Способ ферментативного получения эпотилонов, кристаллическая форма эпотилона b и ее использование

Способ ферментативного получения эпотилонов, кристаллическая форма эпотилона b и ее использование

Реферат

Настоящее изобретение относится к новому биотехнологическому способу получения, который может применяться в промышленном масштабе для получения эпотилонов, прежде всего к способу концентрирования этих соединений в культуральной среде, а также к новому штамму, предназначенному для получения этих соединений ферментативным путем. Изобретение также относится к новым кристаллическим формам эпотилонов, прежде всего эпотилона В, которые могут быть получены с помощью предлагаемого способа, к их применению для приготовления фармацевтических композиций, к новым фармацевтическим композициям, включающим эти новые кристаллические формы, и/или к применению этих соединений для лечения пролиферативных заболеваний, таких как опухоли, или для приготовления фармацевтических композиций, которые могут применяться для такого лечения.

Предпосылки создания изобретения

Среди известных цитотоксических действующих веществ, предназначенных для лечения опухолей, важную роль играет стабилизирующий микротрубки агент Taxol® (Paclitaxel; фирма Bristol-Myers Squibb), который пользуется большим спросом на рынке. Однако таксолу присущ целый ряд недостатков. В частности, одна из проблем связана с его плохой растворимостью в воде. В результате этого Taxol® необходимо вводить в композиции вместе с Cremophor® EL (полиэтоксилированное касторовое масло; фирма BASF, Людвигсхафен, Германия). Cremophor® EL обладает серьезными побочными действиями; например, он вызывает аллергические реакции, что по крайней мере в одном случае даже привело к смерти пациента.

Хотя относящиеся к классу таксана стабилизирующие микротрубки противораковые агенты охарактеризованы как "вносящие, вероятно, наиболее важный вклад в арсенал фармацевтических средств борьбы с раком в последнем десятилетии" (см. Rowinsky E.K., Ann. rev. Med. 48, 353-374 (1997)), тем не менее несмотря на коммерческий успех Taxol® эти соединения реально пока еще не считаются крупным достижением в химиотерапии рака. Лечение с помощью Taxol® связано с целым рядом серьезных побочных действий, а несколько классов первичных твердых опухолей, а именно, опухоли ободочной кишки и опухоли предстательной железы, чувствительны к этому соединению лишь в незначительной степени (Rowinsky E.K, см. выше). Кроме того, на эффективность таксола могут влиять и даже полностью ее нейтрализовать механизмы приобретенной устойчивости, базирующиеся прежде всего на сверхэкспрессии фосфопротеинов, которые действуют в качестве так называемых "откачивающих насосов" для действующих веществ, а также устойчивость ко множеству лекарств, являющая следствием сверхэкспрессии транспортного гликопротеина для многих лекарств, т.е. "Р-гликопротеина".

Эпотилоны А и В представляют собой новый класс стабилизирующих микротрубки цитотоксических действующих веществ (см. Gerth К. и др., J.Antibiot. 49, 560-563 (1966)) формулы I

где R означает атом водорода (эпотилон А) или метил (эпотилон В).

Эти соединения обладают следующими преимуществами по сравнению с Taxol®:

а) они обладают лучшей растворимостью в воде, что в результате упрощает приготовление композиции на их основе,

б) имеются данные о том, что в экспериментах на культуре клеток они также проявляют активность в отношении пролиферации клеток, у которых в результате активности связанного с Р-гликопротеином "откачивающего насоса" развилась устойчивость ко множеству лекарств, чем обусловлена устойчивость к лечению другими химиотерапевтическими агентами, включая Taxol® (см. Bolag D.M. и др., "Epothilones, a new class of mirotubule-stabililizing agents with Taxollike mechanism of action", Cancer Research 55, 2325-2333 (1995)), и

в) было установлено, что они проявляют очень высокую эффективность in vitro в отношении устойчивой к Taxol® линии клеток карциномы яичника с модифицированным β-тубулином (см. Kowalski R.J. и др., J.Biol. Chem. 272(4), 2543-2541 (1997)).

Эпотилоны можно применять в фармацевтике, например, для лечения опухолей, аналогично тому, как это описано для таксола (см. например, US 5641803, US 5496804, US 5565478).

Однако для того, чтобы эпотилоны можно было применять в фармацевтических целях в широких масштабах, эти соединения необходимо получать в соответствующих количествах.

К настоящему времени в литературе описана экстракция природных веществ, прежде всего эпотилонов, из миксобактерий, главным образом из клеток штамма Sorangium cellulosum Soce90 (который депонирован под номером 6773 в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, см. WO 93/10121). Для получения удовлетворительной концентрации природных веществ в культуральной среде, прежде всего эпотилонов, и последующей их экстракции ранее всегда добавляли в качестве адсорбата смолу на основе полистирола, например Amberlite XAD-1180 (фирма Rohm&Haas, Франкфурт, Германия).

Однако недостаток этого процесса состоит в том, что при его применении в крупномасштабном производстве возникает множество проблем. Так, например, происходит повреждение клапанов шариками смолы, существует возможность закупорки трубок, а сам аппарат может подвергаться высокому износу из-за механического трения. Шарики смолы являются пористыми и вследствие этого имеют большую площадь внутренней поверхности (примерно 825 м²/г смолы). Еще одна проблема связана со стерилизацией, поскольку заключенный в смоле воздух не автоклавирован. Таким образом, добавление смолы практически исключает крупномасштабное применение этого процесса. С другой стороны, без добавления шариков смолы в культуральной среде не может быть достигнута удовлетворительная концентрация эпотилонов.

При создании изобретения неожиданно был найден путь решения этой дилеммы, позволяющий достичь удовлетворительной концентрации природных веществ с помощью микроорганизмов, прежде всего миксобактерий, которые продуцируют эпотилоны, такие как эпотилон А или В, в частности достичь удовлетворительной концентрации эпотилонов А и В в культуральной среде без добавления смол, что тем самым позволяет устранить вышеуказанные технические недостатки, связанные с получением этих соединений, прежде всего эпотилонов, в промышленном масштабе.

Подробное описание изобретения

Одним из объектов настоящего изобретения является способ концентрирования эпотилонов, прежде всего эпотилона А и/или В, в частности эпотилона В, в культуральной среде с целью получения этих соединений в биотехнологическом масштабе, при этом при осуществлении способа используются микроорганизмы, продуцирующие эти соединения, прежде всего миксобактерий (как продуценты природных веществ), причем в среду добавляют комплексообразующий компонент, который растворим в культуральной среде.

Еще одним объектом изобретения является культуральная среда с соответствующим комплексообразующим компонентом и микроорганизмами, прежде всего миксобактериями, в частности рода Sorangium, которые могут применяться для продуцирования эпотилонов, прежде всего эпотилона А и/или В.

Еще одним объектом изобретения является способ получения эпотилонов, прежде всего эпотилона А и/или В, главным образом двух чистых соединений, в частности эпотилона В, который отличается тем, что эпотилоны получают за счет приготовления культуральной среды для биотехнологического получения этих соединений, которая предназначена для выращивания микроорганизмов в качестве продуцентов природных веществ, прежде всего миксобактерий, которые продуцируют эти соединения, и в которую добавлен комплексообразующий компонент, растворимый в культуральной среде, с последующими очисткой и при необходимости разделением эпотилонов, например эпотилона А и эпотилона В.

Следующим объектом изобретения является способ разделения эпотилонов, прежде всего эпотилонов А и В, отличающийся применением колоночной хроматографии с обращенной фазой и элюента, включающего (низш.) алкилцианид.

Еще одним объектом изобретения является полученный в результате мутагенеза штамм Sorangium cellulosum, который в идентичных в остальном условиях продуцирует большее количество эпотилонов, чем штамм Sorangium cellulosum Soce90.

Объектом изобретения являются также новые кристаллические формы эпотилона В.

Общие понятия, которые используются выше и ниже в описании, имеют следующие значения.

Если выше и ниже в описании даются ссылки на литературные источники, то они включены в описании в той мере, в какой это необходимо.

Приставка "(низш.)" всегда означает, что соответствующий радикал содержит максимум до 7 атомов углерода, в частности до 4 атомов углерода, и он может быть разветвленным или неразветвленным. (Низш.)алкил может быть, например, неразветвленным или одно- либо многократно разветвленным и означает, например, метил, этил, пропил, такой как изопропил или н-пропил, бутил, такой как изобутил, втор-бутил, трет-бутил или н-бутил, или также пентил, такой как амил или н-пентил.

Культуральная среда для биотехнологического получения эпотилонов с продуцирующими эти соединения микроорганизмами в качестве продуцентов природных веществ, прежде всего с миксобактериями, представляет собой главным образом среду, которая предназначена для выращивания соответствующих (встречающихся в естественных условиях или же полученных путем культивирования либо, в частности, путем генетической модификации) микроорганизмов, прежде всего штаммов миксобактерий, которые могут продуцировать эти соединения, в частности миксобактерий рода Sorangium, предпочтительно (в частности для производства эпотилона) микроорганизма типа Sorangium cellulosum Soce90 (см. WO 93/10121), или полученного из него или из частей миксобактерий биоматериала (например, с помощью мутагенеза или технологии рекомбинантного гена), прежде всего соответствующим образом полученного штамма, в частности штамма, обозначенного как ВСЕ33/10, или его мутантов, и которая помимо воды предпочтительно содержит другие общепринятые и пригодные компоненты культуральных сред, такие как биополимеры, сахара, аминокислоты, соли, нуклеиновые кислоты, витамины, антибиотики, полусинтетические химические вещества, факторы роста, экстракты из биологических материалов, такие как дрожжи или экстракты других клеток, соевая мука, крахмал, такой как картофельный крахмал и/или микроэлементы, например ионы железа в форме комплекса, или приемлемые комбинации всех или некоторых из этих компонентов и/или также аналогичные добавки. Соответствующие культуральные среды известны специалистам в данной области или могут быть приготовлены по известным методам (см., например, составы культуральных сред, приведенные в качестве примеров в настоящем описании или представленные в WO 93/10121). Предпочтительным штаммом миксобактерии является штамм, полученный с помощью УФ-мутагенеза и отобранный по признаку повышенного образования эпотилона А и/или В по сравнению со штаммом Sorangium cellulosum Soce90, который депонирован в DSM по номером 6773, прежде всего мутант ВСЕ33/10, который был депонирован под номером DSM 11999 9 февраля 1998 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Германия).

Культивирование штамма ВСЕ33/10 и морфологическое описание штамма

Штамм может расти на целлюлозе в качестве единственного источника углерода и энергии с добавлением нитрата калия в качестве единственного источника азота, например на фильтровальной бумаге, покрывающей агар ST21 с минеральными солями (0,1% KNO₃, 0,1% MgSO₄•7H₂O, 0,1% CaCl₂•2Н₂О, 0,1% К₂HPO₄, 0,01% MnSO₄•7H₂O, 0,02% FeCl₃, 0,002% дрожжевого экстракта, стандартный раствор микроэлементов, 1% агара). На этой среде формируются плодовые тела от темного красновато-коричневого до черновато-коричневого цвета. Они состоят из небольших спорангиолей (диаметром примерно 15-30 мкм) и присутствуют в виде плотных образований и групп различного размера.

Вегетативные палочки имеют форму, типичную для Sorangium (относительно компактные, при исследовании с помощью фазово-контрастного микроскопа представляют собой темные, цилиндрические палочки с широкими округлыми концами, имеющие в среднем длину 3-6 мкм и ширину 1 мкм).

Эпотилоны представляют собой прежде всего эпотилон А и/или В, но также и другие эпотилоны, например эпотилоны С и D, описанные в заявках WO 97/19086 и WO 98/22461, эпотилоны Е и F, описанные в WO 98/22461, и другие эпотилоны, которые могут быть получены с помощью соответствующих микроорганизмов.

Водорастворимый комплексообразующий компонент представляет собой прежде всего водорастоворимое олиго- или полипептидное производное или, в частности, олиго- или полисахаридное производное циклического или спиралевидного строения, которое образует внутримолекулярную полость, и вследствие своих в достаточной степени гидрофобных свойств обладает способностью связываться с эпотилонами, прежде всего с эпотилоном А и/или эпотилоном В. Особенно предпочтительный водорастворимый комплексообразующий компонент выбирают из группы, включающей циклодекстрины или (в частности) циклодекстриновые производные и их смеси.

Циклодекстрины представляют собой циклические (α-1,4)-связанные олигосахариды α-D-глюкопиранозы с относительно гидрофобной центральной полостью и гидрофильной областью внешней поверхности.

Следует отметить, в частности, следующие соединения (цифрами в скобках обозначено количество остатков глюкозы на молекулу): α-циклодекстрин (6), β-циклодекстрин (7), γ-циклодекстрин (8), δ-циклодекстрин (9), ε-циклодекстрин (10), ζ-циклодекстрин (11), η-циклодекстрин (12) и θ-циклодекстрин (13). Наиболее предпочтительными являются δ-циклодекстрин и особенно α-циклодекстрин, β-циклодекстрин или γ-циклодекстрин либо их смеси.

Циклодекстриновые производные прежде всего представляют собой производные вышеперечисленных циклодекстринов, особенно α-циклодекстрин, β-циклодекстрин или γ-циклодекстрин, в частности циклодекстрины, в которых одна или большее количество вплоть до всех гидроксигрупп (3 на радикал глюкозы) преобразованы с образованием простого или сложного эфира. Простые эфиры прежде всего представляют собой простые алкиловые эфиры, предпочтительно (низш.)алкиловые эфиры, такие как метиловый или этиловый эфир, а также пропиловый или бутиловый эфир, арилгидроксиалкиловые эфиры, такие как фенилгидрокси(низш.)алкиловый, предпочтительно фенилгидроксиэтиловый эфир, гидроксиалкиловые эфиры, в частности гидрокси(низш.)алкиловые эфиры, предпочтительно 2-гидроксиэтиловый эфир, гидроксипропиловый эфир, такой как 2-гидроксипропиловый эфир, или гидроксибутиловый эфир, такой как 2-гидроксибутиловый эфир, карбоксиалкиловые эфиры, в частности карбокси(низш.) алкиловые эфиры, предпочтительно карбоксиметиловый или карбоксиэтиловый эфир, дериватизированные карбоксиалкиловые эфиры, в частности дериватизированный карбокси(низш.)алкиловый эфир, в котором дериватизированная карбоксигруппа является этерифицированной или амидированной карбоксигруппой (прежде всего аминокарбонилом, моно- или ди(низш.)алкиламинокарбонилом, морфолино-, пиперидино-, пирролидино- или пиперазинокарбонилом, или алкоксикарбонилом), в частности (низш.)алкоксикарбонил-(низш)алкиловые эфиры, например метилоксикарбонилпропиловый эфир или этилоксикарбонилпропиловый эфир, сульфоалкиловые эфиры, в частности сульфо(низш.)алкиловые эфиры, предпочтительно сульфобутиловыи эфир, циклодекстрины, в которых одна или большее количество ОН-групп этерифицировано с помощью радикала формулы

-O-[Alk-O]_n-H

где Alk означает алкил, предпочтительно (низш.)алкил, а n обозначает целое число от 2 до 12, предпочтительно 2-5, в частности 2 или 3, циклодекстрины, в которых одна или большее количество ОН-групп этерифизировано с помощью радикала формулы

где R' обозначает атом водорода, гидрокси, -O-(Alk-O)_z-H, -O-(Alk(-R)-O)_p-Н или -O-(Alk(-R)-O)_q-Alk-CO-Y, при этом Alk во всех случаях обозначает алкил, предпочтительно (низш.)алкил, m, n, p, q и z обозначают целое число от 1 до 12, предпочтительно 1-5, в частности 1-3, a Y означает OR₁ или NR₂R₃, где R₁, R₂ и R₃ независимо друг от друга обозначают атом водорода или (низш.)алкил либо R₂ и R₃ вместе с присоединенным атом азота обозначают морфолино, пиперидино, пирролидино или пиперазино, или разветвленные циклодекстрины, в которых присутствуют эфирные группы или ацетали, образованные с другими молекулами сахаров, предпочтительно глюкозил-, диглюкозил(G₂-β-циклодекстрин), мальтозил- или димальтозилциклодекстрин или N-ацетилглюкозаминил-, глюкозаминил-, N-ацетилгалактозаминил- или галактозаминилциклодекстрин.

Сложные эфиры прежде всего представляют собой алканоиловые эфиры, в частности (низш.) алканоиловые эфиры, такие как ацетиловые эфиры циклодекстринов.

Также возможно использовать циклодекстрины, в которых два или большее количество указанных различных групп простых эфиров и групп сложных эфиров присутствует одновременно.

Также могут применяться смеси из двух или большего количества этих циклодекстринов и/или циклодекстриновых производных.

Предпочтение отдается, в частности, α-, β- или γ-циклодекстринам или их простым (низш.)алкиловым эфирам, таким как метил-β-циклодекстрин или особенно предпочтительно 2,6-ди-О-метил-β-циклодекстрин, или предпочтительно их простым гидрокси(низш.)алкиловым эфирам, таким как 2-гидроксипропил-α-, 2-гидроксипропил-β- или 2-гидроксипропил-γ-циклодекстрин.

Циклодекстрины или циклодекстриновые производные добавляют в культуральную среду предпочтительно в концентрации 0,02-10, более предпочтительно 0,05-5, особенно предпочтительно 0,1-4, например 0,1-2% (мас./об.).

Циклодекстрины или циклодекстриновые производные являются известными или могут быть получены с помощью известных методов (см., например, US 3459731, US 4383992, US 4535152, US 4659696, ЕР 0094157, ЕР 0149197, ЕР 0197571, ЕР 0300526, ЕР 0320032, ЕР 0499322, ЕР 0503710, ЕР 0818469, WO 90/12035, WO 91/11200, WO 93/19061, WO 95/08993, WO 96/14090, GB 2189245, DE 3118218, DE 3317064 и указанные в этих публикациях ссылки, которые также относятся к синтезу циклодекстринов или циклодекстриновых производных, или см. также Т.Loftsson и М.Е.Brewster, Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation, Journal of Pharmaceutical Science 85 (10): 1017-1025 (1996); R.A.Rajewski и V.J.Stella, Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In vivo Drug Delivery, Journal of Pharmaceutical Science 85 (II): 1142-1168 (1996)).

В приведенном ниже описании процесса обработки и очистки под понятием "эпотилон" подразумевают эпотилон, который может быть получен из соответствующего микроорганизма, предпочтительно эпотилон С, D, Е, F или особенно предпочтительно эпотилон А, наиболее предпочтительно эпотилон В. Если не указано иное, то при использовании понятия "эпотилон" подразумевают это понятие в широком смысле, включающем индивидуальные эпотилоны или их смеси.

Процесс обработки эпотилонов осуществляют общепринятыми методами, прежде всего разделением культуры на жидкую фазу (центрифугат) и твердую фазу (клетки) с помощью фильтрации или центрифугирования (лабораторная центрифуга или сепаратор). Часть (основную) эпотилонов, находящуюся в центрифугате или в фильтрате, затем непосредственно смешивают с синтетической смолой, например со смолой, основой которой является полистирол в качестве матрицы (далее в настоящем описании также обозначена просто как полистирол), такой как Amberlite XAD-16 [фирма Rohm & Haas GmbH, Франкфурт, Германия] или Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Милан] (предпочтительно в объемном соотношении центрифугат:смола примерно от 10:1 до 100:1, более предпочтительно примерно 50:1). После контактирования со смолой, длящегося предпочтительно от 0,25 до 50 ч, особенно предпочтительно от 0,8 до 22 ч, смолу отделяют, например фильтрацией или центрифугированием. При необходимости после адсорбции смолу промывают высокополярным растворителем, предпочтительно водой. Затем осуществляют десорбцию эпотилона с помощью соответствующего растворителя, предпочтительно спирта, в частности изопропанола. Фазу растворителя, предпочтительно изопропанольную фазу, затем удаляют из растворителя, предпочтительно путем предварительного, одновременного или последующего добавления воды, в частности в испарителе с циркуляцией, осуществляя таким образом при необходимости концентрирование, и образовавшуюся водную фазу экстрагируют растворителем, пригодным для образования второй фазы, таким как сложный эфир, например (низш.)алканол(низш.)алканоат, как правило, этилацетат или изопропилацетат. Таким путем эпотилоны переносят в органическую фазу. Затем органическую фазу концентрируют до требуемой степени, предпочтительно досуха, например с помощью роторного испарителя.

Затем осуществляют дополнительную обработку с использованием следующих стадий, где стадия очистки с помощью хроматографии с обращенной фазой с элюированием нитрилом представляет собой предлагаемую в изобретении стадию и вследствие этого является обязательной, в то время как другие стадии являются необязательными:

- молекулярную фильтрацию (гель-хроматография), например на колонке из такого материала, как Sephadex LH-20 (фирма Pharmacia, Уппсала, Швеция), с использованием спирта, такого как метанол, в качестве элюента;

- отделение эпотилонов с помощью хроматографии с обращенной фазой после их растворения в пригодном растворителе и элюирование смесью нитрил/вода (обязательно), предпочтительно отличающееся тем, что хроматографию проводят на колонке из такого материла, как преимущественно материал RP-18, который несет углеводородные цепи, такие как углеводородные цепи, содержащие 18 атомов углерода, а элюент включает нитрил, предпочтительно (низш.)алкилнитрил, в частности ацетонитрил, прежде всего применяют смесь нитрил/вода, предпочтительно смесь ацетонитрил/вода, предпочтительно в соотношении нитрила и воды примерно от 1:99 до 99:1, прежде всего от 1:9 до 9:1, например от 2:8 до 7:3, в частности 3:7 или 4:6;

- однократную или многократную экстракцию остатка (предпочтительно после упаривания) в двухфазной системе, включающей воду и несмешивающийся с водой растворитель, предпочтительно сложный эфир, в частности (низш.)алкил(низш.)алканоат, такой как этилацетат или изопропилацетат;

- адсорбционную хроматографию, в частности с использованием колонки из силикагеля и элюирования соответствующим растворителем или смесью растворителей, предпочтительно смесью сложный эфир/углеводород, например (низш.)алкил(низш.)алканоат/С₄-С₁₀алкан, предпочтительно этил- или изопропилацетат/н-гексан, причем соотношение сложного эфира и углеводорода предпочтительно составляет от 99:1 до 1:99, более предпочтительно от 10:1 до 1:10, например 4:1;

- растворение остатка, который может быть получен после концентрирования в соответствующем растворителе, таком как спирт, например метанол;

- смешение с активированным углем и его удаление;

- перекристаллизацию, например из соответствующих растворителей или смесей растворителей, содержащих, например сложные эфиры, смеси сложный эфир/углеводород или спирты, предпочтительно этил- или изопропилацетат:толуол, в соотношении от 1:10 до 10:1, предпочтительно 2:3 (эпотилон А) или метанол или этилацетат (эпотилон В);

при этом между стадиями образовавшиеся растворы или суспензии при необходимости концентрируют и/или жидкие и твердые компоненты отделяют друг от друга, в частности фильтрацией или центрифугированием растворов/суспензий. Приведенные ниже более точные характеристики могут предпочтительно применяться на вышеуказанных отдельных стадиях.

Переработку и очистку предпочтительно проводят следующим образом.

После сбора культуру разделяют на жидкую фазу (центрифугат) и твердую фазу (клетки) с помощью центрифугирования (лабораторная центрифуга или сепаратор). Основную часть эпотилонов, находящуюся в центрифугате, затем непосредственно смешивают с полистиролом, таким как Amberlite XAD-16 [фирма Rohm & Haas GmbH, Франкфурт, Германия] или Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Милан] (предпочтительно в объемном соотношении центрифугат:смола примерно от 10:1 до 100:1, более предпочтительно примерно 50:1), и перемешивают в смесителе. На этой стадии эпотилоны переносят из циклодекстрина на смолу. После контактирования со смолой, длящегося примерно 1 ч, смолу отделяют центрифугированием или фильтрацией. Адсорбцию эпотилонов на смолу также можно осуществлять на хроматографической колонке, внося смолу на колонку и разгоняя центрифугат на смоле. После адсорбции смолу промывают водой. Десорбцию эпотилонов из смолы проводят с помощью изопропанола. Затем от изопропанольной фазы отделяют изопропанол предпочтительно путем добавления воды, в частности в испарителе с циркуляцией, и образовавшуюся водную фазу экстрагируют этилацетатом. Эпотилоны переносят из водной фазы в этилацетатную фазу. Затем этилацетатный экстракт концентрируют досуха с помощью роторного испарителя. Первоначальное концентрирование эпотилонов затем осуществляют с помощью молекулярной фильтрации (используя, например, Sephadex LH-20 [фирма Pharmacia, Уппсала, Швеция] и метанол в качестве элюента). Полученные после молекулярной фильтрации фракции, которым соответствуют наиболее высокие пики (пиковые фракции), содержат эпотилон А и В, ив них общее содержание эпотилонов превышает 10%. Затем проводят разделение этих пиковых фракций, которые содержат эпотилон А и B в смеси, на индивидуальные компоненты с помощью хроматографии с обращенной фазой, например RP-18-фазой (фаза, модифицированная алкильными радикалами, содержащими 18 атомов углерода на цепь), с использованием соответствующего элюента, предпочтительно содержащего нитрил, такой как ацетонитрил (что позволяет достичь более эффективного разделения, чем при использовании, например, спиртов, таких как метанол). Эпотилон А элюируется раньше, чем эпотилон В. Содержащие эпотилон В пиковые фракции еще могут включать небольшие количества эпотилона А, который может быть удален дополнительным разделением на RP-18. В завершение фракцию, включающую эпотилон А, кристаллизуют непосредственно из смеси этилацетат:толуол (2:3), а фракцию, включающую эпотилон В, - из метанола или этилацетата.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Изобретение предпочтительно относится к способу концентрирования эпотилонов, предпочтительно эпотилона А и/или В, в частности эпотилона В, в культуральной среде, которая предназначена для биотехнологического получения этого(-их) соединения (-ий) с использованием микроорганизма, пригодного для такого получения, предпочтительно штамма Sorangium, особенно предпочтительно штамма типа Sorangium cellulosum Soce90, или его мутанта, в частности штамма, обозначенного как ВСЕ33/10, и которая содержит воду и другие обычно необходимые ингредиенты культуральных сред, причем в среду добавляют циклодекстрин или циклодекстриновое производное либо смесь двух или большего количества этих соединений, предпочтительно одно или более, более предпочтительно один, два или более циклодекстринов, выбранных из группы, включающей α-циклодекстрин (6), β-циклодекстрин (7), γ-циклодекстрин (8), δ-циклодекстрин (9), ε-циклодекстрин (10), ζ-циклодекстрин (11), η- циклодекстрин (12) и θ-циклодекстрин (13), особенно предпочтительно α-циклодекстрин, β-циклодекстрин или γ-циклодекстрин, или прежде всего циклодекстриновое производное или смесь циклодекстриновых производных, выбранных из производных циклодекстрина, в которых одна или большее количество вплоть до всех гидроксигрупп преобразованы с образованием простого алкилового эфира, предпочтительно (низш.)алкилового эфира, такого как метиловый или этиловый эфир, а также пропиловый или бутиловый эфир, арилгидроксиалкилового эфира, такого как фенилгидрокси(низш.)алкиловый, предпочтительно фенилгидроксиэтиловый эфир, гидроксиалкилового эфира, в частности гидрокси(низш.)алкилового эфира, предпочтительно 2-гидроксиэтилового эфира, гидроксипропилового эфира, такого как 2-гидроксипропиловый эфир, или гидроксибутилового эфира, такого как 2-гидроксибутиловый эфир, карбоксиалкилового эфира, в частности карбокси(низш.)алкилового эфира, предпочтительно карбоксиметилового или карбоксиэтилового эфира, дериватизированного карбоксиалкилового эфира, в частности дериватизированного карбокси(низш.)алкилового эфира, в котором дериватизированная карбоксигруппа представляет собой аминокарбонил, моно- или ди-(низш.)алкиламинокарбонил, морфолино-, пиперидино-, пирролидино- или пиперазинокарбонил либо алкоксикарбонил, в частности (низш.)алкоксикарбонил, такой как предпочтительно (низш.) алкоксикарбонил -(низш.)алкиловый эфир, например метилоксикарбонилпропиловый эфир или этилоксикарбонилпропиловый эфир, сульфоалкилового эфира, в частности сульфо(низш.)алкилового эфира, предпочтительно сульфобутилового эфира, циклодекстрина, в котором одна или большее количество ОН-групп этерифицировано с помощью радикала формулы

-O-[Alk-O]_n-Н

где Alk обозначает алкил, предпочтительно (низш.)алкил, а n обозначает целое число от 2 до 12, предпочтительно 2-5, в частности 2 или 3, циклодекстрина, в котором одна или большее количество ОН-групп этерифицировано с помощью радикала формулы

где R' обозначает атом водорода, гидрокси, -O-(Alk-O)_z-H, -O-(Alk(-R)-O)_p-Н или -O-(Alk(-R)-O)_q-Alk-CO-Y, при этом Alk во всех случаях обозначает алкил, предпочтительно (низш.) алкил, m, n, p, q и z обозначают целое число от 1 до 12, предпочтительно 1-5, в частности 1-3, a Y обозначает OR₁ или NR₂R₃, где R₁, R₂ и R₃ независимо друг от друга обозначают атом водорода или (низш.)алкил либо R₂ и R₃ вместе с присоединенным атом азота обозначают морфолино, пиперидино, пирролидино или пиперазино, или разветвленного циклодекстрина, в котором присутствуют эфирные группы или ацетали, образованные с другими молекулами сахаров, предпочтительно глюкозил-, диглюкозил(G₂-β-циклодекстрин), мальтозил- или димальтозилциклодекстрин или N-ацетилглюкозаминил- глюкозаминил-, N-ацетилгалактозаминил- или галактозаминилциклодекстрин, или (низш)алканоила, такого как сложный ацетиловый эфир циклодекстрина.

Особенно предпочтительным является способ, в котором циклодекстрин и/или циклодекстриновое производное добавляют в культуральную среду в концентрации 0,02-10, предпочтительно 0,05-10, более предпочтительно 0,05-5, особенно предпочтительно 0,1-4, например 0,1-2% (мас./об.).

Особенно предпочтительным является способ по любому из двух предыдущих параграфов, согласно которому циклодекстриновое производное выбирают из циклодекстрина, предпочтительно β-циклодекстрина, и гидрокси(низш.)алкилциклодекстрина, предпочтительно 2-гидроксипропил-α-, -β- или -γ-циклодекстрина, либо их смеси, включающей один или несколько этих циклодекстринов, причем наиболее предпочтительным является 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин.

Изобретение также относится, в частности, к культуральной среде, которая включает циклодекстрин, циклодекстриновое производное или смесь из двух или большего количества комплексообразующих компонентов, выбранных из группы, включающей циклодекстрины и циклодекстриновые производные, особенно предпочтительно циклодекстрин или циклодекстриновое производное, указанные в третьем из предыдущих параграфе, в частности указанные во втором из предыдущих параграфе, или смеси, включающие одно или несколько из этих соединений, и которая служит для выращивания микроорганизма, который может продуцировать эпотилоны, предпочтительно эпотилон А и/или эпотилон В, предпочтительно штамма рода Sorangium, предпочтительно штамма Sorangium cellulosum, например штамма Soce90 или полученного из него мутанта, в частности штамма ВСЕ33/10.

Еще одним объектом изобретения является способ получения эпотилона А и/или В, предпочтительно в виде двух чистых соединений, в частности эпотилона В, который отличается тем, что эпотилоны разделяют, например, центрифугированием, на твердую и жидкую фазы (центрифугат), при этом приготавливают культуральную среду с целью биотехнологического получения этих соединений, как описано выше, в среду добавляют комлексообразующий компонент, который растворим в культуральной среде, в частности циклодекстрин, циклодекстриновое производное или смесь из двух либо большего количества циклодекстринов и/или циклодекстриновых производных, центрифугат смешивают со смолой, предпочтительно с полистиролом, или прогоняют через колонку, заполненную такой смолой, смолу при необходимости промывают водой, эпотилон(-ы) десорбируют из смолы с помощью полярного растворителя, предпочтительно спирта, прежде всего (низш.)алканола, такого как изопропанол, при необходимости концентрируют путем предварительного, одновременного или последующего добавления воды, добавляют органический растворитель, который не смешивается с водой, например сложный эфир, такой как этилацетат, и эпотилон(-ы) переносят в органическую фазу, например перемешиванием или смешением, органическую фазу при необходимости концентрируют, эпотилоны, полученные из органического растворителя, концентрируют с помощью молекулярного сита для соединений с низкой молекулярной массой, а затем фракции, содержащие эпотилоны, предпочтительно эпотилон А и/или В, подвергают разделению с помощью колонки с обращенной фазой, предпочтительно элюированием элюентом, содержащим нитрил, такой как ацетонитрил (или в другом варианте элюентом, содержащим спирт, такой как метанол), при этом эпотилоны А и В экстрагируются по отдельности, и при необходимости они могут быть дополнительно концентрированы с помощью перекристаллизации.

Еще одним предпочтительным объектом изобретения является способ разделения эпотилонов, прежде всего эпотилонов А и В, который отличается тем, что используют хроматографию на колонке с обращенной фазой с элюентом, содержащим (низш.)алкилцианид, причем хроматографию проводят на таком материале колонки, прежде всего на материале RP-18, который несет углеводородные цепи, такие как углеводородные цепи, содержащие 18 атомов углерода, и применяют включающий нитрил элюент, который предпочтительно представляет собой (низш.)алкилнитрил, в частности ацетонитрил, прежде всего смесь нитрил/вода, предпочтительно смесь ацетонитрил/вода, предпочтительно в соотношении нитрила и воды примерно от 1:99 до 99:1, прежде всего от 1:9 до 9:1, например от 2:8 до 7:3, в частности 3:7 или 4:6. Это разделение можно осуществлять после фильтрации через молекулярное сито или предпочтительно непосредственно с использованием остатка после адсорбции эпотилонов из культуральной среды, содержащей комплексообразующий компонент на смоле. Преимуществом разделения с помощью элюента, содержащего (низш.)алкилцианид по сравнению с использованием спиртов, таких как метанол, является более эффективное разделение эпотилонов А и В.

Изобретение предпочтительно относится к способу получения эпотилонов, который предусматривает:

а) концентрирование эпотилонов, прежде всего эпотилона А и/или В, в частности эпотилона В, в культуральной среде для биотехнологического получения этого(-их) соединений(-я), на которой выращивают микроорганизм, пригодный для такого получения, прежде всего штамм Sorangium, особенно предпочтительно штамм типа Sorangium cellulosum Soce90, или его мутант, в частности штамм, обозначенный как ВСЕ33/10, и которая содержит воду и другие обычно необходимые ингредиенты культуральных сред, причем в среду добавляют циклодекстрин или циклодекстриновое производное либо смесь из двух или большего количества этих соединений, предпочтительно один или более, более предпочтительно один, два или более циклодекстринов, выбранных из группы, включающей α-циклодекстрин (6), β-циклодекстрин (7), γ-циклодекстрин (8), δ-циклодекстрин (9), ε-циклодекстрин (10), ζ-циклодекстрин (11), η-циклодекстрин (12) и θ-циклодекстрин (13), особенно предпочтительно α-циклодекстрин, β-циклодекстрин или γ-циклодекстрин, или прежде всего циклодекстриновое производное или смесь циклодекстриновых производных, выбранных из производных циклодекстрина, в которых одна или большее количество вплоть до всех гидроксигрупп преобразованы с образованием простого алкилового эфира, предпочтительно (низш.)алкилового, такого как метиловый или этиловый эфир, а также пропиловый или бутиловый эфир, арилгидроксиалкиловог