Модуляторы ангиогенеза и проницаемости сосудов

Модуляторы ангиогенеза и проницаемости сосудов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Для данной заявки испрашивается приоритет по патентным заявкам США с регистрационными №№09/470881 подана 22 декабря 1999 г., и 09/538248 подана 29 марта 2000 г., и для обеих этих заявок испрашивается приоритет по международной патентной заявке №PCT/US 99/11780 от 28 мая 1999, в которой указаны Соединенные Штаты Америки, и для нее, в свою очередь, испрашивается приоритет по предварительной заявке США с регистрационным №60/087220, которая подана 29 мая 1998 г.

Утверждение прав правительства

Некоторые из раскрытых работ частично поддерживались грантами от NIH от имени Соединенных Штатов Америки. Следовательно, правительство Соединенных Штатов Америки может иметь определенные права в данном изобретении.

Область изобретения

В широком смысле настоящее изобретение относится к области медицины и конкретно касается способов и композиций для модуляции и ингибирования проницаемости сосудов (VP).

Предпосылки

Ангиогенез представляет собой процесс образования кровеносных сосудов в ткани, который включает рост новых развивающихся кровеносных сосудов в ткани, и также касается новообразования кровеносных сосудов. Данный процесс опосредован инфильтрацией эндотелиальных клеток и клеток гладкой мышцы. Считают, что данный процесс протекает по одному из трех путей: сосуды могут расти из ранее существующих сосудов, развитие новых сосудов может происходить из клеток-предшественников (образование и развитие сосудов) или существующие небольшие сосуды могут увеличиваться в диаметре, Blood и др., Bioch. Biophys. Acta, 1032: 89-118 (1990). Для протекания ангиогенеза эндотелиальные клетки должны сначала деградировать и пересечь основную мембрану кровеносного сосуда аналогично опухолевым клеткам при инвазии и образовании метастазов. Ангиогенез обычно отсутствует во взрослых или зрелых тканях, хотя он происходит при заживлении ран и в цикле роста желтого тела. Смотри, например, Moses и др., Science, 248: 1408-1410 (1990).

Притом, что ангиогенез является важным процессом роста новорожденного, он также важен при заживлении ран и является фактором патогенеза большого количества разнообразных клинических заболеваний, включая воспаление тканей, артриты, рост опухолей, диабетическую ретинопатию, дегенерацию пятна при новообразовании сосудов в сетчатке и подобные состояния. Данные клинические проявления, связанные с ангиогенезом, относятся к ангиогенным заболеваниям, Folkman и др., Science, 235: 442-447 (1987).

Предполагают, что ингибирование ангиогенеза будет полезной терапией для ограничения роста опухолей. Предложено ингибировать ангиогенез посредством (1) ингибирования высвобождения «ангиогенных молекул», таких как bFGF (основной фактор роста фибробластов), (2) нейтрализации ангиогенных молекул, как при использовании анти-βbFGF антител, (3) применения ингибиторов рецептора витронектина α_vβ₃ и (4) ингибирования реакции эндотелиальных клеток на ангиогенный стимул. Последняя стратегия привлекла внимание. Folkman и др., Cancer Biology, 3: 89-96 (1992) описали несколько ингибиторов реакции эндотелиальных клеток, включая ингибитор коллагеназы, ингибиторы обновления основной мембраны, ангиостатические стероиды, ингибиторы ангиогенеза - производные грибков, тромбоцитарный фактор 4, тромбоспондин, лекарства для артрита, такие как D-пеницилламин и золотой тиомалат, аналоги витамина D₃, альфа-интерферон и другие, которые можно использовать для ингибирования ангиогенеза. Дополнительную информацию о предложенных ингибиторах ангиогенеза смотри в работах Blood и др., Bioch. Biophys. Acta, 1032: 89-118 (1990), Moses и др., Science, 248: 1408-1410 (1990), Ingber и др., Lab. Invest., 59: 44-51 (1988) и патентах США №5092885, №5112946, №5192744, №5202352, №5753230 и №5766591. Однако ни один из ингибиторов ангиогенеза, описанных в представленных выше ссылках, не включает белки Src.

Ранее сообщалось, что ангиогенез зависит от взаимодействия между интегринами сосудов и белками внеклеточного матрикса, Brooks и др., Science, 264: 569-571 (1994). Кроме того, сообщалось, что программируемая гибель (апоптоз) ангиогенных клеток сосудов инициируется взаимодействием, которое должны ингибировать некоторые антагонисты сосудистого интегрина α_vβ₃, Brooks и др., Cell, 79: 1157-1164 (1994). Позднее сообщалось, что связывание металлопротеиназы-2 матрикса (ММР-2) с рецептором витронектина (α_vβ₅) можно ингибировать, используя антагонисты α_vβ₅, ингибируя тем самым ферментативную функцию протеиназы. Brooks и др., Cell, 85: 683-693 (1996). Интегрины α_v идентифицированы как важные компоненты выживания эндотелиальных клеток в ангиогенных кровеносных сосудах. Специфические антагонисты интегрина α_v блокируют пути ангиогенеза, индуцированные конкретным фактором роста. Например, ангиогенез, индуцированный сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), блокируется антагонистами интегрина α_vβ₅, тогда как ангиогенез, индуцированный основным фактором роста фибробластов (bFGF), блокируется антагонистами интегрина α_vβ₃.

Сосудистая сеть головного мозга характеризуется высоким ограничительным барьером кровь-мозг, который препятствует экстравазации малых молекул в окружающую ткань мозга. Природа барьера кровь-мозг у млекопитающих является предметом специального внимания фармакологических исследований, поскольку высокий ограничительный барьер кровь-мозг мешает многим лекарствам проходить через сосудистую сеть к тканям мозга. Настоящее изобретение включает неожиданное открытие, что VP, измеренную как просачивание крови из сосудов, можно модулировать при помощи Src или Yes. Кроме того, VP связана с ангиогенезом и другими патологиями. Воспаление, индуцированное повышенной проницаемостью сосудов, связано с отеком и опуханием.

Потребность в активности Src-тирозинкиназы для VFGF (но не bFGF)-индуцированного ангиогенеза демонстрирует на обеих моделях, эмбрионах цыплят и мышах, что между этими путями существуют значительные различия в регуляции и активации сигналов, Eliceiri и др., Molecular Cell, 4: 915-924 (1999).

Изменения проницаемости сосудов вследствие ангиогенных сигналов из опухолевых клеток дают модель для проверки путей прохождения сигнала, относящегося к раковой опухоли, однако проницаемость сосудов вследствие травмы, заболевания или другого повреждения кровеносных сосудов является основной причиной протечки сосудов и отека, связанного с поражением ткани. Например, церебрососудистые заболевания, связанные с инсультом (CVA) или другим поражением сосудов головного мозга или спинномозговых тканей, являются наиболее общей причиной неврологических нарушений и основным источником потери трудоспособности. Обычно поражение ткани головного мозга или спинного мозга в области CVA включает проницаемость сосудов и/или отек. Обычно CVA может включать поражение, вызванное ишемией головного мозга, прерыванием нормального тока крови к мозгу; церебральную недостаточность вследствие кратковременных нарушений тока крови; инфаркт вследствие эмболии или тромбоза внутри- или внечерепной артерии; кровоизлияние и артериовенозные пороки. Ишемический удар и мозговое кровоизлияние могут развиваться резко, и тяжесть заболевания обычно отражает область поражения головного мозга (смотри The Merck Manual, 16^th ed., Chp.123, 1992).

Отличные от CVA инфекции или заболевания центральной нервной системы (CNS) также могут влиять на кровеносные сосуды головного мозга и позвоночника и могут включать воспаление и отек, как, например, при бактериальном менингите, вирусном энцефалите и образовании абсцесса головного мозга (смотри The Merck Manual, 16^th ed., Chp.125, 1992). Общие болезненные состояния, такие как диабет, болезнь почек, атеросклероз и подобные, также могут ослабить кровеносные сосуды и привести к проницаемости сосудов и отеку. Таким образом, проницаемость сосудов и отек являются опасными патологиями, отличными и независимыми от рака, которые нуждаются в эффективном специфическом терапевтическом вмешательстве в сочетании с разнообразными повреждениями, травмами или болезненными состояниями.

Авторы обнаружили, что селективное ингибирование активности тирозинкиназ семейства Src снижает повреждение или травмы, связанные с повышением VP в тканях, и в результате приводит к уменьшению патологии, относящейся к проницаемости кровеносных сосудов и/или отеку.

Краткое содержание изобретения

Целью настоящего изобретения является модуляция проницаемости сосудов (VP) посредством тирозинкиназы Src, также обозначенной здесь родовым термином Src, или тирозинкиназы Yes, также обозначенной здесь родовым термином Yes, или посредством селективного ингибирования активности тирозинкиназ семейства Src.

Таким образом, один аспект данного изобретения включает фармацевтические композиции для модуляции VP в целевой ткани млекопитающего. Композиции данного изобретения включают терапевтически эффективное VP-модулирующее количество смеси белков Src и Yes типа тирозинкиназ в фармацевтически приемлемом носителе.

В композициях, которые включают активные Src и Yes белки типа киназ, ожидаемая модуляция является усилением или увеличением проницаемости кровеносных сосудов в ткани-мишени. Если требуемый белок Src представляет активную киназу, предпочтительным Src является Src-A. Другим предпочтительным активным белком Src является белок, в котором аминокислотный остаток в положении 527 белка Src представляет собой любой аминокислотный остаток за исключением тирозина, серина или треонина. Предпочтительный активный белок Yes будет обладать активностью киназы Yes дикого типа человека, такой как белок Yes-1. Другим предпочтительным активным Yes является белок, в котором сайт инактивирующего киназу фосфорилирования белка Yes мутирован для уничтожения или минимизации инактивирующего фосфорилирования, аналогично мутации аминокислотного остатка 527 Src на любой аминокислотный остаток за исключением тирозина, серина или треонина.

Если композиция включает белки Src и Yes, которые являются неактивными белками киназами, ожидаемая модуляция представляет собой ингибирование или снижение проницаемости кровеносных сосудов в тканях-мишенях. Если требуемый белок Src представляет собой неактивный белок, то предпочтительным Src является Src 251. Еще одним предпочтительным неактивным Src является Src K295M. Предпочтительный неактивный белок Yes будет обладать уменьшенной киназной активностью по сравнению с диким белком.

Еще одним аспектом заявленного изобретения является фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное VP-модулирующее количество нуклеиновой кислоты, способной экспрессировать белок Src и Yes типа тирозинкиназы при трансфекции в клетку-мишень, в подходящем фармацевтическом носителе. Экспрессируемые нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Src или Yes, могут включать сегменты нуклеиновых кислот, которые кодируют весь белок Src или Yes или его часть. При переносе в клетки-мишени данные клетки-мишени транскрибируют и транслируют последовательность нуклеиновой кислоты, осуществляя экспрессию желаемого белка.

Если модуляция является усилением или увеличением проницаемости кровеносных сосудов в ткани-мишени, Src-кодирующие нуклеиновые кислоты будут кодировать активные формы Src, и Yes-кодирующие нуклеиновые кислоты будут кодировать активные формы белков киназ Yes. Будучи перенесены в целевую клетку-хозяина, нуклеиновые кислоты будут экспрессироваться данной клеткой-хозяином. Предпочтительная Src-кодирующая нуклеиновая кислота кодирует активный белок Src-A. Другая предпочтительная Src-кодирующая нуклеиновая кислота кодирует мутированный активный Src, в котором аминокислотный остаток в положении 527 экспрессированного белка Src представляет собой любой аминокислотный остаток за исключением тирозина, серина или треонина. Предпочтительная Yes-кодирующая нуклеиновая кислота кодирует белок дикого типа или белок, модифицированный с целью уничтожения или ингибирования сайта инактивирующего фосфорилирования белка Yes, аналогично описанной мутации в положении 527 белка Src.

Если описанная модуляция представляет ингибирование или снижение проницаемости кровеносных сосудов в целевых тканях, то предпочтительная нуклеиновая кислота, кодирующая неактивный Src, кодирует белок Src 251. Еще одна предпочтительная нуклеиновая кислота, кодирующая неактивный Src, кодирует неактивный Src K295M. Предпочтительная нуклеиновая кислота, кодирующая неактивный Yes, кодирует белок, который обладает уменьшенной активностью киназы.

Предполагается, что композиции данного изобретения могут включать смесь нуклеиновых кислот, где каждая нуклеиновая кислота может включать экспрессируемый Src или Yes-ген. Кроме того, предполагается, что отдельная нуклеиновая кислота может включать и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Src, и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Yes. Для усовершенствованной модуляции ангиогенеза и VP в тканях-мишенях фармацевтические композиции данного изобретения могут включать смесь активного и неактивного белка Src типа тирозинкиназы, или белка Yes типа тирозинкиназы. Аналогично, фармацевтические композиции данного изобретения могут включать смесь нуклеиновых кислот, способных экспрессировать активный или неактивный белок Src или белок Yes типа тирозинкиназы.

Применяя различные количества первой тирозинкиназы вместе с большим количеством второй тирозинкиназы, можно согласно данному изобретению достичь усовершенствованной модуляции ангиогенеза и VP. В данном варианте, применяя по-разному экспрессируемые промоторы или другие подобные регуляторные элементы, можно согласно данному изобретению совместно вводить первый низко экспрессирующий первую тирозинкиназу ген и второй высоко экспрессирующий вторую тирозинкиназу ген. В данном варианте усиление ангиогенеза можно также достичь, поддерживая, доводя до минимума или снижая VP при использовании первого низкоэкспрессирующего активный Src гена в комбинации со вторым высокоэкспрессирующим неактивный Yes геном. Такое совместное введение можно выполнить, используя отдельные экспрессионные векторы или единую векторную конструкцию для объединенной экспрессии. Аналогично, снижение ангиогенеза можно также достичь, поддерживая, активируя или повышая VP при использовании первого низкоэкспрессирующего неактивный Src гена в комбинации со вторым высокоэкспрессирующим активный Yes геном. Кроме того, можно достичь различных степеней модуляции посредством различных перестановок высоко/низко и Src/Yes в комбинации с выбором активности промоторных элементов и индуцируемых промоторов.

Предполагается, что индивидуальные гены Src или Yes могут находиться под регулирующим контролем одинаковых или разных регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, таких как, но не ограничиваясь ими, энхансерные, репрессорные и промоторные элементы. Если два или более белков экспрессируются из единого вектора, предполагается, что регуляция и контроль транскрипции независимых белковых генов могут находиться под контролем одних и тех же регуляторных элементов. Предполагается также, что на регуляцию и контроль транскрипции могут влиять два или более независимо действующих регуляторных элементов. Регуляторные элементы известны в данной области и могут представлять собой констиционно активные или индуцируемые, энхансерные, промоторные, супрессорные или подобные последовательности нуклеиновых кислот.

Предполагается, что композиции нуклеиновых кислот данного изобретения могут включать вирусный и/или невирусный вектор переноса гена, содержащий сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий белок Src и/или Yes. Ретровирусные и невирусные векторы переноса гена и экспрессии известны в данной области и кратко описаны ниже.

Предпочтительная нуклеиновая кислота кодирует белок Src-A. Другим предпочтительным активным белком Src является тот, в котором аминокислотный остаток в положении 527 белка Src представляет собой любой аминокислотный остаток за исключением тирозина, серина или треонина.

Предполагается, что смесь белков Src и Yes и/или нуклеиновой кислоты, кодирующей такие белки, согласно настоящему изобретению может объединять активные и неактивные формы белка в зависимости от желаемого уровня модуляции и соответствующего желаемого влияния на ангиогенез и VP.

Композиция, обеспечивающая белок Src или Yes, может содержать очищенный белок, биологически активные фрагменты природного белка, рекомбинантно продуцированный белок Src или Yes, или фрагменты белка, или слитые белки, или векторы экспрессии гена/нуклеиновой кислоты для экспрессии белка Src или Yes, или их смеси.

Если белок Src или Yes инактивируют или ингибируют, модуляция представляет собой ингибирование VP. Если белок Src или Yes является активным или его активируют, то модуляция представляет активацию VP.

Настоящее изобретение включает способы обработки тканей млекопитающих композицией, включающей терапевтически эффективное VP-модулирующее количество белка Src или Yes или их комбинации. В способах данного изобретения белки Src или Yes типа тирозинкиназы или векторы экспрессии нуклеиновых кислот, способные обеспечить экспрессию такого белка, вводят в ткань, подверженную болезненному состоянию, которая реагирует на модуляцию VP.

Если желательным терапевтически эффективным VP-модулирующим действием является увеличение или активация VP, предполагают, что можно вводить активные формы белка Src и/или Yes. Аналогично, данные способы включают введение экспрессируемых нуклеиновых кислот, которые кодируют активные или неактивные формы белка Src и/или Yes, соответственно.

Подлежащая обработке ткань может быть любой тканью, в которой желательна модуляция VP. Терапевтическую обработку выполняют посредством контакта "ткани-мишени с эффективным количеством желаемой модулирующей композиции и обеспечивают достаточное время контакта белкового компонента или нуклеиновых кислот фармацевтического препарата для проникания в ткань-мишень. Для ингибирования VP полезно обработать нездоровую ткань, где происходит пагубная протечка сосудов. Примеры тканей включают воспаленную ткань, ткани, связанные с "ударом", инфарктом миокарда или другой блокировкой нормального тока крови, ткани, подверженные рестенозу, и подобные.

Что касается активации, полезно лечить пациентов с ишемическими конечностями, у которых слабое кровообращение в конечностях от диабета или других состояний, или для активации введения лекарственных препаратов в головной мозг через барьер кровь-головной мозг. Можно лечить пациентов с хроническими ранами, которые не заживают, и для которых может быть полезно повышение пролиферации клеток сосудов и новообразование кровеносных сосудов, которые модулируются VP.

Еще одним аспектом настоящего изобретения являются промышленные продукты, которые включают упаковочный материал и фармацевтическую композицию внутри указанного упаковочного материала, причем указанная фармацевтическая композиция способна модулировать проницаемость сосудов в ткани, подверженной болезненному состоянию, указанный упаковочный материал имеет этикетку, на которой указано, что данную фармацевтическую композицию можно применять для лечения болезненных состояний посредством модуляции проницаемости сосудов, и указанная фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество белка Yes типа тирозинкиназы в фармацевтически приемлемом носителе. Данный вариант включает белок Yes в активной или неактивной форме, а также нуклеиновые кислоты, кодирующие активный или неактивный белок Yes. Ретровирусные и невирусные векторы переноса/экспрессии гена могут содержать сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий белок Yes, в активной или неактивной форме, или оба. Если присутствуют обе формы гена протеинкиназы, активная и неактивная, то предполагают, что гены находятся под контролем отдельного индуцируемого промотора, допускающего, если требуется, альтернативную экспрессию.

Еще одним аспектом настоящего изобретения являются промышленные продукты, в которых фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное VP-модулирующее количество белка Src и Yes типа тирозинкиназы в фармацевтически приемлемом носителе. Там, где промышленный продукт упакован с указанием активирующего VP-модулирующего действия, Src и Yes находятся в активной форме. Предпочтительным активным Src является белок Src-A. Другим предпочтительным активным белком Src является белок, в котором аминокислотный остаток в положении 527 белка Src представляет собой любой аминокислотный остаток за исключением тирозина, серина или треонина.

Еще одним аспектом настоящего изобретения являются промышленные продукты, которые включают фармацевтическую композицию, причем указанная фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное VP-модулирующее количество неактивного белка Src и Yes типа тирозинкиназы в фармацевтически приемлемом носителе, где желаемая модуляция является инактивацией или ингибированием VP. Предпочтительным неактивным Src является белок Src 251. Другим предпочтительным неактивным белком Src является Src K295M.

Аналогично, еще одним аспектом настоящего изобретения являются промышленные продукты, в которых фармацевтическая композиция включает нуклеиновую кислоту, способную экспрессировать белок Src и Yes типа тирозинкиназы, в фармацевтически приемлемом носителе. Предпочтительная нуклеиновая кислота-компонент фармацевтической композиции данного промышленного продукта кодирует активный белок Src, при этом желаемая модуляция является увеличением или активацией VP. Еще предусмотрена нуклеиновая кислота, кодирующая активный белок Yes. Предпочтительным активным Src является белок Src-A. Другой предпочтительной нуклеиновой кислотой, кодирующей активный Src, является та, в которой аминокислотный остаток в положении 527 белка Src представляет собой любой аминокислотный остаток за исключением тирозина, серина или треонина. Предполагается также, что можно сконструировать отдельную нуклеиновую кислоту, которая обеспечит экспрессию обоих белков Src и Yes, или регулируемых независимо или под транскрибционным контролем одного и того же промотора, энхансера, супрессора, репрессора или другой подходящей регуляторной последовательности нуклеиновой кислоты.

Поражение ткани, связанное с протечкой сосудов, и/или отек вследствие пагубных изменений в проницаемости сосудов можно уменьшить при помощи ингибиторов тирозинкиназ семейства Src. С этой целью в нуждающуюся в таком лечении ткань вводят эффективное модулирующее проницаемость сосудов количество ингибиторов тирозинкиназ семейства Src. Таким образом можно уменьшить поражение ткани вследствие протечки сосудов или отека.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования увеличения проницаемости сосудов в ткани, подверженной болезненному состоянию, которое связано с протечкой сосудов и/или отеком, посредством контакта указанной ткани с терапевтически эффективным ингибирующим проницаемость сосудов количеством ингибитора тирозинкиназ семейства Src вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В предпочтительном варианте в ткань вводят специфический ингибитор тирозинкиназы Src.

Данным способом можно лечить любые патологии, которые включают вызванное травмами губительное повышение проницаемости сосудов и поражение тканей вследствие протечки сосудов или отека. Патологические случаи могут включать травмы кровеносных сосудов, такие как физическое лигирование, блокада, отделение, закупорка, травма и подобное. Другие общие патологические случаи, такие как атеросклероз, диабетическая ретинопатия, воспалительные заболевания вследствие заражения микробными агентами, артрит и подобные, также подходят для лечения способом данного изобретения.

Способы данного изобретения полезны для лечения церебрососудистого заболевания или травмы посредством уменьшения поражения ткани, вызванного увеличением протечки сосудов и/или связанным с ним отеком. В частности, способы настоящего изобретения полезны для уменьшения поражения ткани, связанного с индуцированным сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) Src-опосредованным увеличением проницаемости сосудов. Однако способы данного изобретения не ограничены VEGF-индуцированными увеличениями проницаемости сосудов, а подходят также для модуляции увеличения проницаемости сосудов, опосредованного тирозинкиназой семейства Src, в ответ на другие регуляторные сигналы.

В частности, путем ингибирования тирозинкиназы Src (также обозначенной здесь родовым термином Src) и близкородственной тирозинкиназы Yes (также обозначенной здесь родовым термином Yes) обработанные ткани можно специфически модулировать с ингибированием в них повышения проницаемости сосудов, связанного с повреждением или заболеванием.

Подходящим для целей настоящего изобретения ингибитором тирозинкиназы семейства Src является химический ингибитор, выбранный из группы, включающей РР1, РР2, PD173955, AGL1872, PD162531, радицикол R2146 и гелданамицин. Другие химические ингибиторы тирозинкиназ семейства Src также подходят для применения в способах данного изобретения.

Проницаемость сосудов в ткани можно также модулировать, вводя в ткань ингибитор тирозинкиназы семейства Src, который представляет собой белок-ингибитор, такой как неактивный белок Src, например, Src K295M или Src 251, или неактивный белок Yes, или активный белок С-концевой Src-киназы (CSK).

Для модуляции проницаемости сосудов в ткани подходит также нуклеиновая кислота, кодирующая белковый ингибитор тирозинкиназы семейства Src, такой как неактивный Src, неактивный Yes или активный белок CSK. Такие нуклеиновые кислоты-ингибиторы активности тирозинкиназ семейства Src могут включать один или более ретровирусных векторов экспрессии, невирусных векторов экспрессии или подобных. Данные нуклеиновые кислоты-ингибиторы могут содержать подходящие регуляторные сигналы, такие как промоторы или энхансеры для одного или большего количества экспрессируемых сегментов нуклеиновой кислоты на любой данной нуклеиновой кислоте.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения промышленные препараты включают упаковочный материал и фармацевтическую композицию внутри указанного упаковочного материала, причем указанная фармацевтическая композиция способна модулировать проницаемость сосудов в ткани, подверженной болезненному состоянию. Упаковочный материал имеет этикетку, на которой указано, что данную фармацевтическую композицию можно применять для лечения проницаемости сосудов или отеков, связанных с болезненными состояниями, и указанная фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество ингибитора тирозинкиназы семейства Src в фармацевтически приемлемом носителе.

Промышленный препарат данного изобретения может содержать в качестве части фармацевтической композиции ингибитор тирозинкиназы семейства Src, который является химическим ингибитором. В частности, предпочтительный химический ингибитор тирозинкиназы семейства Src выбирается из группы, включающей РР1, РР2, PD173955, AGL1872, PD162531, радицикол R2146 и гелданамицин, или соединений с аналогичной Src-ингибирующей активностью. Наиболее предпочтительным ингибитором является РР1.

Промышленный препарат данного изобретения включает также указанную фармацевтическую композицию, содержащую белковый ингибитор тирозинкиназы семейства Src, который представляет собой неактивный белок Src, такой как Src K295M или Src 251, неактивный белок Yes или активный белок CSK.

В противоположном варианте, фармацевтическая композиция включает нуклеиновую кислоту, кодирующую ингибитор тирозинкиназы семейства Src, в фармацевтически приемлемом носителе. В такой фармацевтической композиции ингибитор, который кодирует указанная нуклеиновая кислота, может быть неактивным белком Src, таким как Src K295M или Src 251, неактивным белком Yes или активным белком CSK.

Промышленные препараты могут включать одну- или более фармацевтических композиций, которые содержат терапевтические количества ингибиторов тирозинкиназ семейства Src или субтерапевтические количества более чем одного ингибитора тирозинкиназ семейства Src в фармацевтически приемлемом носителе.

Фармацевтические композиции промышленных препаратов данного изобретения могут включать смесь одного или более субтерапевтически эффективных VP-модулирующих количеств ингибитора тирозинкиназы семейства Src, которые действуют вместе, обеспечивая эффект снижения VP в обработанной ткани. Фармацевтическую композицию промышленного препарата можно изменять в зависимости от желаемого модуляторного действия, и также соответственно меняют этикетку на упаковке.

Фармацевтическую композицию промышленного препарата можно менять в зависимости от желаемого модуляторного или ингибирующего действия, и также соответственно меняют этикетку на упаковке.

Краткое описание чертежей

На чертежах, составляющих часть данного описания:

На ФИГ.1 приведена последовательность кДНК c-Src цыпленка, которая представляет полную кодирующую последовательность с удаленными интронами, как впервые было описано Takeya и др., Cell, 32: 881-890 (1983). Данная последовательность доступна от GenBank, номер доступа J00844. Последовательность содержит 1759 нуклеотидов, кодирующая белок часть начинается и заканчивается, соответственно, в положениях нуклеотидов 112 и 1713 (SEQ ID NO: 2).

На ФИГ.2 приведена последовательность аминокислотных остатков c-Src цыпленка, кодированная последовательностью, показанной на ФИГ.1 (SEQ ID NO: 3).

На ФИГ.3 приведена последовательность кДНК c-Src человека, которая впервые была описана Braeuninger и др., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 10411-10415 (1991). Данная последовательность доступна от GenBank, номер доступа Х59932 Х71157. Последовательность содержит 2187 нуклеотидов, кодирующая белок часть начинается и заканчивается, соответственно, в положениях нуклеотидов 134 и 1486 (SEQ ID NO: 4).

На ФИГ.4 приведена последовательность аминокислотных остатков c-Src человека, кодированная последовательностью, показанной на ФИГ.3 (SEQ ID NO: 5).

ФИГ.5 иллюстрирует активацию эндогенного Src посредством bFGF или VEGF, как описано в примере 4. Верхняя часть фигуры показывает результаты in vitro исследования киназы с кратной активацией эндогенного c-Src посредством bFGF или VEGF. Нижняя часть фигуры представляет блот исследования киназы с использованием в качестве зонда анти-Src антитела как контроля загрузки на эквивалентное содержание Src и IgG.

ФИГ.6 иллюстрирует влияние ретровирус-опосредованной генной экспрессии c-Src А на ангиогенез в САМ цыпленка, как описано в примере 4. САМ девятидневных цыплят подвергали воздействию ретровирусов RCAS-Src А (активный мутированный с-Src), или контрольного RCAS-GFP (зеленый флуоресцентный белок; белок-индикатор флуоресценции), или буфера в течение 72 час. Количественно определяли степень ангиогенеза, как показано на ФИГ.6А, с типичными микрофотографиями (4х) на ФИГ.6В, соответствующими каждой обработке с применением стереомикроскопа.

ФИГ.7 иллюстрирует ретровирусную экспрессию c-Src А при активации фосфорилирования сосудистой киназы MAP. На ФИГ.7А показаны экстракты тканей САМ 10-дневных цыплят, которые были подвержены действию VEGF или РМА в течение 30 минут или инфицированы ретровирусом c-Src А в течение 48 час. NT обозначает отсутствие обработки. Src подвергают иммунопреципитации из эквивалентных количеств общего белкового экстракта и проводят иммунное комплексное исследование киназы in vitro, используя слитый белок FAK-GST в качестве субстрата, проводят электрофорез и переносят на нитроцеллюлозу. Аликвоты описанных выше лизатов ткани также оценивали на фосфорилирование эндогенного ERK посредством иммуноблоттинга с анти-фосфо-ERK антителом. На ФИГ.7В показаны 10-дневные САМ, которые инфицированы либо фиктивными RCAS, либо RCAS, содержащим Src А. Через два дня САМ иссекали, криоконсервировали в ОСТ и делали срезы по 4 мкм. Проводили иммуноокрашивание срезов антителом против фосфорилированного ERK (New England Biolabs), промывали и детектировали, используя антикроличье FITS конъюгированное вторичное антитело козы. Флуоресцентные изображения, получали при помощи охлажденной CCD-камеры (Princeton Inst.).

ФИГ.8 иллюстрирует селективную потребность в Src-активности для VEGF, но не bFGF-индуцированного ангиогенеза. САМ девятидневных цыплят подвергали действию ретровирусов RCAS-Src 251 или контрольного RCAS-GFP или буфера в течение 20 часов и затем инкубировали еще 72 часа в присутствии или в отсутствие bFGF или VEGF. Степень ангиогенеза определяли количественно, как описано выше (ФИГ.8А), и при помощи стереомикроскопа получали типичные микрофотографии (6х), показанные на ФИГ.8В. На ФИГ.8С показан блот с использованием в качестве зонда анти-Src антитела для подтверждения экспрессии Src 251 в трансфецированных клетках по сравнению с фиктивными обработками.

ФИГ.9 иллюстрирует результаты ретровирусной доставки RCAS-Src 251 к опухолям человека. На ФИГ.9А представлена микрофотография, которая показывает фрагмент опухоли медуллобластомы человека, инфицированной RCAS-GFP (RCAS-зеленый флуоресцентный белок), экспрессирующим GFP исключительно в кровеносных сосудах опухоли (стрелка), как определяют по оптическим сечениям при помощи лазерного конфокального сканирующего микроскопа Bio Rad (полоса=500 мкм). На ФИГ.9В изображены данные от опухолей, обработанных путем локального нанесения ретровируса, которые оставляют расти в течение 3 или 6 дней, после чего их иссекают и определяют вес во влажном состоянии. Данные выражены как среднее изменение массы опухоли (от исходной массы опухоли 50 мг) +/- среднеквадратичное отклонение из 2 повторов. На ФИГ.9С на представленных микрофотографиях изображены опухоли медуллобластомы, хирургически удаленные из эмбрионов (полоса = 500 мкм). Нижние картинки - это изображения каждой из опухолей с большим увеличением, подробно показывающие сосудистую систему каждой опухоли (полоса = 350 мкм). Стрелка показывает разрыв кровеносного сосуда в опухолях, обработанных RCAS-Src 251.

На ФИГ.10 представлена диаграмма, иллюстрирующая карту рестрикции векторной конструкции RCASBP (RCAS) (SEQ ID NO: 1).

На ФИГ.11 изображена кодированная последовательность аминокислотных остатков белка c-Yes человека с обозначением аминокислот одной буквой (SEQ ID NO: 8).

На ФИГ.12 изображена нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая белок c-Yes человека. Данная последовательность доступна от GenBank, номер доступа М15990. Последовательность содержит 4517 нуклеотидов, кодирующая белок часть начинается и заканчивается, соответственно, в положениях нуклеотидов 208 и 1839 и транслируется в аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ.11 (SEQ ID NO: 7).

На ФИГ.13 представлены результаты ретровирусной доставки Src 251 и CSK на подкожной мышиной модели ангиогенеза. ФИГ.13А иллюстрирует результаты иммуноблоттинга по детектированию экспрессии flk. ФИГ.13В иллюстрирует результаты иммуноблоттинга из исследования flk в условиях VFGF- и bFGF-стимулирования. На ФИГ.13С представлена диаграмма, которая показывает количество CD34-положительных кровеносных сосудов (среднее значение из трех случайно выбранных областей при 20х) при обработке с VEGF- и bFGF-стимулированием в присутствии ретровируса GFP, Src 251 или CSK.

ФИГ.14 иллюстрирует результаты модифицированного исследования Майлса для VP VEGF в коже мышей с дефицитом Src, fyn и Yes. На ФИГ.14А показаны фотографии обработанных ушей. На ФИГ.14В приведены диаграммы экспериментальных результатов для стимуляции мышей с различным дефицитом. На ФИГ.14С показано количество элюированного синего красителя Эвана при обработке.

На ФИГ.15 представлена диаграмма, обозначающая относительный объем инфаркта у мышей Src +/-, Src -/-, дикого типа (WT) и дикого типа, обработанных РР1. Обработка РР1 составляла 1,5 мг/кг массы тела.

На ФИГ.16 показаны последовательные MRI-сканирования головного мозга мышей, обработанных контролем и РР1, показывающие меньший объем инфаркта головного мозга у животных, обработанных РР1 (справа), чем у контрольных животных (слева).

Подробное описание изобретения

А. Определения

Аминокислотный остаток: аминокислота, полученная путем химического расщепления (гидролиза) полипептида по его пептидным связям. Описанные здесь аминокислотные остатки предпочтительно находятся в виде "L"-изомерной формы. Однако любые L-аминокислотные остатки могут быть заменены "D"-изомерными формами до тех пор, пока полипепт