена с получением зрелой трансглютаминазы, из которой полностью удалена проструктурная область. Альтернативно зрелую трансглютаминазу, из которой полностью удалена проструктурная область, можно также получить культивированием коринеформной бактерии, где ген препроsvPEP вместе с геном протеазы вводят в саму коринеформную бактерию, которая секретирует протрансглютаминазу при секреторной продукции. Кроме того, зрелую трансглютаминазу, имеющую такую же структуру, как естественная форма, можно эффективно получить одновременным введением гена SAMP45 и гена svPEP в коринеформную бактерию, в которую был введен ген протрансглютаминазы, и секрецией бактерией протрансглютаминазы и SAMP45, а также svPEP внеклеточно или на поверхность клеток.

Способ введения генетических конструкций в коринеформную бактерию, который можно использовать в настоящем изобретении, не ограничивается определенными способами и, как правило, используемые способы включают, например, способ протопластов (Gene, 39, 281-286 (1985)), электропорацию (Bio/Technology, 7, 1067-1070 (1989)) и т.д. Полученный трансформант можно культивировать обычными методами и в обычных условиях. Например, трансформант можно культивировать в обычной среде, содержащей источники углерода, источники азота и источники неорганических солей. Необязательно можно добавить в среду следовые количества органических питательных веществ, таких как витамины и аминокислоты, для достижения более высокого уровня роста.

В качестве источника углерода можно использовать углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и можно использовать органические кислоты, такие как уксусная кислота, спирты и другие. В качестве источника азота можно использовать газообразный аммиак, водный раствор аммиака, соли аммония и другие. В качестве неорганических ионов, когда необходимо, необязательно можно использовать ион кальция, ион магния, ион фосфора, ион калия, ион двухвалентного или трехвалентного железа и другие. Культивирование можно проводить в течение примерно 1-7 суток в аэробных условиях при значении рН в соответствующих пределах между 5,0 и 8,5 и при температуре от 15°С до 37°С. При культивировании трансформанта в таких условиях продуцируется внутри клетки и эффективно секретируется из клетки большое количество желаемого белка. Известно, что, как правило, трансглютаминаза приводит к гибели, когда накапливается в больших количествах в клетках микроорганизмов, но по настоящему изобретению трансглютаминаза непрерывно продуцируется, не приводя к летальному действию, поскольку продуцированная внутри клеток трансглютаминаза выделяется из клеток.

Белки, которые секретировались в среду по настоящему изобретению, можно выделить и очистить из инкубационной культуральной среды способами, хорошо известными специалистам в данной области. Например, белки можно выделить и очистить удалением клеток из среды центрифугированием и т.д. и затем использованием известных соответствующих способов, таких как высаливание, осаждение этанолом, ультрафильтрация, гель-фильтрация, ионообменная колоночная хроматография, аффинная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, обратнофазовая хроматография, гидрофобная хроматография или их комбинация. Белки, секретированные на поверхность клеток по настоящему изобретению, можно выделить и очистить с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, например их солюбилизацией при повышенных концентрациях соли или поверхностно-активными веществами, и затем с применением способов, аналогичных для белков, секретированных в среду. Кроме